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Immunology and Infection

Un modelo de inoculación tardía de la infección crónica por la herida de Pseudomonas aeruginosa

doi: 10.3791/60599 Published: February 20, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Describimos un protocolo de inoculación retardada para generar infecciones crónicas por heridas en ratones inmunocompetentes.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) es un importante patógeno nosocomial de creciente relevancia para la salud humana y la enfermedad, particularmente en el establecimiento de infecciones crónicas de heridas en pacientes diabéticos y hospitalizados. Existe una necesidad urgente de modelos de infección crónica para ayudar en la investigación de la patogénesis de heridas y el desarrollo de nuevas terapias contra este patógeno. Aquí, describimos un protocolo que utiliza la inoculación retrasada 24 horas después de la herida escisión de espesor completo. La infección de la matriz de heridas provisionales presente en este momento es un aclaramiento rápido o la diseminación de la infección y, en su lugar, establece una infección crónica que dura de 7 a 10 días sin necesidad de implantación de materiales extraños o supresión inmunitaria. Este protocolo imita un curso temporal típico de infección postoperatoria en humanos. El uso de una cepa luminiscente de P. aeruginosa (PAO1:lux) permite una evaluación diaria cuantitativa de la carga bacteriana para las infecciones de la herida de P. aeruginosa. Este nuevo modelo puede ser una herramienta útil en la investigación de la patogénesis bacteriana y el desarrollo de nuevas terapias para infecciones crónicas de la herida de P. aeruginosa.

Introduction

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Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) es una bacteria Gram-negativa en forma de varilla con creciente relevancia para la salud humana y la enfermedad. Es responsable de la extensiva morbilidad y mortalidad en entornos nosocomiales, particularmente involucrando infecciones de heridas en pacientes inmunocomprometidos1,2. La aparición de cepas multirresistentes de este patógeno ha proporcionado un mayor impulso para la investigación de factores que contribuyen a la virulencia de P. aeruginosa, mecanismos de resistencia a los antibióticos P. aeruginosa, y nuevos métodos para la prevención y el tratamiento de esta infección mortal3. Como tal, la necesidad de modelos animales de infección crónica de heridas como herramientas para investigar estas preguntas de investigación nunca ha sido mayor.

Desafortunadamente, muchos modelos animales de infección por P. aeruginosa tienden a simular una infección aguda con rápida resolución de infección o declive rápido debido a la sepsis4,5, que no simula adecuadamente la naturaleza crónica a menudo de estas infecciones. Para hacer frente a este inconveniente, algunos modelos utilizan la implantación de cuerpos extraños como cuentas de agar, implantes de silicona, o geles de alginato6,7,8. Otros modelos utilizan ratones inmunocomprometidos debido a la edad avanzada, obesidad o diabetes, o a través de medios farmacológicos como la neutropenia inducida por ciclofosfamida9,10,11,12. Sin embargo, el uso de materiales extraños o huéspedes inmunes comprometidos probablemente altera el proceso inflamatorio local, lo que dificulta obtener una comprensión de la fisiopatología implicada en infecciones crónicas de heridas en huéspedes con sistemas inmunitarios normales.

Hemos desarrollado un modelo crónico de infección por herida de P. aeruginosa en ratones que implica una inoculación tardía con bacterias después de la herida escisión. La inoculación tardía permite experimentos que evalúan la carga bacteriana extendiéndose hasta al menos 7 días. Este modelo abre nuevas oportunidades para investigar tanto la patogénesis como los nuevos tratamientos de las infecciones crónicas de P. aeruginosa.

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Protocol

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Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Stanford.

1. Preparación y crecimiento de bacterias

  1. Llevar a cabo todo el trabajo con P. aeruginosa y animales con precauciones BSL-2 según el comité institucional de bioseguridad del investigador y las directrices del comité de uso animal. Realice todos los pasos descritos aquí con P. aeruginosa,incluida la inoculación del ratón, en un gabinete de bioseguridad.
  2. La cepa luminiscente PAO1:lux de P. aeruginosa está disponible en nuestro laboratorio bajo petición. Streak PAO1, almacenado como caldo de glicerol congelado, en el agar de lysabagenia (LB). Para la cepa luminiscente PAO1:lux, el agar LB debe contener antibióticos selectivos (100 g/ml de carbenicilina y 12,5 g/ml de kanamicina). Crecer a 37oC durante la noche en una incubadora bacteriana.
  3. Escoge una colonia aislada y crece durante la noche a 37oC en medio LB de 3 ml, pH 7,4. Para las cepas luminiscentes, el caldo debe contener 100 g/ml de carcarbenicilina. Crecer bajo condiciones aeróbicas y temblorosas.

2. Preparación del procedimiento

  1. Pida a todo el personal que realiza la cirugía que use una bata limpia/capa de laboratorio, máscara facial, red capilar y guantes.
  2. Autoclave todas las herramientas quirúrgicas, incluyendo tijeras y fórceps. Utilice una técnica aséptica para esterilizar herramientas entre animales.
  3. Limpie la mesa quirúrgica con etanol y prepare un campo quirúrgico limpio.

3. Depilación

  1. Anestetiza ratones C57BL/6J de 8–12 semanas usando 1%-3% de isoflurano. Los investigadores deben seguir las pautas del personal veterinario de su institución para la anestesia cuando se utiliza isoflurano.
    1. Comience la anestesia entregando 1%-3% de isoflurano y ajuste el caudal de oxígeno a 1,5 L/min. Coloque el ratón en la cámara de inducción.
    2. Pellizca el dedo del ratón para evaluar la profundidad de la anestesia. Cuando el ratón ya no responda a la estimulación, retírelo de la cámara de inducción y colóquelo en el banco quirúrgico con la nariz en el cono de la nariz de isoflurano.
    3. Aplique lubricante ocular en ambos ojos.
  2. Pesar el ratón para obtener un peso pre-procedimiento basal.
  3. Coloque el ratón en posición propensa. Inyectar el ratón por vía subcutánea con cloruro de sodio estéril precalentado al 0,9%, 250 ml en cada flanco para un total de 500 ml.
  4. Afiérase el área dorsal del ratón con una afeitadora eléctrica. El afeitado debe ocurrir en un lugar diferente al de la estación quirúrgica para evitar la contaminación capilar de la herida.
  5. Aplica una fina capa de loción para depilar. Deje que la loción se sente durante 20–60 s. Retire el cabello y el exceso de loción con gasa humedecida en agua tibia. Después de la depilación, proceda al procedimiento de herida sin cisional.

4. Cirugía de herida de escisión de espesor completo

  1. Inyectar buprenorfina de liberación sostenida 0,6–1 mg/kg por vía subcutánea utilizando una aguja de 25 G en el área dorsal media del ratón. La buprenorfina de liberación lenta proporciona alivio del dolor durante 48–72 h.
  2. Desinfectar el sitio quirúrgico. Limpie la superficie dorsal con un hisopo estéril de betadina. Limpie el exceso de betadina con un hisopo de alcohol estéril. Esto debe realizarse 3 veces (alternando entre betadina y alcohol), frotando moviéndose desde el centro de una manera circular hasta el borde. Deje que el área se seque al aire.
  3. Cree una cortina que rodea el sitio quirúrgico utilizando una gasa estéril o una envoltura de plástico.
  4. Estirar la piel tensa durante la mayor parte. Utilice un punzón de biopsia de piel estéril de 6 mm de diámetro para hacer una incisión inicial a través de la epidermis dorsal izquierda. Repita en la epidermis dorsal derecha.
  5. Usa fórceps para poner en la piel de la piel del centro de la zona de la herida delineada izquierda. Reutilice las capas epidérmicas y dérmicas con tijeras. Repita en el área de la herida delineada derecha para crear heridas de escisión simétricas.
  6. Lavar las heridas con 50 ml de solución salina estéril. Deje que el sitio quirúrgico y la piel circundante se sequen al aire. A continuación, cubra las heridas y el dorso con un vendaje de película transparente.
  7. Vuelva a colocar el ratón en una jaula limpia. Casa 1 animal por jaula.
  8. Coloque la jaula en una almohadilla de calentamiento y monitor hasta que el ratón se despierte.
  9. Al realizar la cirugía anterior en varios animales, utilice un esterilizador de cuentas calientes para limpiar todos los instrumentos quirúrgicos entre animales.
  10. Dejar 24 h para que los ratones se recuperen del procedimiento quirúrgico y para la formación de una matriz de herida provisional sobre las heridas antes de proceder a la inoculación con bacterias.

5. Inoculación con P. aeruginosa

  1. Diluir el cultivo de PAO1:lux durante la noche a600 o00 o 0,05 en 75 ml de medios LB que contengan 100 g/ml de carbenicilina y crezca nalentelen las bacterias hasta que el cultivo esté en fase exponencial temprana (OD600 0.3). Esto debe tomar aproximadamente 2–3 h.
  2. Diluir PAO1:lux en PBS a una concentración de (7,5 x 2,5) x 102 CFU/ml. Asegúrese de preparar el exceso de inóculo para asegurar un volumen suficiente y permitir el enchapado después del experimento. Si transporta entre instalaciones (es decir, desde el laboratorio hasta el vivario), utilice la doble contención en una caja de prueba de fugas claramente marcada como Riesgo biológico.
  3. Realizar todo el trabajo con P. aeruginosa y ratones utilizando equipos de protección personal aprobados en un gabinete de seguridad biológica (BSC) aprobado por Animal Biosafety Level 2 (ABSL-2). Los equipos reutilizables, como la báscula de pesaje, deben estar cubiertos con envoltura adhesiva para evitar la contaminación.
  4. Anestetizar usando 3% isoflurano como se describió anteriormente. Pesar el ratón y registrar el peso. Inyectar el ratón por vía subcutánea con cloruro de sodio estéril precalentado al 0,9%, 250 ml en cada flanco para un total de 500 ml.
  5. Si el apósito de película transparente del ratón ha salido de la noche a la mañana, retire cuidadosamente cualquier costra resultante y ponte un apósito nuevo.
  6. Utilice una jeringa de tapa de seguridad de 500 l de tuberculina de 27 G para inyectar 40 ml de la suspensión PAO1:lux a través del apósito de película transparente en cada herida. Se deben utilizar diferentes ratones para los controles de heridas no inoculados/PBS con el fin de evitar la contaminación cruzada desde el lado contralateral.
  7. Coloque el ratón de nuevo en su jaula en una almohadilla de calentamiento y monitor hasta que se despierte. Todos los ratones deben estar alojados individualmente en jaulas separadas para evitar la contaminación cruzada.
  8. Proporcionar pasta de suplemento nutricional alta en calorías intercalada entre pellets de alimentos en el suelo de la jaula.
  9. Utilice el inóculo restante para rayar una placa de agar LB. Contar colonias para confirmar el número de bacterias administradas.

6. Imágenes in vivo de heridas infectadas

  1. Siga los protocolos de contención BSL-2 para el transporte de ratones hacia y desde el instrumento de imágenes, incluido el uso de un contenedor secundario. Tenga cuidado de no transferir ni dejar caer ninguna ropa de cama de animales durante la transferencia del ratón a la cámara de inducción o al instrumento de imagen.
  2. Inducir la anestesia del ratón con isoflurano inhalado 1%–3% en una cámara de inducción como se describe en el paso 3.1.
  3. Una vez anestesiado el ratón, colóquelo en posición propensa en la cámara de imágenes de un sistema óptico de imágenes con la nariz en el cono de la nariz de isoflurano.
  4. Abra el programa de software.
  5. Los parámetros de adquisición variarán en función del número de animales que se den la imagen simultáneamente y la intensidad de la bioluminiscencia. Los parámetros básicos para establecer incluyen el tiempo de exposición, el binning, f/stop y el campo de visión (FOV). Nuestros ajustes de inicio predeterminados son el tiempo de exposición 30 segundos, el binning low (2), f/stop 1.2 y FOV 25. Ajuste estos ajustes según sea necesario dependiendo de las necesidades del investigador.
  6. Analizar los datos de luminiscencia utilizando un programa de imágenes (ver Tabla de materiales). La luminiscencia se representará como una imagen pseudocolor superpuesta en una fotografía en color de los ratones.
    1. Cree una región de interés (ROI) en el sitio de la herida y mida el flujo medio (fotones/segundo) detectado. Tenga en cuenta que los datos también se pueden notificar como resplandor (fotones/segundo/cm2/steradian), pero siempre y cuando la distancia de la plataforma de imágenes de la cámara permanezca constante entre imágenes, el flujo es suficiente.
    2. Mida el fondo creando un ROI en un área aleatoria en la plataforma de imágenes. Restar el número de fondo de fotones/segundo.
    3. Exporte los datos a una hoja de cálculo para su posterior análisis.
  7. Realice imágenes como se describió anteriormente tan a menudo como todos los días para realizar un seguimiento de la progresión de la infección.

7. Gestión postoperatoria

  1. Supervise a los ratones de acuerdo con las pautas establecidas por el protocolo IACUC del investigador. Monitorizamos todos los ratones diariamente durante los primeros 4 días, luego cada dos días hasta el final del experimento. Pesar los ratones una vez al día durante los primeros 4 días después de la cirugía en un BSC. Inyectar 250 éL de cloruro sódico al 0,9% por vía subcutánea en los días 1 y 2 posteriores a la infección.
  2. Compruebe si hay signos de dolor/angustia en los ratones, como la postura encorvada, el pelaje desaliñado, el letargo, la dificultad para respirar, la mueca facial y la pérdida de peso.
  3. Si los animales muestran signos de deterioro de la salud, consulte con un veterinario. Cualquier ratón que parezca mostrar signos de empeoramiento de dolor/angustia y una pérdida de peso del 20% o mayor debe ser eutanasiado.

8. Escisión de heridas

  1. Al final del experimento, sacrificar los ratones usando la inhalación de CO2, seguido de la luxación cervical. Deseche la canal de animales de acuerdo con los protocolos ABSL-2 de la institución.
  2. Exbote las camas de heridas usando tijeras estériles y fórceps en un BSC. Coloque cada lecho enrollado en PBS estéril de 1 ml en un tubo de polipropileno de 1,5 ml. Mince el tejido de la herida con tijeras. Todas las heridas deben tratarse como ASBL-2, incluso si no se consideran infectadas.
  3. Incubar sobre una coctelera a 300 rpm durante 2 h a 4oC. Vortex cada tubo durante 10 s y diluir en serie el efluente bacteriano en PBS. Placar el efluente bacteriano diluido en el agar LB para enumerar la carga bacteriana.
  4. Considere las heridas infectadas si la señal luminiscente en la herida está por encima de la luminiscencia de fondo y se detectan más bacterias en el efluente de la herida que en las heridas inoculadas con PBS como control.

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Representative Results

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Utilizando una cepa luminiscente de PAO1 con un plásmido que codifica el sistema de reportero luxABCDE (PAO1:lux), realizamos heridas escisiones en ratones, inoculamos estas heridas con P. aeruginosa planctónica 24 h más tarde, y medimos la carga bacteriana a lo largo del tiempo(Figura 1 y Figura 2). Una imagen representativa obtenida mediante un sistema óptico de imágenes demuestra que este modelo da como resultado una luminiscencia detectable(Figura 3A). La infección alcanzó su punto máximo en el día 3 después de la inoculación y persistió 7 días después de la inoculación basándose tanto en la bioluminiscencia como en los recuentos de colonias(Figura 3B–C). Usando este modelo, somos capaces de generar de forma fiable heridas que duran 7-10 ays dependiendo de la cepa de bacterias y el fondo del ratón. El cultivo de las bacterias aisladas de la herida mostró que la CFU cuantificada/herida se correlacionaba con la luminiscencia detectada(Figura 3D). Finalmente, a pesar de la infección demostrable y cuantificable de P. aeruginosa, los ratones sobrevivieron durante al menos 7 días. Aunque hubo pérdida de peso rápida inicial inmediatamente después de la infección, las inyecciones de salina y la nutrición suplementaria resultaron en la restauración del peso(Figura 3E). Finalmente, calculamos la dosis de inoculación en la que el 50% de las heridas se infectarían de forma sostenible con PAO1. El valor calculado de IC50 fue de 7,7 x 102 CFU/ml. Dosis superiores a 104 CFU/ml dieron como resultado una tasa de infección del 100%(Figura 3F). Estos resultados se adaptaron a partir de los datos publicados anteriormente13.

Figure 1
Figura 1: Esquema que representa el modelo de infección por herida de espesor completo escisión con inoculación retardada con P. aeruginosabioluminiscente. Racha PAO1:lux en el día -2. Seleccione una colonia en el día -1 y crezca durante la noche en caldo LB. Realizar cirugía de herida de escisión el día -1. El día 0, inocular con PAO1:lux inyectando en el lecho de la herida a través del apósito de película transparente. Realice imágenes de bioluminiscencia después de la inoculación. Repita las imágenes tan a menudo como todos los días del día 7–10. En el día 7–10, sacrificar animales y cosechar heridas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema de cirugía de herida sión escional. Después de la depilación y esterilización de la piel con alcohol y betadina, utilice un punzón de biopsia de 6 mm para hacer una incisión inicial a través de la epidermis del dorso izquierdo y derecho. Usa tijeras y fórceps para eliminar las capas dérmica y epidérmica. Lavar con PBS. Cubrir con un apósito transparente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La infección por la herida de P. aeruginosa se puede detectar a través de 7 días de infección. (A) Imagen representativa de un ratón infectado con PAO1:lux con superposición de bioluminiscencia en heridas por escisión. (B) Señal luminiscente que refleja la carga bacteriana de la herida. N .6 heridas. Inoculación: 105 CFU/mL PAO1. (C) Análisis de regresión lineal de la señal luminiscente in vivo y la UFC bacteriana de PAO1:lux heridas infectadas, recogidas de 4 a 7 días después de la inoculación con 105 CFU/ml para permitir una serie de cargas bacterianas. (D) Carga bacteriana en UFC/herida con el tiempo en ratones infectados con 105 UFC/ml PAO1:lux. (E) Cambio de peso (en relación con el peso antes de la cirugía de escisión de la herida en T -1) N a 4 ratones/grupo. Se representan las gráficas de caja para 5-95 percentiles. Las estadísticas son ANOVA bidireccional corregido con la comparación múltiple de Sidak. (F) Análisis de regresión no lineal de la tasa de infección de la herida utilizada para calcular el IC50 para PAO1 tres días después de la inoculación. Todos los gráficos son representativos de los experimentos n-3. Esta cifra ha sido modificada de Sweere et al. 201913. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Hemos desarrollado un nuevo modelo de infección por heridas de inoculación retardada P. aeruginosa. La estrategia de retrasar la inoculación con bacterias hasta 24 h después de la herida escisión permite la evaluación de infecciones de heridas durante un período de 1 semana. Mediante el uso de una cepa luminiscente de P. aeruginosa, es posible realizar un seguimiento de la progresión de la infección a lo largo del curso de la infección. El curso más largo de la infección en comparación con otros modelos de infección por P. aeruginosa permitirá nuevas oportunidades para estudiar las interacciones huésped-patógeno y las nuevas terapias dirigidas a las infecciones por heridas de P. aeruginosa. Por ejemplo, ya hemos utilizado este modelo para demostrar el papel del bacteriófago de Pf en la estimulación de una respuesta inmune antiviral que permite a P. aeruginosa evadir el sistema inmune huésped14.

La inclusión de 24 horas de tiempo de recuperación entre la cirugía de la herida por escisión y la inoculación bacteriana es un paso crítico en este modelo de infección de la herida. Permite a los animales recuperarse de la cirugía de la herida antes de ser infectados, lo que probablemente juega un papel en su capacidad para sobrevivir durante al menos 7 días. Además, apoya la formación de una matriz de herida provisional antes de la inoculación, que, en combinación con el apósito de película transparente, proporciona un entorno propicio para la formación de biopelículas. Realizamos una serie de experimentos exploratorios durante el desarrollo de este modelo analizando diferentes cantidades de tiempo entre la herida y la inoculación. En nuestra experiencia, la inoculación inmediata después de las heridas a menudo resulta en sepsis y la muerte. Por el contrario, la inoculación a las 48 horas y más tarde condujo a niveles inaceptables de heterogeneidad entre ratones y entre heridas en el mismo ratón. Como es evidente en la Figura 3A, todavía puede haber algún grado de heterogeneidad esperada en la carga bacteriana de heridas infectadas, incluso con la inoculación retrasada de 24 horas. Una manera de compensar esto es usar múltiples animales en cada experimento.

Un aspecto único de este protocolo es la escisión de dos heridas de forma independiente en lugar de doblar la piel por la línea media y perforar para crear dos heridas bilaterales, como se hace en algunos otros modelos de heridas. Encontramos que este método de plegado también era eficaz para producir heridas simétricas con márgenes limpios. Sin embargo, los ratones tratados de esta manera normalmente se volvieron sépticos rápidamente después de la inoculación bacteriana y murieron. Creemos que esto puede ser porque este método de plegado elimina el dérmico Panniculus carnosus - una fina capa de músculo subyacente a la piel de los ratones que no está presente en los seres humanos. Especulamos que esta barrera puede ayudar a prevenir la diseminación bacteriana.

Un componente importante de este protocolo es la depilación suficiente del sitio quirúrgico, ya que el exceso de vello podría proporcionar un nidus para la superinfección e interfiere con la adherencia del apósito de película transparente. Hemos descubierto que el afeitado además de la crema de depilación proporciona una depilación óptima con una mínima irritación de la piel, aunque lavar a fondo la crema con agua tibia sigue siendo importante.

Otro factor integral es el apoyo nutricional, la hidratación y el control del dolor durante los primeros días del curso postquirúrgico e infección. Para hacer frente a esto, administramos 500 l de cloruro de sodio subcutáneo 0,9% en el día -1 y 0, luego 250 l en los días 1 y 2. También suministramos un suplemento de gel líquido multivitamínico y calórico en el momento de la cirugía de herida siciscional. Como se muestra en la Figura 3E, estas medidas permiten una recuperación adecuada del peso para el Día 3. Con respecto a la analgesia, hemos encontrado que la liberación sostenida 0,5 mg/kg de buprenorfina dada antes de la cirugía de la herida por escisión proporciona suficiente control del dolor para 72 h, pero se pueden administrar dosis adicionales si se justifica nifura en base a los hallazgos de angustia en cualquier ratón individual.

Aunque un modelo de infección de la herida de P. aeruginosa que se extiende a 7-10 días es una ventaja significativa sobre los modelos más agudos de infección, Esto todavía puede no ser suficiente para responder a ciertas preguntas de investigación que implican infecciones más crónicas. Una razón para esta limitación es que la señal luminiscente de la cepa PAO1:lux de P. aeruginosa alcanza su punto máximo en el día 2–3(Figura 3B). Después de 7 días, la señal de luciferasa puede volverse poco fiable. Por esta razón, cuantificamos las bacterias enchapando el efluente de la herida en las placas LB y contando las UFC para confirmar la infección de cada herida al final del experimento. Otra posible desventaja de este modelo es el requisito de un sistema de imágenes in vivo, al que algunos laboratorios pueden no tener acceso. Una manera de evitar este obstáculo es utilizar cepas bacterianas de tipo salvaje no luminiscente. Esto todavía permite al investigador aprovechar este modelo de infección crónica y, como se indicó anteriormente, las bacterias UFC se pueden cuantificar al final del experimento.

Hemos descrito un modelo novedoso de inoculación tardía P. aeruginosa infección de la herida que permite experimentos que se extienden a 7-10 días. Este modelo servirá como una herramienta útil para evaluar la interacción huésped-patógeno con P. aeruginosa,así como el desarrollo de nuevas terapias. Este modelo tiene el potencial de múltiples direcciones futuras, incluyendo la adaptación para otros patógenos de heridas como Staphylococcus aureus,así como infecciones polimicrobianas incluyendo P. aeruginosa combinada con otros patógenos.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses financieros en competencia que revelar.

Acknowledgments

El vector de construcción luminiscente pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 fue un regalo amable de J. Hardy. Los esquemas se crearon con BioRender.com. Agradecemos al laboratorio de G. Gurtner por su consejo sobre el modelo de infección de heridas. También agradecemos a T. Doyle del Centro Stanford para la Innovación en In Vivo Imaging por su experiencia técnica. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, y las subvenciones de Stanford SPARK, Falk Medical Research Trust y la Cystic Fibrosis Foundation (CFF) a P.L.B. C.R.D fueron apoyados por T32AI007502. Una Beca Gabilan Stanford Graduate para Ciencia e Ingeniería y una Beca de Graduado Interdisciplinario Lubert Stryer Bio-X Stanford apoyaron a J.M.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Un modelo de inoculación tardía de la infección crónica por la herida de <em>Pseudomonas aeruginosa</em>
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Cite this Article

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).More

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

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