Der præsenteres en metode til transskription af korn. Den mikroarray-baserede genekspressionsprofilering starter med isolering af totalRNA af høj kvalitet fra korn og fortsætter med genereringen af cDNA. Efter cRNA-mærkning og mikroarrayhybridisering gives der anbefalinger til signaldetektion og kvalitetskontrol.
Karakteriseringen af genekspressionen afhænger af RNA-kvalitet. Ved spiring, udvikling og modne kornfrø hæmmes udvindingen af RNA af høj kvalitet ofte af højt stivelses- og sukkerindhold. Disse forbindelser kan reducere både udbyttet og kvaliteten af den ekstraherede samlede RNA. Forringelsen af kvantiteten og kvaliteten af det samlede RNA kan efterfølgende have en betydelig indvirkning på downstream-transskriptionen om udskriftsanalyser, som muligvis ikke nøjagtigt afspejler den rumlige og/eller tidsmæssige variation i genekspressionsprofilen for de prøver, der testes. I denne protokol beskriver vi en optimeret metode til ekstraktion af totalRNA med tilstrækkelig mængde og kvalitet, der skal anvendes til hele transkriptionsanalyse af korn. Den beskrevne metode er velegnet til flere downstream-applikationer, der anvendes til transskription om udvikling, spireevne og modne kornfrø. Metoden til transskription profilering ved hjælp af en microarray platform er vist. Denne metode er specielt designet til genekspressionsprofilering af korn med beskrevne genomsekvenser. Den detaljerede procedure fra microarray håndtering til endelig kvalitetskontrol er beskrevet. Dette omfatter cDNA-syntese, cRNA-mærkning, mikroarray hybridisering, diasscanning, funktionsudtrækning og validering af datakvalitet. De data, der genereres ved denne metode, kan anvendes til at karakterisere transskriptionen af korn under spiring, i forskellige stadier af kornudvikling eller ved forskellige biotiske eller abiotiske stressforhold. De resultater, der præsenteres her, eksemplificerer transkriptionsdata af høj kvalitet, der kan udføres i forbindelse med nedstrømsbioinformatikanalyser, såsom bestemmelse af differentialudtrykte gener (DEGs), karakterisering af genreguleringsnetværk og gennemførelse af transkriptionsomfattende foreningsundersøgelser (TWAS).
Transskriptionen repræsenterer det komplette sæt ribonucleic syre (RNA) udskrifter udtrykt ved genomet af en organisme på et givet tidspunkt, og især miljø-og vækstbetingelser. Hver celle har sin individuelle transkription, som afspejler dens nuværende fysiologiske og metaboliske tilstand. En samling af celler, der stammer fra et lignende væv eller organ, anvendes i et typisk transskriptionsstudie, men enkeltcellede og rumligt løste transskriptionomik bliver populært1. Transkripomiske analyser starter med ekstraktion af det samlede RNA fra et udvalgt væv på et bestemt tidspunkt og i definerede vækstbetingelser. Til dette formål anbefaler vi, at der anvendes en nyudviklet metode til udvinding af totalRNA fra prøver med højt stivelses- eller sukkerindhold, såsom kornfrø2. Sammenligningen af transkriptioner mellem forskellige prøver resulterer i identifikation af RNA-molekyler med forskellig tæthed. Disse RNA-molekyler betragtes som differentierede udtrykte gener (DEGs). Den overflod af udskrifter, der er afledt af specifikke markørgener, kan derefter bruges til at vurdere udviklingsstatus eller bestemme en organismes reaktion på miljømæssige udsving. Gener uden påviselige ændringer i deres udskrift overflod på tværs af udviklingsmæssige tidspunkter under undersøgelse bruges ofte som reference eller husholdning gener.
RNA er typisk opdaget og kvantificeret ved forskellige metoder, såsom nordlige blotting og kvantitative omvendt transkripase polymerase kædereaktion (qRT-PCR), men nuværende høj-throughput transkriptionomics metoder er stærkt afhængige af nukleinsyre hybridisering ved hjælp af microarray teknologi samt RNA sekventering (RNA-Seq). RNA-Seq er meget populær iøjeblikket,fordi det giver flere fordele for høj gennemløb transskriptionomiske applikationer som gennemgået andetsteds3,4. Selv om en ældre teknologi, genekspression profilering ved hjælp af microarray chips er stadig meget udbredt, fordi det er en mere etableret teknologi, som kræver mindre af en baggrund i bioinformatik. Sammenlignet med RNA-Seq er de datasæt, der genereres fra mikroarrayeksperimenter, mindre og lettere at analysere. Desuden er det mere omkostningseffektivt, især hvis der beskæftiger sig med store stikprøvenumre. I vores laboratorium bruger vi rutinemæssigt transkriptoriske analyser ved hjælp af microarray-teknologien til at bestemme den rolle, som centrale reguleringsknudepunkter, der styrer de molekylære netværk og veje, der er involveret i vækst, udvikling og metabolisme af korn5,,6,,7,8,9. Vi bruger det også rutinemæssigt til at gennemføre genekspressionsprofileringsundersøgelser for at opnå en mekanistisk forståelse af kornets respons på abiotiske belastninger10,samt i udførelsen af transskriptionsdækkende association (TWAS) og linkage mapping undersøgelser for at identificere gener, der er ansvarlige for kornkvalitet og ernæring11,12. Andre grupper har også anvendt mikroarrayteknologien til at levere udviklingsspecifikt genekspressionsatlas i byg13, ris14,15,16, sorghum17og hvede18.
Formålet med denne publikation er at give et kort tekstresumé og en detaljeret visuel beskrivelse af den metode, vi i øjeblikket anvender i vores laboratorium til transskription af korn ved hjælp af en Agilent microarray platform. Bemærk venligst, at andre microarray platforme er tilgængelige, men vil ikke være dækket i denne metode. Vi begynder protokollen ved at præsentere en detaljeret beskrivelse af RNA-ekstraktion fra udvikling eller spiring af kornfrø. Baseret på vores erfaring, at opnå en høj kvalitet og høj mængde transskription modtagelige for downstream transskriptionomiske analyser er ofte flaskehals, når du bruger korn frø væv. Vi har prøvet flere kommercielt tilgængelige RNA ekstraktionssæt, men ingen har givet tilfredsstillende resultater. Derfor udviklede vi en kemisk ekstraktionsprotokol for at opnå et råT RNA-ekstrakt, som derefter udsættes for kolonnerensning ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit. Ved hjælp af denne metode opnår vi rutinemæssigt og reproducerbart RNA2 af høj kvalitet (Figur 1), som kan bruges til forskellige downstream-applikationer til at generere en transskriptionsprofil.
Den beskrevne metode giver meget reproducerbare resultater for højtydende OG højkvalitets RNA-ekstrakter (figur 1). Baseret på vores erfaring anbefaler vi tre biologiske replikater for en genotype, fase eller tilstand til analyse. For at kunne påvise statistisk meningsfulde forskelle skal den generelle forekomst af mRNA overvejes. Bemærk dog, at der kræves en startmængde på 200 mg vævsprøver i tre eksemplarer til RNA-ekstraktionstrinnet. For forsøg, der har en begrænset mængde prøver såsom genetisk modificerede plantematerialer, er denne metode derfor muligvis ikke hensigtsmæssig.
Under mikroarrayhybridisering er følgende trin mest kritiske: (1) indlæsning af prøverne til pakningsdiaset (trin 4.7) og (2) vask af arrays efter hybridisering (trin 4.13 og 4.14). Prøve belastning skal gøres meget omhyggeligt for at undgå boble dannelse og flydende spilde. Forsigtighed er nødvendig, når du sætter microarray dias på pakningdiaset indeholder de lastede prøver: DNA-side (med plettede sonder) skal vende nedad for at tillade hybridisering. Til vask af mikroarrays er det andet vasketrin særligt kritisk: Her skal fjernelseaf diasene fra vaskebuffer 2 udføres meget langsomt (10 s) for at undgå bufferartefakter på diasene, hvilket kan forstyrre dataindsamlingen og analyserne.
For at modtage resultater fra hybridisering eksperiment, der er berettiget til down-stream bioinformatik analyse, bør man følge et par vigtige kriterier. QC-rapporten, som genereres efter ovenstående protokols ydeevne, giver en god idé om, hvad der skal forbedres, og hvilke data der er i brugbar stand (figur 3). De første modtagne oplysninger er det visualiserede gitter (Figur 2). Her kan man direkte se, om alle områder for fluorescens udlæsning er korrekt justeret. Hvis der er et visuelt påviseligt skift, vil dette påvirke alle andre værdier (baggrund, signalintensitet osv.), og læsningen af denne chip kan ikke bruges. På oversigten (Rumlig fordeling af alle Outliers), kan man nemt få øje på enhver forurening (f.eks støv eller hår), som påvirkede resultatet. Snavs kan fjernes ved at blæse og scanne chippen igen. Histogrammet af signalplot som nævnt ovenfor bør resultere i en bred Gauss-formet kurve, med kun mindre outliers (Figur 2). Afhængigt af det analyserede væv (Figur 1) kan denne kurve se anderledes ud og kan se ud til at have to toppe eller en fremherskende top med en skulder. Dette vil ikke påvirke kvaliteten af data. Kun en stærk forflyttet top, eller høje signaler på kanterne indikerer problemer, såsom “grønne monstre” (for høj fluorescens intensiteter), som ikke kan fjernes ved vask og bør indberettes til chipproducenten. Desuden bør “Spatial Distribution graph for Median Signals” variere omkring en fælles værdi. Dette bør være i intervallet mellem 40 og 100, afhængigt af den generelle intensitet udlæsning af chippen analyseret. En anden vigtig kvalitetskontrol er evalueringen af den kraftige stigning i data: Loggrafen for spidserne i signalerne bør resultere i en lineær og regelmæssig linje. Endelig giver tabellen over “evalueringsmålinger” et godt og pålideligt overblik over de modtagne resultater. Her giver producenten en række værdier, som kan klassificeres som Excellent, Good og Evaluate (Figur 3). Ifølge vores erfaring kan nogle af værdierne ikke altid anvendes for alle chips. For risbrugerdefinerede chips var “nonControl-værdien” ofte uden for området, men påvirker ikke den videre databehandling væsentligt. Desuden kan intervallet for “NegControl” udvides, baseret på væv, organisme og generel produktion af chippen til <80. Intervallet for evaluering for værdi E1 med CV kan udvides til <9, i stedet for <8 ifølge vores erfaring. Efter dette, en ordentlig evaluering af alle chip læse data er muligt. Generelt bør man altid huske på, at uafhængige biologiske replikater altid giver det mest pålidelige resultat.
Fordelen ved denne teknik i forhold til andre metoder ligger i det faktum, at det repræsenterer en omkostningseffektiv, høj-throughput metode til transskriptionel profilering. Desuden er downstream-dataanalysepipelinen lettere og mere etableret. På trods af fordele, der er visse begrænsninger af denne teknik, såsom antallet af gener, der kan analyseres. Mikroarrayet kan kun lette analysen af gener, der tidligere har spottet sonder på arrayet. Derfor gælder denne teknik kun for plantearter med sekvenserede genomer og fuldt kommenterede gener. Vi forestiller os, at mikroarray-baserede transkriptorer fortsat vil være meget nyttige og relevante, ikke kun for genekspressionsprofilering, men også for andre downstream bioinformatikrørledninger såsom genregulerende netværksanalyser og transskriptionsomfattende foreningsundersøgelse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er blevet støttet under CGIAR-temaområdet Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stress-Tolerant Rice for Africa and South Asia (STRASA) Phase III og IZN (Interdisciplinary Centre for Crop Plant Research, Halle (Saale), Tyskland. Vi takker Mandy Püffeld for hendes fremragende tekniske bistand og Dr. Isabel Maria Mora-Ramirez for at dele information og erfaring med hvedechippen. Vi takker Dr. Rhonda Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Tyskland) for kommentarer og kritisk læsning af manuskriptet.
ß-mercaptoethanol | Roth | 4227.3 | Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use |
Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | To determine quality and quantity of RNA extract | |
Crushed ice maker | Various brands | To keep samples on ice during sample processing | |
Dewar flask | Various brands | Used as liquid nitrogen container | |
Ethanol, absolute | Roth | 9065.1 | |
Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | Kit components: 2X Hi-RPM Hybridization Buffer 25X Fragmentation Buffer 10X Gene Expression Blocking Agent |
Gene Expression Wash buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5325 | Kit components: Gene Expression Wash Buffer 1 Gene Expression Wash Buffer 2 Triton X-102 |
Heat block | Various brands | It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes | |
Hybridization oven | Agilent | G2545A | Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight. |
Hybridization gasket slide kit | Agilent | G2534-60014 | |
iQAir air cleaner | To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area | ||
Isopropanol | Roth | 9866.5 | |
Lint-free paper, Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | KC34155 | |
Low Input Quick Amp Labeling Kit | Agilent Technologies | 5190-2305 | Kit components: T7 Primer 5x First Strand Buffer 0.1M DTT 10 mM dNTP Mix AffinityScript RNAse Block Mix 5x Transcription Buffer NTP Mix T7 RNA Polymerase Blend Nuclease-free water Cyanine 3-CTP |
Metal spatula, small | Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples. | ||
Microarray scanner | Agilent Technologies | Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended | |
Microfuge tubes, nuclease-free | Various brands | 2.0 mL and 1.5 mL volume | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5810 R | It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes |
Mini incubator | Labnet | I5110-230V | Any small incubator will do. |
Mortar and pestle | Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen. | ||
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
Nanodrop 1000 | Peqlab / Thermofisher | ||
Nuclease-free water | Biozym | 351900302 | |
One-Color RNA Spike-In Kit | Agilent | 5188-5282 | Kit components: One color RNA Spike-Mix Dilution Buffer |
Ozone barrier slide cover kit | Agilent | G2505-60550 | Optional but highly recommended |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
Pipette tips, nuclease free, filter tips | Various brands | To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes | |
Pipettor set | Various brands | For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes | |
RNA Extraction Buffer | 10 mM Tri-HCl pH 8.0 150 mM LiCl 50 mM EDTA 1.5% EDTA 15 ul/mL β-mercaptoethanol |
We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily | |
RNase-free DNase set | Qiagen | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit components: RNeasy mini spin column (pink) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RW Buffer RPE Nuclease-free water |
RNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 74904 | Kit components: RNeasy mini spin column (pink) QIAshredder spin column (purple) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RLC Buffer RW1 Buffer RPE Nuclease-free water |
Slide holders for DNA microarray scanner | Agilent | G2505-60525 | |
Slide staining dish with removable rack | DWK Life Sciences 900200 | Fisher Scientific 08-812 | We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack) |
Sodium chloride | Roth | P029.1 | |
Ultralow temperature freezer | Various brand | Capable of storing sample at -80 °C | |
Vortex mixer | Various brands | At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes |