Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli

doi: 10.3791/60599 Published: February 20, 2020
* These authors contributed equally

Summary

İmmün yetersiz farelerde kronik yara enfeksiyonları oluşturmak için gecikmiş bir aşılama protokolünü tanımladık.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa),özellikle diyabetik ve hastanede yatan hastalarda kronik yara enfeksiyonlarının belirlenmesinde, insan sağlığı ve hastalığı ile olan alakadüzeyinin giderek artan önemli bir nosokomiyal patojenidir. Yara patogenezinin araştırılmasına ve bu patojene karşı yeni tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmak için kronik enfeksiyon modellerine acil ihtiyaç vardır. Burada, tam kalınlıkta eksizyonel yaralanmadan 24 saat sonra gecikmiş aşı kullanan bir protokol açıklıyoruz. Şu anda mevcut olan geçici yara matrisinin enfeksiyonu, enfeksiyonun hızlı bir şekilde temizlenmesini veya yayılmasını engeller ve bunun yerine yabancı maddelerin implantasyonuna veya immün baskılanmasına gerek kalmadan 7-10 gün süren kronik enfeksiyon oluşturur. Bu protokol insanlarda ameliyat sonrası enfeksiyonun tipik bir temporal seyrini taklit eder. Bir Parlak P. aeruginosa suşu kullanımı (PAO1:lux) P. aeruginosa yara enfeksiyonları için bakteriyel yükün kantitatif günlük değerlendirme sağlar. Bu yeni model bakteriyel patogenezin araştırılmasında ve kronik P. aeruginosa yara enfeksiyonları için yeni tedavilerin geliştirilmesinde yararlı bir araç olabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)insan sağlığı ve hastalığı ile artan alaka ile gram-negatif çubuk şeklinde bir bakteridir. Nosokomial ortamlarda, özellikle immünazasyonsuz hastalarda yara enfeksiyonlarını içeren geniş morbidite ve mortaliteden sorumludur1,2. Bu patojenin çoklu ilaca dirençli suşlarının ortaya çıkması P. aeruginosa virülans, P. aeruginosa antibiyotik direnci mekanizmaları ve bu ölümcül enfeksiyonun önlenmesi ve tedavisi için yeni yöntemler katkıda bulunan faktörlerin araştırılması için daha fazla ivme sağlamıştır3. Bu nedenle, bu araştırma soruları araştırmak için araç olarak kronik yara enfeksiyonu hayvan modelleri için ihtiyaç daha büyük olmamıştı.

Ne yazık ki, P. aeruginosa enfeksiyonu birçok hayvan modelleri yeterli bu enfeksiyonların oftentimes kronik doğasını taklit etmez sepsis4,5nedeniyle enfeksiyon veya hızlı düşüş hızlı çözünürlüğü ile akut enfeksiyon simüle eğilimindedir. Bu dezavantajı gidermek için, bazı modeller agar boncuk, silikon implantlar veya aljinat jeller6,7,8gibi yabancı cisimlerin implantasyonu kullanmak. Diğer modeller ileri yaş, obezite veya diyabet nedeniyle bağışıklık veya siklofosfamid kaynaklı nötropeni9,10,11,12gibi farmakolojik yollarla bağışıklık bozulan fareler kullanın. Ancak, yabancı maddelerin kullanımı ya da bağışıklık bozulmuş konaklar büyük olasılıkla yerel inflamatuar süreci değiştirir, zor aksi normal bağışıklık sistemleri ile konaklarda kronik yara enfeksiyonları dahil patofizyolojisi bir anlayış kazanmak için yapım.

Farelerde eksizyonel yarası sonrası bakterilerle gecikmiş aşılama içeren kronik bir P. aeruginosa yara enfeksiyonu modeli geliştirdik. Gecikmiş aşılama, en az 7 güne kadar uzanan bakteriyel yükü değerlendiren deneylere olanak sağlar. Bu model hem patogenezi hem de P. aeruginosa kronik enfeksiyonların yeni tedavileri için yeni fırsatlar sunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada açıklanan tüm yöntemler Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Bakterilerin hazırlanması ve büyümesi

  1. P. aeruginosa ve hayvanlarla, araştırmacının kurumsal biyogüvenlik komitesi ve hayvan kullanım komitesi yönergelerine göre BSL-2 önlemleri ile tüm çalışmaları gerçekleştirin. Burada p. aeruginosaiçeren açıklanan tüm adımları yapın , fare aşılama dahil, bir biyogüvenlik kabine.
  2. Parlak PAO1:lux P. aeruginosa suş isteği üzerine laboratuarımızdan kullanılabilir. Streak PAO1, dondurulmuş gliserol stok olarak depolanan, Lysogeny Suyu (LB) agar. Parlak PAO1:lux suşu için LB agar selektif antibiyotikler içermelidir (100 μg/mL carbenicillin ve 12.5 g/mL kanamisin). Bir bakteri kuvözde bir gecede 37 °C'de büyüyün.
  3. İzole bir koloni seçin ve 3 ml LB orta, pH 7.4 37 °C'de bir gecede büyümek. Parlak suşlar için, suyu 100 μg/mL carbenicillin içermelidir. Sallayarak, aerobik koşullar altında büyümek.

2. Prosedür hazırlığı

  1. Ameliyat yapan tüm personelin temiz bir gece elbisesi/Laboratuvar önlüğü, yüz maskesi, saç ağı ve eldiven giymesini önleyin.
  2. Makas ve forceps dahil olmak üzere tüm cerrahi aletler, otoklav. Hayvanlar arasında araçları sterilize etmek için aseptik tekniği kullanın.
  3. Cerrahi tabloyu etanol ile temizleyin ve temiz bir cerrahi alan hazırlayın.

3. Epilasyon

  1. Anestezi 8-12 haftalık C57BL/6J fareler kullanarak 1%-3% isoflurane. Müfettişler isoflurane kullanırken anestezi için kendi kurumun veteriner personel yönergeleri ne zaman takip etmelidir.
    1. %1-3 izofluran vererek anesteziye başlayın ve oksijen akış hızını 1,5 L/dk'ya ayarlayın. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin.
    2. Anestezinin derinliğini değerlendirmek için farenin parmak parmaklarını çimdikleyin. Fare artık uyarıma yanıt vermediğinde, indüksiyon odasından çıkarın ve burnu izoflurane burun konisine burun ile cerrahi tezgahüzerine yerleştirin.
    3. Her iki göze de göz yağlayıcı uygulayın.
  2. Temel işlem öncesi ağırlık elde etmek için fareyi tartın.
  3. Fareyi eğilimli bir konuma yerleştirin. Fareye önceden ısıtılmış steril %0,9 sodyum klorür, her bir kanadında toplam 500 μL için 250 μL enjekte edin.
  4. Elektrikli tıraş layıcı kullanarak farenin sırt alanını tıraş edin. Yaranın saç kontaminasyonunu önlemek için cerrahi istasyondan farklı bir yerde tıraş yapılmalıdır.
  5. Epilasyon losyonu ince bir tabaka uygulayın. Losyon 20-60 s. Sıcak suda nemlendirilmiş gazlı bez ile saç ve aşırı losyon çıkarın. Epilasyondan sonra eksizyonel yaralama işlemine devam edin.

4. Tam kalınlıkta eksizyonel yara cerrahisi

  1. Farenin orta dorsal bölgesinde 25 G iğne kullanarak 0.6-1 mg/kg deri altı serbest buprenorfin enjekte edin. Yavaş salınımlı buprenorfin 48-72 saat üzerinde ağrı kesici sağlar.
  2. Ameliyat bölgesini dezenfekte edin. Steril betadine bezi ile dorsal yüzeyi silin. Steril bir alkol bezi ile aşırı betadine silin. Bu 3 kez yapılmalıdır (betadin ve alkol arasında dönüşümlü), kenarına dairesel bir şekilde merkezinden hareket ederek swabbing. Alanın kurumasını bekleyin.
  3. Steril gazlı bez veya plastik yapışkan şal kullanarak cerrahi siteyi çevreleyen bir perde oluşturun.
  4. Streç cilt gergin caudally. Sol dorsal epidermis ile ilk kesi yapmak için steril 6-mm çapında deri biyopsisi yumruk kullanın. Sağ dorsal epidermis tekrarlayın.
  5. Sol ana hatlı yara alanının merkezinden deri çadır için forceps kullanın. Makas kullanarak epidermal ve dermal tabakaları özelleştirin. Simetrik eksizyonel yaralar oluşturmak için sağ daki yara bölgesini tekrarlayın.
  6. Yaraları 50 μL steril salin ile yıkayın. Cerrahi bölge ve çevresindeki cildin kurumasını bekleyin. Sonra, şeffaf bir film pansuman ile yaraları ve dorsum kapağı.
  7. Fareyi temiz bir kafese geri yerleştirin. Kafes başına ev 1 hayvan.
  8. Kafesi Bir ısıtma yastığına yerleştirin ve fare uyanana kadar izleyin.
  9. Birden fazla hayvan üzerinde yukarıdaki ameliyatı yaparken, hayvanlar arasındaki tüm cerrahi aletleri temizlemek için sıcak boncuk sterilizatör kullanın.
  10. Farelerin cerrahi işlemden sonra iyileşmesi ve bakterilerle aşılamaya başlamadan önce yaraların üzerinde geçici bir yara matrisi oluşması için 24 saat bekleyin.

5. P. aeruginosa ile aşılama

  1. OD600 için bir gecede PAO1:lux kültürü seyreltin = 0.05 LB medya 75 mL içinde 100 μg/mL carbenicillin içeren ve kültür erken üstel faz (OD600 』 0.3) kadar bakteri büyümek. Bu yaklaşık 2-3 saat sürer.
  2. PBS'de seyreltik PAO1:lux konsantrasyonu (7.5 ± 2.5) x 102 CFU/mL. Yeterli hacim sağlamak ve deneyden sonra kaplama için izin vermek için aşırı inokül hazırlamak için emin olun. Tesisler arasında taşıma (yani laboratuvardan vivarium'a) taşıyorsanız, Biohazard olarak açıkça işaretlenmiş bir sızıntı yalıtım kutusunda çift çevreleme kullanın.
  3. P. aeruginosa ve fareler ile tüm çalışmaları hayvan biyogüvenlik seviyesi 2 (ABSL-2) onaylı biyolojik güvenlik kabininde (BSC) onaylanmış kişisel koruyucu ekipman kullanarak gerçekleştirin. Tartım terazisi gibi yeniden kullanılabilir ekipmanlar kontaminasyonu önlemek için sargı lı sargı ile kaplanmalıdır.
  4. Yukarıda açıklandığı gibi% 3 isoflurankullanarak anestezik. Fareyi tartın ve ağırlığı kaydedin. Fareye önceden ısıtılmış steril %0,9 sodyum klorür, her bir kanadında toplam 500 μL için 250 μL enjekte edin.
  5. Farenin saydam film pansumanı bir gecede çıktıysa, ortaya çıkan yarayı dikkatlice çıkarın ve yeni bir pansuman giyin.
  6. Her yaranın içine şeffaf film pansumanı ile 40 000 ADET PAO1:lux süspansiyon enjekte etmek için 500 μL tüberkülin 27 G emniyet kapağı şırıngası kullanın. Kontralateral taraftan çapraz kontaminasyonu önlemek için aşısız/PBS yara kontrolleri için farklı fareler kullanılmalıdır.
  7. Fareyi bir ısıtma yastığının üzerine tekrar kafesine yerleştirin ve uyanana kadar izleyin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için tüm fareler ayrı kafeslere ayrı ayrı yerleştirilmelidir.
  8. Kafesin zemininde gıda peletleri arasında sıkışmış yüksek kalorili besin takviyesi hamur sağlayın.
  9. Lb agar plaka çizgi için kalan inoculum kullanın. Verilen bakteri sayısını doğrulamak için kolonileri saymak.

6. Enfekte yaraların in vivo görüntüleme

  1. Farelerin görüntüleme cihazına ve görüntüleme cihazına taşınması için ikincil bir konteyner kullanımı da dahil olmak üzere BSL-2 kapsama protokollerini uygulayın. Farenin indüksiyon odasına veya görüntüleme aletine transferi sırasında herhangi bir hayvan yatakını aktarmamaya veya düşürmemeye dikkat edin.
  2. Adım 3.1'de açıklandığı gibi indüksiyon odasında inhale %1-3 izofluran ile farenin anestezisini indükler.
  3. Fare anestezi edildikten sonra, izofluran burun konisinde burun ile optik görüntüleme sisteminin görüntüleme odasında eğilimli bir konuma yerleştirin.
  4. Yazılım programını açın.
  5. Edinme parametreleri aynı anda görüntülenilen hayvan sayısına ve biyolüminesans yoğunluğuna bağlı olarak değişir. Ayarlanan temel parametreler pozlama süresi, binning, f/stop ve görüş alanı (FOV) içerir. Varsayılan başlangıç ayarlarımız pozlama süresi 30 saniyedir, düşük (2), f/stop 1.2 ve FOV 25'tir. Bu ayarları araştırmacının ihtiyaçlarına bağlı olarak gerektiği gibi ayarlayın.
  6. Bir görüntüleme programı kullanarak parlaklık verilerini analiz edin (bkz. Malzemeler Tablosu). Luminescence farelerin renkli bir fotoğraf üzerine kaplanmış bir psödocolor görüntü olarak temsil edilecektir.
    1. Yara yerinde ilgi çekici bir bölge (ROI) oluşturun ve tespit edilen ortalama akısı (foton/saniye) ölçün. Verilerin parlaklık (foton/saniye/cm²/steradian) olarak da rapor edilebildiği, ancak görüntüleme platformunun kameradan uzaklığı görüntüleme arasında sabit kaldığı sürece akı yeterli olduğu unutulmamalıdır.
    2. Görüntüleme platformunda rasgele bir alanda bir yatırım getirisi oluşturarak arka planı ölçün. Fotonların/saniyenin arka plan numarasını çıkarın.
    3. Daha fazla analiz için verileri bir elektronik tabloya dışa aktarın.
  7. Enfeksiyon ilerlemesini izlemek için günlük olarak sık sık yukarıda açıklandığı gibi görüntüleme gerçekleştirin.

7. Postoperatif yönetim

  1. Fareleri araştırmacının IACUC protokolü tarafından belirlenen kurallara göre izleyin. İlk 4 gün boyunca tüm fareleri her gün, sonra deney sonuna kadar her gün izliyoruz. Fareleri ameliyat sonrası ilk 4 gün boyunca günde bir kez BSC'de tartın. Enfeksiyon sonrası 1 ve 2 gün lerinde 250 μL %0,9 sodyum klorür enjekte edin.
  2. Kambur duruş, pasaklı palto, uyuşukluk, nefes alma da dahil olmak üzere farelerde ağrı / sıkıntı belirtileri olup yok, yüz grimace, ve kilo kaybı.
  3. Hayvanlar da sağlığının kötüye gittiğine dair belirtiler gösteriyorsa, bir veterinere danışın. Ağrı / sıkıntı ve% 20 veya daha fazla bir kilo kaybı kötüleşen belirtileri göstermek için görünen herhangi bir fare ötenazi olmalıdır.

8. Yara eksizyonu

  1. Deneyin sonunda, CO2 inhalasyonu kullanarak fareleri kurban edin, ardından servikal çıkış. Hayvan leşini kurumun ABSL-2 protokollerine göre atın.
  2. BSC'de steril makas ve forceps kullanarak yara yataklarını özel olarak çıkar. Her yara yatağını 1 mL steril PBS'ye 1,5 mL polipropilen tüpe yerleştirin. Yara dokusunu makasla doğrama. Tüm yaralar enfekte olarak kabul edilmese bile ASBL-2 olarak tedavi edilmelidir.
  3. 4 °C'de 2 saat için 300 rpm bir shaker üzerinde kuluçka. Girdap 10 s için her tüp ve seri PBS bakteriyel atık seyreltmek. Plaka lb agar üzerinde seyreltilmiş bakteriyel atık bakteriyel yükü sayısallamak için.
  4. Yarada ki Parlak sinyal arka plan parlaklığının üzerindeyse ve yara atıklarında kontrol olarak PBS ile aşılanmış yaralardan daha fazla bakteri tespit edilirse, enfekte olmuş yaraları düşünün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

LuxABCDE muhabir sistemini (PAO1:lux) kodlayan bir plazmid ile PAO1'in parlak bir suşını kullanarak, farelerde eksizyonel yaralar uyguladık, bu yaraları planktonik P. aeruginosa 24 saat sonra aşıladık ve zaman içinde ölçülen bakteriyel yükü(Şekil 1 ve Şekil 2). Görüntüleme optik sistemi kullanılarak elde edilen temsili bir görüntü, bu modelin saptanabilir parlaklıkla sonuçverdiğini göstermektedir(Şekil 3A). Enfeksiyon 3 aşılama sonrası günde doruğa ulaştı ve hem biyolüminesans hem de koloni sayılarını temel alan 7 gün post-inoulation devam etti(Şekil 3B–C). Bu modeli kullanarak, bakterilerin suşve fare arka plan bağlı olarak 7-10 ays kalıcı yaralar üretmek edebiliyoruz. Yarada izole edilen bakterilerin kültürü, ölçülen CFU/yaranın saptanan lüminesans ile ilişkili olduğunu göstermiştir (Şekil 3D). Son olarak, kanıtlanabilir ve ölçülebilir P. aeruginosa enfeksiyonuna rağmen, fareler en az 7 gün hayatta kaldı. Enfeksiyondan hemen sonra ilk hızlı kilo kaybı olmasına rağmen, tuzlu enjeksiyonlar ve ek beslenme kilonun geri lanmasıyla sonuçlanmıştır(Şekil 3E). Son olarak, yaraların %50'sinin PAO1 ile sürdürülebilir bir şekilde enfekte olacağı aşılama dozunun hesaplandı. Hesaplanan IC50 değeri ~7.7 x 102 CFU/mL idi. 104 CFU/mL'den yüksek dozlar %100 enfeksiyon oranına yol açmıştır(Şekil 3F). Bu sonuçlar daha önce yayınlanmış verilerden uyarlanmıştır13.

Figure 1
Şekil 1: Biyolüminesans P. aeruginosaile gecikmiş inogülasyon ile eksizyonel tam kalınlıkta yara enfeksiyonu modelini gösteren şematik. Streak PAO1:lux gün -2. Gün -1 bir koloni seçin ve LB suyu gecede büyümek. Eksizyonel yara ameliyatLarını -1. 0. günde, şeffaf film pansumanı ile yara yatağına enjekte ederek PAO1:lux ile aşılama. Aşılama sonrası biyolüminesans görüntüleme yapın. 7-10 gün boyunca günlük olarak sık sık görüntüleme tekrarlayın. 7-10. günde hayvanları kurban edin ve yaralarını hasat edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Eksizyonel yara cerrahisi şeması. Epilasyon ve alkol ve betadin ile cildin sterilizasyonu sonra, sol ve sağ dorsum epidermisin yoluyla bir ilk kesi yapmak için 6 mm biyopsi yumruk kullanın. Dermal ve epidermal tabakaları kaldırmak için makas ve forceps kullanın. PBS ile yıkayın. Açık bir pansuman ile kaplayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: P. aeruginosa yara enfeksiyonu 7 günlük enfeksiyon ile saptanabilir. (A) EKSIZYonel yaralar üzerinde biyolüminesans kaplama ile PAO1:lux ile enfekte bir farenin temsili görüntü. (B) Yara nın bakteriyel yükünü yansıtan Parlak sinyal. N = 6 yara. Aşılama: 105 CFU/mL PAO1. (C) In vivo lüminesans sinyal ve PAO1 bakteriyel CFU lineer regresyon analizi:lux-enfekte yaralar, toplanan 4-7 gün post-inoulation ile 105 CFU/mL bakteriyel yükler bir dizi sağlamak için. (D) 105 CFU/mL PAO1:lux ile enfekte farelerde zaman içinde CFU/yarabakteriyel yük. (E) Ağırlık değişimi (T = -1) N = 4 fare/grup üzerinde yara eksizyonu ameliyatı öncesi kiloya göre. Tasvir 5-95 yüzdelik için boxplots vardır. İstatistikler Sidak çoklu karşılaştırma ile düzeltilmiş iki yönlü ANOVA vardır. (F) PaO1 için IC50'nin aşılanma dan sonra üç gün hesaplanmasında kullanılan yara enfeksiyonu oranının doğrusal olmayan regresyon analizi. Tüm grafikler n≥3 deneylerini temsil eder. Bu rakam Sweere ve ark. 201913'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biz yeni bir gecikmiş inoülsülasyon P. aeruginosa yara enfeksiyonu modeli geliştirdik. Eksizyoniyal yarası sonrası bakterilerle aşılamayı 24 saate kadar geciktirme stratejisi, yara enfeksiyonlarının 1 haftalık bir zaman dilimi içinde değerlendirilmesini sağlar. P. aeruginosabir Parlak suşu kullanarak , enfeksiyon ders boyunca enfeksiyon ilerlemesini izlemek mümkündür. Diğer P. aeruginosa enfeksiyon modellerine göre enfeksiyonun uzun seyri, ev sahibi-patojen etkileşimlerini ve P. aeruginosa yara enfeksiyonlarını hedefleyen yeni tedavileri incelemek için yeni fırsatlar sağlayacaktır. Örneğin, biz zaten P. aeruginosa konak bağışıklık sistemi kaçınmak için izin veren bir antiviral bağışıklık yanıtı uyarıcı Pf bakteriyofaj rolünü göstermek için bu modeli kullandık14.

Eksizyonel yara cerrahisi ile bakteriyel aşılama arasında 24 saat iyileşme süresinin dahil edilmesi bu yara enfeksiyonu modelinde kritik bir adımdır. Bu hayvanlar muhtemelen en az 7 gün boyunca hayatta kalmak için yeteneklerini bir rol oynar enfekte olmadan önce yara ameliyatı kurtarmak için izin verir. Ayrıca, aşılama dan önce geçici bir yara matrisinin oluşumunu destekler, bu da şeffaf film pansumanı ile birlikte biyofilm oluşumuna elverişli bir ortam sağlar. Bu modelin geliştirilmesi sırasında yaralama ve aşılama arasındaki farklı zaman miktarlarını araştıran bir dizi keşif deneyi gerçekleştirdik. Deneyimlerimize göre, yaradan sonra hemen aşılama genellikle sepsis ve ölümle sonuçlanır. Tam tersine, 48 saat ve daha sonraki zaman noktalarında aşılama fareler ve aynı faredeki yaralar arasında kabul edilemez heterojenlik düzeylerine yol açtı. Şekil 3A'dagörüldüğü gibi, 24 saat gecikmiş aşılamada bile enfekte yaraların bakteriyel yükünde beklenen heterojenite bir dereceye kadar olabilir. Bunu telafi etmenin bir yolu her deneyde birden fazla hayvan kullanmaktır.

Bu protokolün benzersiz bir yönü, diğer bazı yara modellerinde olduğu gibi, iki çift taraflı yara oluşturmak için ileridoğru deri katlayıp delmek yerine bağımsız olarak iki yaranın eksizyonudur. Bu katlama yönteminin temiz kenar boşlukları ile simetrik yaralar üretmek için de etkili olduğunu bulduk. Ancak, bu şekilde tedavi fareler genellikle bakteri aşılama sonra hızlı bir şekilde septik oldu ve öldü. Biz bu katlama yöntemi dermal Panniculus carnosus kaldırır çünkü bu olabilir inanıyoruz - insanlarda mevcut olmayan farelerin deri altında yatan kas ince bir tabaka. Bu bariyerin bakteriyel yayılmasını önlemeye yardımcı olabileceğini düşünüyoruz.

Bu protokolün önemli bir bileşeni cerrahi bölgeden yeterli epilasyondur, çünkü aşırı saç lar süperenfeksiyon için bir nidus sağlayabilir ve şeffaf film pansumanı ile müdahale eder. Biz epilasyon kremi ek olarak tıraş minimal cilt tahrişi ile optimum epilasyon sağlar bulduk, iyice ılık su ile krem yıkama hala önemli olmasına rağmen.

Bir diğer integral faktör de postcerrahi ve enfeksiyon kursunun ilk birkaç gününde beslenme desteği, hidrasyon ve ağrı kontrolüdür. Bunu gidermek için, 1 ve 0. Biz de eksizyonel yara cerrahisi sırasında bir multivitamin ve kalorisıvı jel takviyesi kaynağı. Şekil 3 E'degösterildiği gibi, bu önlemler 3. Analjezi ile ilgili olarak, eksizyonel yara cerrahisi öncesinde verilen 0.5 mg/kg buprenorfinin 72 saat için yeterli ağrı kontrolü sağladığını, ancak herhangi bir faredeki sıkıntı bulgularına bağlı olarak ek dozlar verilebildiği bulunmuştur.

P. aeruginosa yara enfeksiyonu 7-10 gün uzanan bir model enfeksiyon daha akut modeller üzerinde önemli bir avantaj olmasına rağmen, bu hala daha kronik enfeksiyonlar içeren bazı araştırma sorularını cevaplamak için yeterli olmayabilir. Bu sınırlamanın bir nedeni, PAO1:lux p. aeruginosa suşunun 2-3 gün içinde zirveyaptığı parlak sinyaldir(Şekil 3B). ~ 7 gün sonra luciferase sinyal güvenilmez olabilir. Bu nedenle, deney sonunda her yaranın enfeksiyonunu doğrulamak için LB plakaları üzerinde yara atıksu kaplama ve CPU sayma ile bakterileri ölçüyor. Bu modelin bir diğer olası dezavantajı, bazı laboratuvarların erişemeyebilecek bir in vivo görüntüleme sistemi gereksinimidir. Bu engeletrafında bir yolu olmayan Parlak yabani tip bakteriyel suşları kullanmaktır. Bu hala araştırmacı nın bu kronik enfeksiyon modelinden yararlanmasını sağlar ve yukarıda da belirtildiği gibi, bakteriler Cpu'lar deneyin sonunda ölçülebilir.

Biz deneyler 7-10 gün e kadar uzanan sağlayan gecikmiş inoülsülasyon P. aeruginosa yara enfeksiyonu yeni bir model tarif ettik. Bu model P. aeruginosaile konak-patojen etkileşimi değerlendirmek için yararlı bir araç olarak hizmet verecek , yanı sıra yeni tedavilerin geliştirilmesi. Bu model birden fazla gelecek yönleri için potansiyele sahiptir, Staphylococcus aureusgibi diğer yara patojenleri için adaptasyon dahil , yanı sıra p. aeruginosa diğer patojenler ile birlikte dahil olmak üzere polimikrobiyal enfeksiyonlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmek için hiçbir rakip mali çıkarları var.

Acknowledgments

pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 parlak yapı vektörj Hardy zarif bir hediye oldu. Şemalar BioRender.com ile oluşturuldu. G. Gurtner'ın laboratuvarına yara enfeksiyonu modeli hakkındaki tavsiyelerinden dolayı teşekkür ederiz. Ayrıca Stanford In Vivo Imaging Yenilik Merkezi'nden T. Doyle'a teknik uzmanlığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093 hibeleri ile desteklenmiş ve Stanford SPARK, Falk Medical Research Trust ve Kistik Fibrozis Vakfı'ndan (CFF) P.L.B. C.R.D.'ye verilen hibeler T32AI007502 tarafından desteklenmiştir. Gabilan Stanford Bilim ve Mühendislik Yüksek Lisans Bursu ve Lubert Stryer Bio-X Stanford Disiplinlerarası Yüksek Lisans Bursu J.M.S. tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17, (6), 763-771 (2009).
  2. Serra, R., et al. Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13, (5), 605-613 (2015).
  3. Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25, (10), 1353-1364 (2005).
  4. Secor, P. R., et al. Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo. Infection and Immunity. 85, (1), (2017).
  5. Rice, S. A., et al. The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage. The ISME Journal. 3, (3), 271-282 (2009).
  6. Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection. Scientific Reports. 6, 35838 (2016).
  7. van Gennip, M., et al. Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo. Infection and Immunity. 80, (8), 2601-2607 (2012).
  8. Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21, (2), 292-299 (2013).
  9. Zhao, G., et al. Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model. Wound Repair and Regeneration. 20, (3), 342-352 (2012).
  10. Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age. Journal of Immunolology. 190, (4), 1746-1757 (2013).
  11. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202, (2), 131-141 (2013).
  12. Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 89, (6), 1092-1097 (1992).
  13. Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. (2019).
  14. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363, (6434), (2019).
Kronik <em>Pseudomonas aeruginosa</em> Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).More

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter