En metode for transkripsjonprofilering av frokostblandinger presenteres. Den mikroarraybaserte genuttrykksprofileringen starter med isolering av høykvalitet total RNA fra kornkorn og fortsetter med generering av cDNA. Etter cRNA merking og mikroarray hybridisering, anbefalinger er gitt for signaldeteksjon og kvalitetskontroll.
Karakteriseringen av genuttrykk er avhengig av RNA-kvalitet. Ved spirende, utviklende og modne kornfrø blir ekstraksjonen av høykvalitets RNA ofte hindret av høy stivelse og sukkerinnhold. Disse forbindelsene kan redusere både utbyttet og kvaliteten på den ekstraherte totale RNA. Forverringen i kvantitet og kvalitet på total RNA kan senere ha en betydelig innvirkning på nedstrøms transkripsjonsanalyser, som kanskje ikke nøyaktig gjenspeiler den romlige og/eller temporale variasjonen i genuttrykksprofilen til prøvene som testes. I denne protokollen beskriver vi en optimalisert metode for utvinning av total RNA med tilstrekkelig mengde og kvalitet som skal brukes til hele transkripsjonsanalyse av kornkorn. Den beskrevne metoden er egnet for flere nedstrøms applikasjoner som brukes til transkripsjonavvedisk profilering av utvikling, spiring og modne kornfrø. Metoden for transkripsjonprofilering ved hjelp av en mikroarrayplattform vises. Denne metoden er spesielt utviklet for genuttrykkprofilering av korn med beskrevne genomsekvenser. Den detaljerte prosedyren fra mikroarrayhåndtering til endelig kvalitetskontroll er beskrevet. Dette inkluderer cDNA-syntese, cRNA-merking, mikroarray hybridisering, lysbildeskanning, funksjonsutvinning og validering av datakvalitet. Dataene som genereres av denne metoden kan brukes til å karakterisere transkripsjonen av korn under spiring, i ulike stadier av kornutvikling, eller ved forskjellige biotiske eller abiotiske stressforhold. Resultatene som presenteres her eksemplifiserer transkripsjonsdata av høy kvalitet som er egnet for nedstrøms bioinformatikkanalyser, for eksempel fastsettelse av differensialt uttrykte gener (DEGs), karakterisering av genregulatoriske nettverk og gjennomføring av transkripsjonsomfattende foreningsstudie (TWAS).
Transkripsjonen representerer hele settet med ribonucleic acid (RNA) transkripsjoner uttrykt av genomet til en organisme på et gitt tidspunkt og spesielt miljø- og vekstforhold. Hver celle har sin individuelle transkripsjon, som gjenspeiler sin nåværende fysiologiske og metabolske tilstand. En samling av celler avledet fra et lignende vev eller organ brukes i en typisk transkripsjonsstudie, men encellede og romlig løste transkripsjonomikk blir populære1. Transkripsjonomiske analyser starter med utvinning av den totale RNA fra et valgt vev på et bestemt tidspunkt, og i definerte vekstforhold. Til dette formål anbefaler vi bruk av en nyutviklet metode for utvinning av total RNA fra prøver med høyt stivelse eller sukkerinnhold, for eksempel kornfrø2. Sammenligningen av transkripsjoner mellom ulike prøver resulterer i identifisering av RNA molekyler med forskjellig overflod. Disse RNA molekylene anses som differensialt uttrykte gener (DEGs). Overflod av transkripsjoner avledet fra spesifikke markørgener kan deretter brukes til å estimere utviklingsstatusen eller bestemme responsen fra en organisme på miljøsvingninger. Gener uten påviselige endringer i transkripsjonsoverflod på tvers av utviklingstidspunktene under studien brukes ofte som referanse- eller rengjøringsgener.
RNA oppdages vanligvis og kvantifiseres av ulike metoder, for eksempel nordlig blotting og kvantitativ omvendt transkripsjonase polymerase kjedereaksjon (qRT-PCR), men dagens høygjennomstrømningtranskripsjonsmetoder er avhengige av nukleinsyrehybridisering ved hjelp av mikroarrayteknologi samt RNA-sekvensering (RNA-Seq). RNA-Seq er veldig populært i dag fordi det gir flere fordeler for høy gjennomstrømning transkripsjonomiske applikasjoner som gjennomgått andre steder3,4. Selv om genuttrykkprofilering ved hjelp av mikroarraychips fortsatt er mye brukt fordi det er en mer etablert teknologi, noe som krever mindre bakgrunn i bioinformatikk. Sammenlignet med RNA-Seq er datasettene som genereres fra mikroarrayeksperimenter, mindre og enklere å analysere. I tillegg er det mer kostnadseffektivt, spesielt hvis du arbeider med store utvalgstall. I vårt laboratorium bruker vi rutinemessig transkripsjonsanalyser ved hjelp av mikroarray-teknologien for å bestemme rollen til sentrale regulatoriske knutepunkter som styrer molekylære nettverk og veier som er involvert i vekst, utvikling og metabolisme av kornkorn5,,6,7,8,9. Vi bruker den også rutinemessig til å gjennomføre genomomfattende genuttrykkprofileringsstudier for å oppnå en mekanistisk forståelse av responsen fra kornkorn til abiotiske påkjenninger10, samt i gjennomføringen av transkripsjonsomfattende assosiasjon (TWAS) og linkage kartleggingsstudier for å identifisere gener som er ansvarlige for kornkornkvalitet og ernæring11,12. Andre grupper har også brukt mikroarrayteknologien til å tilby utviklingsspesifikke genuttrykksatlas i bygg13,ris14,,15,,16,sorghum17og hvete18.
Formålet med denne publikasjonen er å gi et kort tekstlig sammendrag og en detaljert visuell beskrivelse av metoden vi for tiden bruker i vårt laboratorium for transkripsjonavkornved hjelp av en Agilent mikroarrayplattform. Vær oppmerksom på at andre mikroarray plattformer er tilgjengelige, men vil ikke bli dekket i denne metoden. Vi begynner protokollen ved å presentere en detaljert beskrivelse av RNA-ekstraksjon fra å utvikle eller spire kornfrø. Basert på vår erfaring er det ofte flaskehalsen som får en høy kvalitet og høy mengde transkripsjonom som er egnet til nedstrøms transkripsjonsanalyser, ofte flaskehalsen ved bruk av kornfrøvev. Vi har prøvd flere kommersielt tilgjengelige RNA-ekstraksjonssett, men ingen har gitt tilfredsstillende resultater. Derfor utviklet vi en kjemisk ekstraksjonsprotokoll for å oppnå et grovt RNA-ekstrakt som deretter blir utsatt for kolonnerensing ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett. Ved hjelp av denne metoden, vi rutinemessig og reproduserbart få høy kvalitet RNA2 (Figur 1), som kan brukes til ulike nedstrøms applikasjoner for å generere en transkripsjonsprofil.
Den beskrevne metoden gir svært reproduserbare resultater for rnaekstrakter av høy avkastning og høy kvalitet (figur 1). Basert på vår erfaring anbefaler vi tre biologiske replikater for en genotype, stadium eller tilstand for analyse. For å kunne oppdage statistisk meningsfulle forskjeller, må den generelle overfloden av mRNA vurderes. Vær imidlertid oppmerksom på at en startmengde på 200 mg vevsprøver er nødvendig i triplicates for RNA ekstraksjontrinn. Derfor, for eksperimenter som har en begrenset mengde prøver som genmodifiserte plantematerialer, kan denne metoden ikke være hensiktsmessig.
Under mikroarray hybridisering er følgende trinn mest kritiske: (1) lasting av prøvene til pakningslysbildet (trinn 4.7) og (2) vaske matrisene etter hybridisering (trinn 4.13 og 4.14). Prøvelasting må gjøres svært nøye for å unngå bobledannelse og væskesøl. Forsiktighet er nødvendig når du setter mikroarraylysbildet på pakningssklien som inneholder de lastede prøvene: DNA-siden (med flekkede prober) bør være vendt ned for å tillate hybridisering. For vasking av mikroarrayene er det andre vasketrinnet spesielt kritisk: her må fjerning av lysbildene fra vaskebuffer 2 utføres veldig sakte (10 s) for å unngå bufferartefakter på lysbildene, noe som kan forstyrre datainnhenting og analyser.
For å motta resultater fra hybridiseringseksperimentet som er kvalifisert for nedstrøms bioinformatikkanalyse, bør man følge noen viktige kriterier. QC-rapporten, som genereres etter at protokollen er over, gir en god ide om hva som skal forbedres, og hvilke data som er i brukbar tilstand (figur 3). Den første informasjonen som mottas er det visualiserte rutenettet (Figur 2). Her kan man direkte se om alle områder for fluorescensutlesningen er riktig justert. Hvis det er et visuelt påviselig skifte, vil dette påvirke alle andre verdier (Bakgrunn, signalintensitet, etc.) og lesingen av denne brikken kan ikke brukes. På oversikten (Romlig fordeling av alle Outliers) kan man enkelt oppdage kontaminering (f.eks. støv eller hår), som påvirket utfallet. Smuss kan fjernes ved å blåse mykt og skanne brikken på nytt. Histogrammet av signalplottet som nevnt ovenfor bør resultere i en bred Gauss-formet kurve, med bare mindre outliers (Figur 2). Avhengig av vevet analysert (Figur 1),kan denne kurven se annerledes ut og kan se ut til å ha to topper, eller en dominerende topp med en skulder. Dette vil ikke påvirke kvaliteten på dataene. Bare en sterk forskjøvet topp, eller høye signaler på kantene indikerer problemer, for eksempel “grønne monstre” (for høy fluorescensintensitet), som ikke kan fjernes ved vask og bør rapporteres til chip produsenten. Også “Spatial Distribution graf for median signaler” bør variere rundt en felles verdi. Dette bør være i området mellom 40 og 100, avhengig av den generelle intensitetsavlesningen av brikken som analyseres. En annen viktig kvalitetskontroll er evalueringen av toppen i data: Loggdiagrammet for spissen i signaler bør resultere i en lineær og vanlig linje. Til slutt gir tabellen med “evalueringsberegninger” et godt og pålitelig syn på de mottatte resultatene. Her gir produsenten en rekke verdier som kan klassifiseres som Utmerket, God og Evaluere (Figur 3). Ifølge vår erfaring kan noen av verdiene ikke alltid brukes for alle sjetonger. For ris tilpassede chips, “nonControl verdi” var ofte utenfor rekkevidde, men påvirker ikke betydelig videre databehandling. I tillegg kan området for “NegControl” utvides, basert på vev, organisme og generell utgang av Chip til <80. Evalueringsområdet for verdi E1 med CV kan utvides til <9, i stedet for <8 i henhold til vår erfaring. Etter dette er en riktig evaluering av alle brikkelesedata mulig. Generelt bør man alltid huske på at uavhengige biologiske replikater alltid gir det mest pålitelige resultatet.
Fordelen med denne teknikken sammenlignet med andre metoder ligger i det faktum at den representerer en kostnadseffektiv, høy gjennomstrømningsmetode for transkripsjonsprofilering. Videre er nedstrøms dataanalyserørledningen enklere og mer etablert. Til tross for fordeler er det visse begrensninger i denne teknikken, for eksempel antall gener som kan analyseres. Mikroarrayet kan bare lette analysen av gener som tidligere har oppdaget sonder på matrisen. Derfor gjelder denne teknikken bare for plantearter med sekvenserte genomer og fullt kommenterte gener. Vi ser for oss at de mikroarraybaserte transkripsjonene fortsatt vil være svært nyttige og relevante, ikke bare for genuttrykkprofilering, men også for andre nedstrøms bioinformatikkrørledninger som genregulatoriske nettverksanalyser og transkripsjonsomfattende foreningsstudie.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet har blitt støttet under CGIAR tematiske området Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stress-Tolerant Rice for Afrika og Sør-Asia (STRASA) Fase III, og IZN (Tverrfaglig senter for crop plant research, Halle (Saale), Tyskland. Vi takker Mandy Püffeld for hennes utmerkede tekniske hjelp og Dr. Isabel Maria Mora-Ramirez for å dele informasjon og erfaring med hvetebrikken. Vi takker Dr. Rhonda Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Tyskland) for kommentarer og kritisk lesing av manuskriptet.
ß-mercaptoethanol | Roth | 4227.3 | Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use |
Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | To determine quality and quantity of RNA extract | |
Crushed ice maker | Various brands | To keep samples on ice during sample processing | |
Dewar flask | Various brands | Used as liquid nitrogen container | |
Ethanol, absolute | Roth | 9065.1 | |
Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | Kit components: 2X Hi-RPM Hybridization Buffer 25X Fragmentation Buffer 10X Gene Expression Blocking Agent |
Gene Expression Wash buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5325 | Kit components: Gene Expression Wash Buffer 1 Gene Expression Wash Buffer 2 Triton X-102 |
Heat block | Various brands | It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes | |
Hybridization oven | Agilent | G2545A | Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight. |
Hybridization gasket slide kit | Agilent | G2534-60014 | |
iQAir air cleaner | To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area | ||
Isopropanol | Roth | 9866.5 | |
Lint-free paper, Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | KC34155 | |
Low Input Quick Amp Labeling Kit | Agilent Technologies | 5190-2305 | Kit components: T7 Primer 5x First Strand Buffer 0.1M DTT 10 mM dNTP Mix AffinityScript RNAse Block Mix 5x Transcription Buffer NTP Mix T7 RNA Polymerase Blend Nuclease-free water Cyanine 3-CTP |
Metal spatula, small | Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples. | ||
Microarray scanner | Agilent Technologies | Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended | |
Microfuge tubes, nuclease-free | Various brands | 2.0 mL and 1.5 mL volume | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5810 R | It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes |
Mini incubator | Labnet | I5110-230V | Any small incubator will do. |
Mortar and pestle | Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen. | ||
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
Nanodrop 1000 | Peqlab / Thermofisher | ||
Nuclease-free water | Biozym | 351900302 | |
One-Color RNA Spike-In Kit | Agilent | 5188-5282 | Kit components: One color RNA Spike-Mix Dilution Buffer |
Ozone barrier slide cover kit | Agilent | G2505-60550 | Optional but highly recommended |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
Pipette tips, nuclease free, filter tips | Various brands | To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes | |
Pipettor set | Various brands | For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes | |
RNA Extraction Buffer | 10 mM Tri-HCl pH 8.0 150 mM LiCl 50 mM EDTA 1.5% EDTA 15 ul/mL β-mercaptoethanol |
We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily | |
RNase-free DNase set | Qiagen | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit components: RNeasy mini spin column (pink) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RW Buffer RPE Nuclease-free water |
RNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 74904 | Kit components: RNeasy mini spin column (pink) QIAshredder spin column (purple) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RLC Buffer RW1 Buffer RPE Nuclease-free water |
Slide holders for DNA microarray scanner | Agilent | G2505-60525 | |
Slide staining dish with removable rack | DWK Life Sciences 900200 | Fisher Scientific 08-812 | We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack) |
Sodium chloride | Roth | P029.1 | |
Ultralow temperature freezer | Various brand | Capable of storing sample at -80 °C | |
Vortex mixer | Various brands | At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes |