Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Skaffe transkripsjonsdata av høy kvalitet fra kornfrø med en modifisert metode for genuttrykksprofilering

Published: May 21, 2020 doi: 10.3791/60602
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Chemistry and Biotechnology, Swinburne University of Technology, 2Department of Molecular Genetics, Heterosis Research Group, Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK), 3Grain Quality and Nutrition Center, Applied Functional Genomics Cluster, International Rice Research Institute

ERRATUM NOTICE

Summary

En metode for transkripsjonprofilering av frokostblandinger presenteres. Den mikroarraybaserte genuttrykksprofileringen starter med isolering av høykvalitet total RNA fra kornkorn og fortsetter med generering av cDNA. Etter cRNA merking og mikroarray hybridisering, anbefalinger er gitt for signaldeteksjon og kvalitetskontroll.

Abstract

Karakteriseringen av genuttrykk er avhengig av RNA-kvalitet. Ved spirende, utviklende og modne kornfrø blir ekstraksjonen av høykvalitets RNA ofte hindret av høy stivelse og sukkerinnhold. Disse forbindelsene kan redusere både utbyttet og kvaliteten på den ekstraherte totale RNA. Forverringen i kvantitet og kvalitet på total RNA kan senere ha en betydelig innvirkning på nedstrøms transkripsjonsanalyser, som kanskje ikke nøyaktig gjenspeiler den romlige og/eller temporale variasjonen i genuttrykksprofilen til prøvene som testes. I denne protokollen beskriver vi en optimalisert metode for utvinning av total RNA med tilstrekkelig mengde og kvalitet som skal brukes til hele transkripsjonsanalyse av kornkorn. Den beskrevne metoden er egnet for flere nedstrøms applikasjoner som brukes til transkripsjonavvedisk profilering av utvikling, spiring og modne kornfrø. Metoden for transkripsjonprofilering ved hjelp av en mikroarrayplattform vises. Denne metoden er spesielt utviklet for genuttrykkprofilering av korn med beskrevne genomsekvenser. Den detaljerte prosedyren fra mikroarrayhåndtering til endelig kvalitetskontroll er beskrevet. Dette inkluderer cDNA-syntese, cRNA-merking, mikroarray hybridisering, lysbildeskanning, funksjonsutvinning og validering av datakvalitet. Dataene som genereres av denne metoden kan brukes til å karakterisere transkripsjonen av korn under spiring, i ulike stadier av kornutvikling, eller ved forskjellige biotiske eller abiotiske stressforhold. Resultatene som presenteres her eksemplifiserer transkripsjonsdata av høy kvalitet som er egnet for nedstrøms bioinformatikkanalyser, for eksempel fastsettelse av differensialt uttrykte gener (DEGs), karakterisering av genregulatoriske nettverk og gjennomføring av transkripsjonsomfattende foreningsstudie (TWAS).

Introduction

Transkripsjonen representerer hele settet med ribonucleic acid (RNA) transkripsjoner uttrykt av genomet til en organisme på et gitt tidspunkt og spesielt miljø- og vekstforhold. Hver celle har sin individuelle transkripsjon, som gjenspeiler sin nåværende fysiologiske og metabolske tilstand. En samling av celler avledet fra et lignende vev eller organ brukes i en typisk transkripsjonsstudie, men encellede og romlig løste transkripsjonomikk blir populære1. Transkripsjonomiske analyser starter med utvinning av den totale RNA fra et valgt vev på et bestemt tidspunkt, og i definerte vekstforhold. Til dette formål anbefaler vi bruk av en nyutviklet metode for utvinning av total RNA fra prøver med høyt stivelse eller sukkerinnhold, for eksempel kornfrø2. Sammenligningen av transkripsjoner mellom ulike prøver resulterer i identifisering av RNA molekyler med forskjellig overflod. Disse RNA molekylene anses som differensialt uttrykte gener (DEGs). Overflod av transkripsjoner avledet fra spesifikke markørgener kan deretter brukes til å estimere utviklingsstatusen eller bestemme responsen fra en organisme på miljøsvingninger. Gener uten påviselige endringer i transkripsjonsoverflod på tvers av utviklingstidspunktene under studien brukes ofte som referanse- eller rengjøringsgener.

RNA oppdages vanligvis og kvantifiseres av ulike metoder, for eksempel nordlig blotting og kvantitativ omvendt transkripsjonase polymerase kjedereaksjon (qRT-PCR), men dagens høygjennomstrømningtranskripsjonsmetoder er avhengige av nukleinsyrehybridisering ved hjelp av mikroarrayteknologi samt RNA-sekvensering (RNA-Seq). RNA-Seq er veldig populært i dag fordi det gir flere fordeler for høy gjennomstrømning transkripsjonomiske applikasjoner som gjennomgått andre steder3,4. Selv om genuttrykkprofilering ved hjelp av mikroarraychips fortsatt er mye brukt fordi det er en mer etablert teknologi, noe som krever mindre bakgrunn i bioinformatikk. Sammenlignet med RNA-Seq er datasettene som genereres fra mikroarrayeksperimenter, mindre og enklere å analysere. I tillegg er det mer kostnadseffektivt, spesielt hvis du arbeider med store utvalgstall. I vårt laboratorium bruker vi rutinemessig transkripsjonsanalyser ved hjelp av mikroarray-teknologien for å bestemme rollen til sentrale regulatoriske knutepunkter som styrer molekylære nettverk og veier som er involvert i vekst, utvikling og metabolisme av kornkorn5,,6,7,8,9. Vi bruker den også rutinemessig til å gjennomføre genomomfattende genuttrykkprofileringsstudier for å oppnå en mekanistisk forståelse av responsen fra kornkorn til abiotiske påkjenninger10, samt i gjennomføringen av transkripsjonsomfattende assosiasjon (TWAS) og linkage kartleggingsstudier for å identifisere gener som er ansvarlige for kornkornkvalitet og ernæring11,12. Andre grupper har også brukt mikroarrayteknologien til å tilby utviklingsspesifikke genuttrykksatlas i bygg13,ris14,,15,,16,sorghum17og hvete18.

Formålet med denne publikasjonen er å gi et kort tekstlig sammendrag og en detaljert visuell beskrivelse av metoden vi for tiden bruker i vårt laboratorium for transkripsjonavkornved hjelp av en Agilent mikroarrayplattform. Vær oppmerksom på at andre mikroarray plattformer er tilgjengelige, men vil ikke bli dekket i denne metoden. Vi begynner protokollen ved å presentere en detaljert beskrivelse av RNA-ekstraksjon fra å utvikle eller spire kornfrø. Basert på vår erfaring er det ofte flaskehalsen som får en høy kvalitet og høy mengde transkripsjonom som er egnet til nedstrøms transkripsjonsanalyser, ofte flaskehalsen ved bruk av kornfrøvev. Vi har prøvd flere kommersielt tilgjengelige RNA-ekstraksjonssett, men ingen har gitt tilfredsstillende resultater. Derfor utviklet vi en kjemisk ekstraksjonsprotokoll for å oppnå et grovt RNA-ekstrakt som deretter blir utsatt for kolonnerensing ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett. Ved hjelp av denne metoden, vi rutinemessig og reproduserbart få høy kvalitet RNA2 (Figur 1), som kan brukes til ulike nedstrøms applikasjoner for å generere en transkripsjonsprofil.

Protocol

1. Total RNA-ekstraksjon og rensing

MERK: Arbeid alltid under røykhetten, da denne metoden innebærer bruk av skadelige flyktige organiske løsemidler. Forvarm et mikrofugerør av nukleoskfritt vann i 50 °C varmeblokk før eksperimentet vedbegynnes. Dette nukleoløst vann vil bli brukt til å elutere den totale RNA fra spin kolonne i trinn 1.8.

  1. Skjær prøvene, hver med minst tre biologiske replikater, til et fint pulver ved hjelp av en sterilisert mørtel og pestle som er forkjølt i flytende nitrogen.
    1. Øse de pulveriserte prøvene ved hjelp av en liten metallslikkepott dyppet i flytende nitrogen og plasser de pulveriserte prøvene i 2,0 ml nukleogassfrie mikrofugerør, også fordyppet i flytende nitrogen. Oppbevar prøvene umiddelbart i ultralav temperatur fryser (-80 °C) til dagen som er tildelt for batch RNA ekstraksjon (STOP POINT).
      MERK: Frøprøver kan males i fint pulver med eller uten dehusking. For ris sliper vi rutinemessig prøvene uten å avhusking fordi skallet inneholder silika som kan hjelpe under slipingsprosessen.
      FORSIKTIG: Dette trinnet må gjøres raskt og under strengt kryogene forhold. Et alternativ for automatisering er å male prøvene ved hjelp av en kryogen kulemølle for å minimere RNA-nedbrytning og kvalitetsforringelse.
  2. Få et grovt RNA-ekstrakt med ca. 200 mg av den originale pulveriserte prøven. Legg hver prøve individuelt til et nukleoskfritt mikrofugerør som inneholder 750 μL RNA Extraction Buffer (100 mM Tris, pH 8.0, 150 mM LiCl, 50 mM EDTA, 1,5 % SDS, 1,5 % 2-merkaptoetanol) og 500 μL fenol:kloroform:isoamyl (25:24:1).
    1. Bland alle prøvene samtidig i 5 min ved romtemperatur ved hjelp av en multi-tube vortex mikser satt i høy hastighet. Oppbevar umiddelbart alle rørene på isi to min.
      FORSIKTIG: Arbeid alltid inne i røykhetten, spesielt for alle trinn som involverer fenol, kloroform og andre organiske løsemidler. Ideelt sett kan du bruke en bred røykhette som kan romme en benkeplate sentrifuge, vortexmikser, multi-tube vortex mikser og multi-tube roterende mikser.
  3. Skill rå RNA ekstrakt fra rusk ved sentrifugering på 14.000 x g i 10 min. Gjør alle sentrifugeringstrinnene i de samme innstillingene for denne delen.
    1. Overfør ca. 800 μL supernatant til et nytt 2,0 ml mikrofugerør som inneholder 400 μL av 1,2 M NaCl og 700 μL isopropanol. Bland oppløsningen forsiktig ved å inversjon 5x.
    2. Utfell RNA ved å inkubere i en vanlig (-20 °C) eller ultralav temperatur fryser (-80 °C), i minst 1 t (eller over natten).
      STOPP eller PAUSE punkt: bare hold prøvene i vanlig -20 °C fryser en pause i noen timer. For overnatting eller lengre stopppunkt, oppbevar prøvene i ultralav temperatur fryser (-80 °C).
  4. Få en rå RNA pellet ved sentrifugering på 18 800 x g i 15 min. Etter å ha kastet supernatanten, renser den rå RNA-pelleten ved kolonnerensing ved hjelp av et minisett (Materialtabell).
    1. Oppløs pelleten i nylaget 450 μL RLT Buffer (før bruk, tilsett 100 μL β-merkaptoetanol per 100 ml RLT-buffer, tilberedt frisk daglig). Forbedre oppløsningen av alle pellets ved å blande alle rør ved romtemperatur i en multi-tube vortex mikser i minst 5 min.
  5. Rense den oppløste RNA-pelleten ved å passere gjennom den lilla minispin-kolonnen med et 2 ml samlingsrør. Sentrifuge ved romtemperatur i 1 min ved 9000 x g og kast den lilla minispin-kolonnen.
    1. Tilsett 0,5 volum av absolutt etanol (~225 μL) til det ryddet lysatet i 2 ml oppsamlingsrør. Bland løsningen ved hjelp av samme plastspiss ved å pipe opp og ned et par ganger.
  6. Samle renset RNA ved umiddelbart å overføre løsningen til en rosa mini spin kolonne med en 2 ml samling tube. Sentrifuge på 9000 x gr for 15 s å samle RNA på silikamembranen i den rosa min spin-kolonnen. Kast gjennomstrømningen og vask RNA med 350 μL buffer RW1 ved sentrifugering ved 9000 x g i 15 s.
  7. Fjern forurensende genomisk DNA ved å tilsette 80 μL fortynnet DNase 1 (50 μL frossen DNase lager + 350 μL RDD ved hjelp av DNase-settet) direkte på membranen og fordøye ved å ruge ved romtemperatur i minst 15 min (PAUSE PUNKT).
    1. Vask av DNase 1 ved å legge til 350 μL RW1 og spinne ned på 9000 x g i 15 s. Gjenta to ganger, men denne gangen vaske med 500 μL buffer RPE. Overfør til et nytt 2 ml oppsamlingsrør og snurre på 9000 x gr i 2 min for å tørke.
  8. Overfør den tørkede spinnkolonnen til et nytt 1,5 ml nukleoasefritt samlingsrør. Start elutionprosessen for det rensede RNA-ekstraktet ved å tilsette 50 μL kjernefritt vann (førvarmet ved 50 °C) og rugier i 3 min ved 50 °C varmeblokk.
    1. Etter inkubasjon, elute den totale RNA ekstrakt ved sentrifuging på 9000 x g i 1 min. Plasser umiddelbart alle prøver på is.
  9. Bestem mengden og kvaliteten på det totale RNA-ekstraktet ved å kjøre passende fortynninger (vanligvis 1:10) i Nanodrop og BioAnalyzer ved hjelp av sine respektive produsentprotokoller. RNA ekstrakter bør i det minste ha en RIN-verdi på 8,0 og en konsentrasjon på 50 ng/μL. Figur 1 viser et typisk resultat for RNA-ekstrakter hentet fra byggblad og frø.
    STOPPPUNKT: Oppbevar prøvene i -80 °C til bruk.

2. cDNA-syntese etterfulgt av cRNA-transkripsjon og merking

MERK: Dette trinnet er egnet for behandling av 24 prøver samtidig. Det foreslås at hele trinnet utføres kontinuerlig på én dag, men valgfrie stopp- og pausepunkter identifiseres. Pass på at du forvarm tre mikrofugerørvarmeblokker ved 80 °C, 65 °C og 37 °C før trinnene nedenfor er i gang. Disse temperaturinnstillingene endres som nevnt i trinnene nedenfor. For eksempel vil 37 °C varmeblokken bli satt til 40 °C etter at Spike Mix er klargjort (eller hvis den allerede er klargjort). Forbered spikemix med én farge, T7 Promoter Mix og cDNA-hovedmiks ved hjelp av merket sett med hurtiginndata hurtiginndata skrinover (se materialtabellen)basert på produsentens instruksjoner. Dette preparatet er avhengig av mengden av startRNA ekstrakter, som vanligvis varierer fra 10 til 200 ng for total RNA eller 5 ng for PolyA RNA. Vi bruker rutinemessig 50 ng totalt RNA som startmateriale for mikroarray hybridisering2 og for metoden som vil bli beskrevet nedenfor. Når du forbereder en hovedmiks for 24 prøver, legger du til 2 ekstra reaksjoner for å ta hensyn til pipetteringsvariasjoner. Bruk alltid nukleoskefrie mikrofugerør og nukleoskefritt vann i dette trinnet.

  1. På grunn av høy avkastning fortynner vanligvis RNA-ekstraktet 100 ganger for å passe innenfor 50-100 ng-området. Basert på RNA-kvantifiseringsresultatene i trinn 1.9, lag en 1:100 fortynning ved å tilsette 1 μL renset RNA ekstrakt til 99 μL nkjernevann i et 1,5 ml mikrofugerør. Bestem den faktiske konsentrasjonen av denne fortynningen ved hjelp av en Nanodrop.
    1. Lag en ny fortynning av hver totale RNA-prøve i 1,5 ml mikrofugerør for å lage 50 ng av total RNA i et endelig volum på 1,5 μL. Hold alle prøver på is.
  2. Klargjør Spike Mix fra basert på produsentens instruksjoner. Dette trinnet er også oppsummert i Püffeld et al. 20192. Bruk en 37 °C varmeblokk for dette. Oppbevar den første og andre fortynningen av enfarges piggblandingspositive kontroller i en ultralav temperaturfryser (-80 °C) og bare gå gjennom åtte gjentatte fryse-/tinesykluser.
    1. Forbered den tredje og fjerde fortynningen frisk daglig. Tin og oppbevar den tredje og fjerde fortynningen av piggblandingen på is før bruk.
      MERK: Konverter temperaturen på 37 °C varmeblokken til 40 °C når spikeblandingen var klargjort (eller hvis den tidligere var klargjort).
  3. Forbered T7 Promoter Mix og oppbevar på is før bruk. Følgende er tilstrekkelig for 24 prøver:
    20,8 μL T7 promoter primer
    + 26,0 μL nukleoasefritt vann
    = 46,8 μL totalt volum T7 Promoter Mix
  4. Tilsett 1,8 μL T7 Promoter Primer Mix (trinn 2.3) i hvert mikrofugerør som inneholder 1,5 μL 50 ng RNA-prøve fra trinn 2.1. Bland komponentene riktig ved å pipe terting flere ganger. Denature RNA mal-primer blanding ved å inkubere i 65 °C varmeblokk i 10 min. Plasser umiddelbart mikrofugerørene på is som forberedelse til neste trinn.
  5. Under avsalting av malprimerblandingen (trinn 2.4), varm 5x First Strand Buffer ved 80 °C i minst 4 min. Klargjør raskt cDNA-syntesen Master Mix fra Low Input Quick Amp Labelling Kit (se Materialbord) basert på produsentens instruksjoner. Følgende er tilstrekkelig for 24 reaksjoner:
    52,0 μL av prevarmet 5x første strandbuffer (trinn 2.5)
    + 26,0 μL av 0,1 M DTT
    + 13,0 μL av 10 mM dNTP-blanding
    + 31,2 μL RNase Block Mix
    = 122,2 μL av total volum cDNA syntese Master Mix
    1. Tin hver komponent på is. Bland hver komponent ved å røre forsiktig. Oppbevar Master Mix ved romtemperatur før bruk.
      FORSIKTIG: RNase-blokkblandingen skal umiddelbart plasseres tilbake i fryseren -20 °C etter bruk.
  6. Fjern RNA-malprimerblandingen på is (trinn 2.4) og sentrifuge kort ved romtemperatur for å spinne ned alt innholdet til bunnen av mikrofugerøret. Dispenser 4,7 μL av cDNA Master Mix (Trinn 2.5) til hvert rør, bland forsiktig ved å pipe opp og ned. Det totale volumet når alle komponentene tilsettes, skal være 8,0 μL.
    1. Syntetiser cDNA for 2 timer i 40 °C varmeblokk. Under 2 h inkubasjon, skift temperaturen på 65 °C varmeblokken til 70 °C som forberedelse til varmeinaktivering (trinn 2.7).
      VALGFRITT PAUSEPUNKT: Oppbevar prøvene ved -80 °C over natten. Eksperimentet kan fortsette neste dag etter varmeinaktivering (trinn 2.7).
  7. Inkuber hvert rør i 70 °C varmeblokk i 15 minutter for å varme inaktivere RNase Block Mix. Overfør rørene på is umiddelbart og inkuber i minst 5 min.
  8. Mens prøvene er på is i 5 min (Trinn 2.7), raskt forberede Transkripsjon Master Mix. Alle komponenter kan kombineres ved romtemperatur, men tine komponenter på is. Følgende er tilstrekkelig for 24 prøver:
    19,5 μL nukleoasefritt vann
    + 83,2 μL 5x transkripsjonsbuffer
    + 15,6 μL av 0,1 M DTT
    + 26,0 μL NTP-blanding
    + 5,5 μL Av T7 RNA Polymerase Blanding
    + 6,2 μL cyanine 3-CTP (Cy3)
    = 156,0 μL av total volum Transkripsjon Master Mix
    FORSIKTIG: T7 RNA Polymerase Blend skal oppbevares i fryseren -20 °C og plasseres umiddelbart etter bruk. Videre er Cy3 lysfølsom. Derfor bør blanding (trinn 2.9) og dispensering (trinn 2.10) gjøres under svake lysforhold. For dette slår vi vanligvis av lys rett over laboratoriebenken.
  9. Etter hvert som rørene ble utsatt for brå oppvarming og kjøling (trinn 2.7), snurrer kort ned innholdet i hver prøve ved hjelp av en mikrocentrifuge for å samle all væsken nederst på hvert mikrofugerør. Tilsett 6 μL transkripsjon Master Mix (Trinn 2.8) ved å forsiktig pipetting opp og ned. Det totale volumet av denne reaksjonen skal være 16 μL på dette stadiet. Inkuber rørene ved 40 °C i 2 timer for å generere cy3-merket cRNA.
    VALGFRITT STOPPPUNKT: Rørene kan oppbevares ved -80 °C etter transkripsjon.
  10. Når du genererer cRNA (trinn 2.9), setter du temperaturen på varmeblokken til 55 °C. Tilsett minst ett mikrofugerør av nukleoskefritt vann i varmeblokken. Dette nukleoskfritt vann vil bli brukt til elution av renset cRNA.
  11. Etter cRNA transkripsjon og merking, rense merket cRNA ved hjelp av en RNeasy Mini Kit som beskrevet i trinn 3.

3. cRNA rensing

  1. Rens merket cRNA ved hjelp av et RNeasy Mini Kit (se Materialtabellen). Klargjør bufferne basert på produsentens instruksjoner. Buffer RPE leveres for eksempel i settet i konsentrert form. Før bruk, tilsett 4 volumer av molekylærbiologi klasse absolutt etanol (96-100%).
  2. Tilsett 84 μL nukleolittfritt vann til hver prøve for å justere det totale volumet til 100 μL. Tilsett deretter 350 μL buffer RLT og 250 μL absolutt etanol til hvert rør. Bland grundig ved pipettering.
  3. Overfør 700 μL av hver blanding på en minispin-kolonne med et 2 ml oppsamlingsrør. Samle den merkede cRNA på membranen ved sentrifugering ved 4 °C i 30 s ved 7534 x g. Kast gjennomstrømningsvæsken.
  4. Vask hver prøve i 500 μL buffer RPE. Sentrifuge og kast gjennomstrømningen som i forrige trinn. Gjenta dette trinnet én gang, og gå deretter til neste trinn.
  5. Overfør mini spin-kolonnen til et nytt samlingsrør. Tørk prøvene ved sentrifugering som i trinn 3.3.
  6. Overfør minispin-kolonnen til et nukleoasefritt 1,5 ml mikrofugerør som følger med settet. Elute hver merket cRNA prøve ved å legge til 30 μL n nuclease-fritt vann (pre-varmet ved 55 °C) direkte inn i membranfilteret. Forbedre elution ved å inkubere i 55 °C varmeblokk i 60 s.
  7. Samle den merkede cRNA ved sentrifugering ved romtemperatur i 30 s på 7535 x g. Kast spin-kolonnen og lukk hvert mikrofugerør. Plasser umiddelbart hvert rør på is.
    VALGFRITT STOPPPUNKT: Prøvene kan oppbevares ved -80 °C etter elution.
  8. Kvantifiser cRNA med Nanodrop ved hjelp av mikroarray-funksjonen. Sett prøven til RNA-40. Få følgende verdier og ta opp i et regneark: cyanine 3 farskonsentrasjon (pmol/μL), RNA-absorbansratio (260 nm/280 nm) og cRNA-konsentrasjon (ng/μL).
    STOPPPUNKT: Oppbevar cRNA-prøvene umiddelbart ved -80 °C etter avlesning.
  9. Beregn cRNA-utbyttet og den spesifikke aktiviteten som beskrevet i Püffeld et al. 20192.

4. Mikroarray hybridisering og skanning

MERK: Dette trinnet tar bare 3-4 timer og dermed hybridisering av 24 prøver kan startes etter lunsj. Én operatør kan komfortabelt kjøre opptil 4 lysbilder (32 eksempler). Morgenen neste dag er allokert til vasking og skanning av mikroarraylysbilder. Ytterligere løp kan deretter utføres på ettermiddagen av den andre dagen. Dette trinnet gjentas til alle prøvene er hybridisert og skannet. Det anbefales sterkt å bruke fargefrie, pulverfrie latekshansker for håndtering og behandling av lysbildene for å sikre at prøvene ikke er forurenset med fargede pigmenter som kan forstyrre mikroarrayanalysene. Bortsett fra kommersielt tilgjengelige mikroarrayer, er følgende tilpassede arrayer designet av vår gruppe og tilgjengelig for bestilling fra Agilent: Order Code 028827 for Bygg (Hordeumvulgare), 054269 for Rice (Oryzasativa subs. Japonica), 054270 for Rice (Oryzasativa subs. Indica) og 048923 for Hvete (Triticumaestivum).

  1. Utfør mikroarrayhybridisering ved hjelp av Gene Expression Hybridization Kit (se Materialliste). Forbered 10x BlokkeringSmiddel i henhold til produsentens spesifikasjon2. Aliquot 10x Blokkerende Middel i 200 μL porsjoner og lagre ved -20 °C til bruk. Hver aliquot er nok for opptil 40 hybridiseringer og er stabil opptil 2 måneder.
  2. På dagen tildelt for microarray hybridisering, tine en 200 μL aliquot av 10x Blokkering Agent på is. I tillegg forvarm hybridiseringsovnen til 65 °C og forvarm en varmeblokk til 60 °C for bruk under cRNA-fragmentering.
  3. Klargjør fragmenteringsblandingen for hver prøve som beskrevet av produsenten2. I laboratoriet vårt bruker vi rutinemessig 600 ng av lineært forsterket Cy3-merket cRNA for hybridisering i en 8-paknings mikroarray. I dette tilfellet oppsummerer listen nedenfor komponentene i fragmenteringsblandingen per prøve:
    600 ng av lineært forsterket cRNA, cyanine 3-merket
    + 5 μL av 10x blokkerende middel
    Juster volumet til 24 μL med nukleoskefritt vann
    + 1 μL av 25x fragmenteringbuffer
    = 25 μL total volum Fragmentering Mix
    1. Bland prøver forsiktig ved hjelp av en vortexmikser. Spinn alle prøver kort ved hjelp av en mikrocentrifuge.
  4. Inkuber alle prøvene i 60 °C varmeblokken i nøyaktig 30 min. Avkjøl hvert rør umiddelbart på is i ett minutt og fortsett deretter raskt til neste trinn.
  5. Hvis du vil stoppe fragmenteringsreaksjonen fullstendig, legger du til 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM i hvert rør. Bland forsiktig ved pipettering opp og ned, og pass på at du ikke introduserer noen bobler under blanding. Vi bruker rutinemessig 25 μL hybridiseringsbuffer for å stoppe fragmenteringsreaksjonen for 8-paknings mikroarray-formatet.
  6. Sentrifuge alle rør i 1 min ved 15 750 x g i omgivelsesromtemperatur. Legg raskt alle rørpå is og last hver prøve så fort som mulig.
  7. Før du forlater laboratoriet for 17 h over natten inkubasjon, forberede hybridisering montering2 som beskrevet i videoen.
    1. KRITISK TRINN: Overfør hver hybridiseringsblanding og dispenser sakte i midten av hver pakningsbrønn, og observerer stor forsiktighet for ikke å introdusere noen bobler under dispensering. Vi bruker rutinemessig 44 μL hybridiseringsblanding for 8-paknings mikroarray-formatet. Plasser også 44 μL av 1x hybridiseringsbuffer i eventuelle ubrukte brønner.
    2. Sett umiddelbart mikroarraylysbildet med riktig retning på toppen av pakningssklien. Dette må gjøres veldig nøye for ikke å søle væske. Lukk hybridiseringsenheten tett og roter den for å kontrollere om det ikke er innført permanente luftbobler. Alle bobler skal bevege seg innenfor pakningssklien.
  8. Sett hybridiseringskammeret i hybridiseringsovnenrotator. Hvis du bruker 2x GEx Hybridiseringsbufferen, setter du rotasjonshastigheten til 22 rpm og hybridiserer ved 65 °C i nøyaktig 17 timer.
  9. Vask hybridiserte mikroarrayer ved hjelp av Genexpression Wash Buffer Kit (se Materialtabellen). Klargjør Genexpression Wash Buffers 1 og 2 basert på produsentens instruksjoner2. Tilsett 2 ml 10 % Triton X-102 til begge bufferne (rent valgfritt, men sterkt anbefalt for å redusere forekomsten av mikroarrayvaskeartefakter)2.
  10. Forbered tre servantsamlinger som beskrevet i forrige publikasjon2. Detaljer om hvert vaskekammer er tabulert nedenfor (Tabell 1).
  11. Aliquot 500 ml vaskebuffer 1 i en 1 l reagensflaske og la ved omgivelsesromtemperatur. Forbered en ekstra 1 l reagensflaske og merk med "Wash Buffer 1 Gjenbruk" for å lagre vaskebufferen fra det første kammeret. I tillegg, aliquot 500 ml Wash Buffer 2 i en reagensflaske og inkubere i et 37 °C vannbad over natten.
    MERK: Ikke la laboratoriet stå uten å forberede trinn 4.9 til 4.11. De er nødvendige for vasketrinnene neste dag.
  12. Neste dag klargjør du vaskebufferne som beskrevet i tabell 2. Fyll hver tallerken til tre fjerdedeler av den tilsvarende bufferen. Hver vaskebuffer er bra for opptil 4-5 lysbilder.
  13. Etter nøyaktig 17 timer hybridisering, få en hybridisering kammer og demontere på lab benken foret med lo-fri papir som beskrevet i forrige publikasjon2.
    1. KRITISK TRINN: Overfør mikroarraysandwichen til dish 1. Kontroller at mikromatrisestrekkoden vender opp i skråstilling, og unngå å senke hele lysbildet i bufferen. Håndter hvert mikroarray-lysbilde fra endene og unngå å berøre den aktive siden av lysbildet.
    2. Skill de to glasslysbildene med en tang2. La pakningsskyven slippe forsiktig inn i bunnen av dish 1, samtidig som du sikrer at mikroarray-lysbildet holdes fast for neste trinn.
  14. KRITISK TRINN: Løft mikroarraylysbildene sakte sidelengs og overfør umiddelbart til mikroarraystativet i dish 2 som beskrevet i forrige publikasjon2. Det er avgjørende at mikroarraylysbildene er minimalt utsatt for luft.
    1. Gjenta trinn 4.13 og 4.14 til de åtte lysbildene er i stativet. Fordel mikroarraylysbildene jevnt langs stativet. Dette trinnet kan gjøres av én operatør uten hjelp for opptil 4 lysbilder. Fest stativholderen og overfør hele dish 2-oppsettet til den første magnetiske røreren. Rør forsiktig i nøyaktig 1 min.
  15. Under omrøring i 1 min (Trinn 4.14), overfør dish 3 fra mini 37 °C inkubatoren og plasser på toppen av den andre magnetiske røreren. Plasser vaskebuffer 2 (fra 37 °C vannbad) på fat 3. Unngå bobledannelse mens du heller.
    1. Etter 1 min omrøring er det gjort (Trinn 4.14), løft forsiktig og sakte skyvestativet fra dish 2 og overfør til dish 3. Fjern stativholderen og rør i nøyaktig 1 min.
  16. Løft skyvestativet langsomt og forsiktig fra dish 3. Pass på at du unngår dannelsen av bufferdråper2. Tørk sidene av hvert lysbilde ved å berøre forsiktig på lofritt papir. Plasser hvert flekktørkede lysbilde i en lysbildeboks, og gjenta trinn 4.16 til alle mikroarraylysbildene er i lysbildeboksen. Tørr i ca. 15 min.
    VALGFRI STOPPPUNKT
  17. Plasser hvert mikroarray-lysbilde i en lysbildeholder, slik at strekkoden vender opp.
    MERK: Ozonnivåene inne i mikroarrayrommet skal være 50 ppb (100 μg/m3)eller mindre. Dette er rent valgfritt, men anbefales på det sterkeste: Bruk et ozonbarrierelysbildedeksel for å unngå ozonindusert nedbrytning av cyaninefargestoffer.
  18. Plasser de monterte glideholderne i skannekarusellen. Last inn prøvene i rekkefølge, basert på strekkodenummer. Skann lysbildene umiddelbart ved hjelp av en mikromatriseskanner (se Materialtabellen), som beskrevet i forrige publikasjon2.
  19. Etter kjøringen, utsette dataene for funksjonen utvinning og QC validering, som beskrevet i forrige publikasjon2.

Representative Results

Denne metoden er optimalisert for å trekke ut kornfrøprøver som inneholder betydelige mengder forurensende stivelse eller sukker. Den er designet for å trekke ut totalt RNA fra 24 frøprøver per dag. Det bør gjennomføres kontinuerlig på en dag, men valgfrie stopp- og pausepunkter identifiseres i hele protokollen. Alternativt kan leseren bruke sine foretrukne RNA ekstraksjonssett eller manuell kjemisk ekstraksjonsmetode. Men basert på vår tidligere erfaring er kommersielt tilgjengelige plante RNA ekstraksjonssett ikke egnet for frø på grunn av betydelige mengder stivelse, proteiner, sukker og / eller lipidforurensning. I den beskrevne metoden etterfølges en kjemisk ekstraksjon av råolje RNA ved kolonnerensing ved hjelp av et kommersielt RNA-ekstraksjonssett. Dette gir vanligvis RNA høyere kvalitet og utbytte. Figur 1 viser resultatet av en BioAnalyzer-kjøring for å teste kvaliteten på RNA-utvinningen ved hjelp av metoden som er beskrevet her. Resultatene presenteres for byggblad (Samples 1 og 2 som representerer lav stivelsesinnholdprøver) og byggfrø (Samples 3 og 4 som representerer høy stivelsesinnholdsprøver). RNA-integritetsverdien (RIN) for alle prøver er 10.

Figur 1 viser en representativ gel av det rensede RNA-ekstraktet, hvor kvaliteten ble testet ved hjelp av en Bioanalyzer. Eksempler 1 og 2 er typiske resultater for lav stivelsesinnhold prøver som byggblader, hvor flere rRNA-bånd fra klorolaster er tydelige. Prøver 3 og 4 er representative resultater for høy stivelse svar innhold prøver som byggfrø, viser 18S og 28S rRNA. Vær oppmerksom på at ingen automatisert RIN-verdi kan beregnes for grønne plantevev som bladprøver, på grunn av klorolast rRNA. Integriteten og høy kvalitet kan imidlertid visuelt fastslås av fraværet av fornedrelsesprodukter, som vanligvis fremstår som lavt molekylært smøring. RIN-verdien for høystivelsesfrøprøver som byggfrø er vanligvis 10 ved hjelp av protokollen som er beskrevet i dette papiret.

I tillegg presenterer vi også her en representativ data av et time course eksperiment av to elite bygg innavlede linjer (Sofiara og Victoriana) som brukes til analyse av malting kvalitet19. Under maltingsprosessen omdannes stivelse til sukker. Derfor representerer prøvene vev med varierende proporsjoner av stivelse og sukkerinnhold. Som den industrielle malting prosessen ligner på spiring prosessen, transkripsjoner av to bygg linjer, forskjellig i deres malting kvalitet, ble analysert. RNAs ble hentet fra spirende frø på 2, 24, 48, 72, 120, 144 og 196 h etter imbibition i biologiske triplicates. RNA-forberedelsen og hybridiseringen til den tilpassede byggmikroarraybrikken ble utført som beskrevet ovenfor. Figur 2 indikerer det normaliserte rutenettet som leses ut fra mikroarrayhybridiseringen gitt i kvalitetskontrollrapporten (QC) (figur 3) og histogrammetsplottet for oppdagede signaler. Rutenettet gir et eksempel på avledede signaler fra hvert hjørne av brikken, inkludert bakgrunn og innlesningspunkter som brukes til kalibrering. Histogrammet indikerer avviket av påviselige prikker med respektive signalintensiteter. En vellykket hybridisering gir en bred Gaussian-formet kurve med bare mindre outliers som vist i figuren. Mislykkede hybridiseringer kan resultere i et sterkt skifte mot den ene siden ("grønne monstre").

Til slutt vises et representativt resultat av de akseptable verdiene i kolonne 4 i figur 3. For å indikere påliteligheten til de utførte eksperimentene, evalueres resultatene ytterligere ved hjelp av GeneSpring-programvaren. De innsamlede dataene presenteres som hovedkomponentanalyse (PCA). PCA integrerer verdiene til utvalgte prikker (gener) som vektor. Antall evaluerte prikker som brukes kan variere fra flere hundre til hele brikken og er avhengig av programvaren som brukes. Hver brikke (prøve) resulterer i en verdi (vektor) som følge av de integrerte signalintensitetene for de analyserte prikkene. Den relative posisjonen i grafen (PCA) angir derfor likheten mellom prøvene til hverandre. Jo nærmere prøvene er, desto mer like er de. Tekniske replikater bør være nærmere sammen enn biologiske, og biologiske replikater av en prøve bør klynge tettere sammen, enn prøver fra forskjellige tidspunkter, vev eller forhold.

Figure 1
Figur 1: Elektroforese filkjøring sammendrag oppnådd etter å ha sjekket kvaliteten på RNA med Bioanalyzer. Prøvene 1 og 2 er byggbladvev som indikert av ekstra ribosomale bånd fra klorolaster. Prøver 3 og 4 er byggfrøvev med 18S og 28S rRNA-bånd vist. En RIN-faktor er ikke alltid beregnet for grønne vev som blad, men ifølge gelen er kvaliteten på RNA veldig bra. RIN-verdien for prøver 3 og 4 er 10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: QC Rapport fra vellykket bygg microarray hybridisering. A + indikerer oppdagede signaler på rutenettet fra alle hjørner av brikken. Histogrammet viser antall signaler kategorisert i henhold til signalintensitet (fluorescens) som logaritme etter bakgrunnssubtraksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sammendrag av kvalitetskontroll (QC) etter hybridisering og skanning. Verdiene for det hybridiserte lysbildet er angitt i kolonne 2 (verdi), og området med akseptable verdier vises i kolonne 4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vask kammer montering Innhold og etikett Formål
Rett 1 Tom, la på lab benken til neste dag Fyll med vaskebuffer 1 neste dag, som brukes til å demontere mikroarraylysbildene
Rett 2 Legg til en microarray slide rack og en liten magnetisk stir bar; etiketten med "Wash Buffer 1", la på lab benken til neste dag Brukes til å vaske mikroarray lysbilder med Wash Buffer 1 neste dag
Rett 3 Tilsett en liten magnetisk rørestang, merk med "Wash Buffer 2" og legg i en 37 °C miniinkubator. Brukes til å vaske mikroarray lysbilder med Wash Buffer 2 neste dag inne i 37 °C mini inkubator

Tabell 1: Tilberedning av servantsamlingene.

Trinn Parabolen Vask buffer Temperatur Tid
Demontering 1 1 Ambient Så fort som mulig
(Trinn 4.13)
Første vask 2 1 Ambient 1 min.
(Trinn 4.14)
Andre vask 3 2 37 °C (andre er i norge) 1 min.
(Trinn 4.15)

Tabell 2: Inkubasjonstemperatur og tid for servantsamlinger.

Discussion

Den beskrevne metoden gir svært reproduserbare resultater for rnaekstrakter av høy avkastning og høy kvalitet (figur 1). Basert på vår erfaring anbefaler vi tre biologiske replikater for en genotype, stadium eller tilstand for analyse. For å kunne oppdage statistisk meningsfulle forskjeller, må den generelle overfloden av mRNA vurderes. Vær imidlertid oppmerksom på at en startmengde på 200 mg vevsprøver er nødvendig i triplicates for RNA ekstraksjontrinn. Derfor, for eksperimenter som har en begrenset mengde prøver som genmodifiserte plantematerialer, kan denne metoden ikke være hensiktsmessig.

Under mikroarray hybridisering er følgende trinn mest kritiske: (1) lasting av prøvene til pakningslysbildet (trinn 4.7) og (2) vaske matrisene etter hybridisering (trinn 4.13 og 4.14). Prøvelasting må gjøres svært nøye for å unngå bobledannelse og væskesøl. Forsiktighet er nødvendig når du setter mikroarraylysbildet på pakningssklien som inneholder de lastede prøvene: DNA-siden (med flekkede prober) bør være vendt ned for å tillate hybridisering. For vasking av mikroarrayene er det andre vasketrinnet spesielt kritisk: her må fjerning av lysbildene fra vaskebuffer 2 utføres veldig sakte (10 s) for å unngå bufferartefakter på lysbildene, noe som kan forstyrre datainnhenting og analyser.

For å motta resultater fra hybridiseringseksperimentet som er kvalifisert for nedstrøms bioinformatikkanalyse, bør man følge noen viktige kriterier. QC-rapporten, som genereres etter at protokollen er over, gir en god ide om hva som skal forbedres, og hvilke data som er i brukbar tilstand (figur 3). Den første informasjonen som mottas er det visualiserte rutenettet (Figur 2). Her kan man direkte se om alle områder for fluorescensutlesningen er riktig justert. Hvis det er et visuelt påviselig skifte, vil dette påvirke alle andre verdier (Bakgrunn, signalintensitet, etc.) og lesingen av denne brikken kan ikke brukes. På oversikten (Romlig fordeling av alle Outliers) kan man enkelt oppdage kontaminering (f.eks. støv eller hår), som påvirket utfallet. Smuss kan fjernes ved å blåse mykt og skanne brikken på nytt. Histogrammet av signalplottet som nevnt ovenfor bør resultere i en bred Gauss-formet kurve, med bare mindre outliers (Figur 2). Avhengig av vevet analysert (Figur 1),kan denne kurven se annerledes ut og kan se ut til å ha to topper, eller en dominerende topp med en skulder. Dette vil ikke påvirke kvaliteten på dataene. Bare en sterk forskjøvet topp, eller høye signaler på kantene indikerer problemer, for eksempel "grønne monstre" (for høy fluorescensintensitet), som ikke kan fjernes ved vask og bør rapporteres til chip produsenten. Også "Spatial Distribution graf for median signaler" bør variere rundt en felles verdi. Dette bør være i området mellom 40 og 100, avhengig av den generelle intensitetsavlesningen av brikken som analyseres. En annen viktig kvalitetskontroll er evalueringen av toppen i data: Loggdiagrammet for spissen i signaler bør resultere i en lineær og vanlig linje. Til slutt gir tabellen med "evalueringsberegninger" et godt og pålitelig syn på de mottatte resultatene. Her gir produsenten en rekke verdier som kan klassifiseres som Utmerket, God og Evaluere (Figur 3). Ifølge vår erfaring kan noen av verdiene ikke alltid brukes for alle sjetonger. For ris tilpassede chips, "nonControl verdi" var ofte utenfor rekkevidde, men påvirker ikke betydelig videre databehandling. I tillegg kan området for "NegControl" utvides, basert på vev, organisme og generell utgang av Chip til <80. Evalueringsområdet for verdi E1 med CV kan utvides til <9, i stedet for <8 i henhold til vår erfaring. Etter dette er en riktig evaluering av alle brikkelesedata mulig. Generelt bør man alltid huske på at uavhengige biologiske replikater alltid gir det mest pålitelige resultatet.

Fordelen med denne teknikken sammenlignet med andre metoder ligger i det faktum at den representerer en kostnadseffektiv, høy gjennomstrømningsmetode for transkripsjonsprofilering. Videre er nedstrøms dataanalyserørledningen enklere og mer etablert. Til tross for fordeler er det visse begrensninger i denne teknikken, for eksempel antall gener som kan analyseres. Mikroarrayet kan bare lette analysen av gener som tidligere har oppdaget sonder på matrisen. Derfor gjelder denne teknikken bare for plantearter med sekvenserte genomer og fullt kommenterte gener. Vi ser for oss at de mikroarraybaserte transkripsjonene fortsatt vil være svært nyttige og relevante, ikke bare for genuttrykkprofilering, men også for andre nedstrøms bioinformatikkrørledninger som genregulatoriske nettverksanalyser og transkripsjonsomfattende foreningsstudie.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet har blitt støttet under CGIAR tematiske området Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stress-Tolerant Rice for Afrika og Sør-Asia (STRASA) Fase III, og IZN (Tverrfaglig senter for crop plant research, Halle (Saale), Tyskland. Vi takker Mandy Püffeld for hennes utmerkede tekniske hjelp og Dr. Isabel Maria Mora-Ramirez for å dele informasjon og erfaring med hvetebrikken. Vi takker Dr. Rhonda Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Tyskland) for kommentarer og kritisk lesing av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ß-mercaptoethanol Roth 4227.3 Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies To determine quality and quantity of RNA extract
Crushed ice maker Various brands To keep samples on ice during sample processing
Dewar flask Various brands Used as liquid nitrogen container
Ethanol, absolute Roth 9065.1
Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies 5188-5242 Kit components:
2X Hi-RPM Hybridization Buffer
25X Fragmentation Buffer
10X Gene Expression Blocking Agent
Gene Expression Wash buffer Kit Agilent Technologies 5188-5325 Kit components:
Gene Expression Wash Buffer 1
Gene Expression Wash Buffer 2
Triton X-102
Heat block Various brands It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes
Hybridization oven Agilent G2545A Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.
Hybridization gasket slide kit Agilent G2534-60014
iQAir air cleaner To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area
Isopropanol Roth 9866.5
Lint-free paper, Kimwipes Kimberly-Clark Professional KC34155
Low Input Quick Amp Labeling Kit Agilent Technologies 5190-2305 Kit components:
T7 Primer
5x First Strand Buffer
0.1M DTT
10 mM dNTP Mix
AffinityScript RNAse Block Mix
5x Transcription Buffer
NTP Mix
T7 RNA Polymerase Blend
Nuclease-free water
Cyanine 3-CTP
Metal spatula, small Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.
Microarray scanner Agilent Technologies Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended
Microfuge tubes, nuclease-free Various brands 2.0 mL and 1.5 mL volume
Microcentrifuge Eppendorf 5810 R It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes
Mini incubator Labnet I5110-230V Any small incubator will do.
Mortar and pestle Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.
NaCl Sigma-Aldrich S7653-1KG
Nanodrop 1000 Peqlab / Thermofisher
Nuclease-free water Biozym 351900302
One-Color RNA Spike-In Kit Agilent 5188-5282 Kit components:
One color RNA Spike-Mix
Dilution Buffer
Ozone barrier slide cover kit Agilent G2505-60550 Optional but highly recommended
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free Stratagene Z376426
Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1) Roth A156.2
Pipette tips, nuclease free, filter tips Various brands To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
Pipettor set Various brands For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
RNA Extraction Buffer 10 mM Tri-HCl pH 8.0
150 mM LiCl
50 mM EDTA
1.5% EDTA
15 ul/mL β-mercaptoethanol		 We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Kit components:
RNeasy mini spin column (pink)
1.5 ml collection tubes
2 ml collection tubes
Buffer RLT
Buffer RW
Buffer RPE
Nuclease-free water
RNeasy Plant Mini Kit Qiagen 74904 Kit components:
RNeasy mini spin column (pink)
QIAshredder spin column (purple)
1.5 ml collection tubes
2 ml collection tubes
Buffer RLT
Buffer RLC
Buffer RW1
Buffer RPE
Nuclease-free water
Slide holders for DNA microarray scanner Agilent G2505-60525
Slide staining dish with removable rack DWK Life Sciences 900200 Fisher Scientific 08-812 We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)
Sodium chloride Roth P029.1
Ultralow temperature freezer Various brand Capable of storing sample at -80 °C
Vortex mixer Various brands At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Püffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform. Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).
  3. Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. Catalyzing plant science research with RNA-seq. Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).
  4. Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. RNA-Seq methods for transcriptome analysis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  5. Radchuk, V. V., et al. Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain. Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).
  6. Sreenivasulu, N. Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination. Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).
  7. Sreenivasulu, N., Wobus, U. Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots. Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).
  8. Butardo, V. M. Jr, et al. Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis. Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).
  9. de Guzman, M. K., et al. Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination. Scientific Reports. 7 (1), 5854 (2017).
  10. Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress. Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).
  11. Anacleto, R., et al. Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice. Plant Biotechnology Journal. , (2018).
  12. Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling. BMC Plant Biology. 9, 4 (2009).
  13. Druka, A., et al. An atlas of gene expression from seed to seed through barley development. Functional & Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).
  14. Fujita, M., et al. Rice Expression Atlas In Reproductive Development. Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).
  15. Wang, L., et al. A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice. The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).
  16. Yamakawa, H., Hakata, M. Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation. Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).
  17. Shakoor, N., et al. A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums. BMC Plant Biology. 14, 35 (2014).
  18. Yu, Y. L., et al. Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development. Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).
  19. Kochevenko, A., et al. Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress. BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).

Tags

Biokjemi Utgave 159 cDNA-syntese cRNA-merking mikroarray nukleinsyrehybridisering total RNA-ekstraksjon transkripsjon

Erratum

Formal Correction: Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling
Posted by JoVE Editors on 06/26/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling. Two author names were updated.

The names were corrected from:

Christianne Seiler
Nese Sreeenivasulu

to:

Christiane Seiler
Nese Sreenivasulu

Skaffe transkripsjonsdata av høy kvalitet fra kornfrø med en modifisert metode for genuttrykksprofilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Butardo Jr., V. M., Seiler, C.,… More

Butardo Jr., V. M., Seiler, C., Sreenivasulu, N., Kuhlmann, M. Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling. J. Vis. Exp. (159), e60602, doi:10.3791/60602 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter