Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Opnåelse af udskriftsdata af høj kvalitet fra kornfrø ved en modificeret metode til genekspressionsprofilering

Published: May 21, 2020 doi: 10.3791/60602
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Chemistry and Biotechnology, Swinburne University of Technology, 2Department of Molecular Genetics, Heterosis Research Group, Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK), 3Grain Quality and Nutrition Center, Applied Functional Genomics Cluster, International Rice Research Institute

ERRATUM NOTICE

Summary

Der præsenteres en metode til transskription af korn. Den mikroarray-baserede genekspressionsprofilering starter med isolering af totalRNA af høj kvalitet fra korn og fortsætter med genereringen af cDNA. Efter cRNA-mærkning og mikroarrayhybridisering gives der anbefalinger til signaldetektion og kvalitetskontrol.

Abstract

Karakteriseringen af genekspressionen afhænger af RNA-kvalitet. Ved spiring, udvikling og modne kornfrø hæmmes udvindingen af RNA af høj kvalitet ofte af højt stivelses- og sukkerindhold. Disse forbindelser kan reducere både udbyttet og kvaliteten af den ekstraherede samlede RNA. Forringelsen af kvantiteten og kvaliteten af det samlede RNA kan efterfølgende have en betydelig indvirkning på downstream-transskriptionen om udskriftsanalyser, som muligvis ikke nøjagtigt afspejler den rumlige og/eller tidsmæssige variation i genekspressionsprofilen for de prøver, der testes. I denne protokol beskriver vi en optimeret metode til ekstraktion af totalRNA med tilstrækkelig mængde og kvalitet, der skal anvendes til hele transkriptionsanalyse af korn. Den beskrevne metode er velegnet til flere downstream-applikationer, der anvendes til transskription om udvikling, spireevne og modne kornfrø. Metoden til transskription profilering ved hjælp af en microarray platform er vist. Denne metode er specielt designet til genekspressionsprofilering af korn med beskrevne genomsekvenser. Den detaljerede procedure fra microarray håndtering til endelig kvalitetskontrol er beskrevet. Dette omfatter cDNA-syntese, cRNA-mærkning, mikroarray hybridisering, diasscanning, funktionsudtrækning og validering af datakvalitet. De data, der genereres ved denne metode, kan anvendes til at karakterisere transskriptionen af korn under spiring, i forskellige stadier af kornudvikling eller ved forskellige biotiske eller abiotiske stressforhold. De resultater, der præsenteres her, eksemplificerer transkriptionsdata af høj kvalitet, der kan udføres i forbindelse med nedstrømsbioinformatikanalyser, såsom bestemmelse af differentialudtrykte gener (DEGs), karakterisering af genreguleringsnetværk og gennemførelse af transkriptionsomfattende foreningsundersøgelser (TWAS).

Introduction

Transskriptionen repræsenterer det komplette sæt ribonucleic syre (RNA) udskrifter udtrykt ved genomet af en organisme på et givet tidspunkt, og især miljø-og vækstbetingelser. Hver celle har sin individuelle transkription, som afspejler dens nuværende fysiologiske og metaboliske tilstand. En samling af celler, der stammer fra et lignende væv eller organ, anvendes i et typisk transskriptionsstudie, men enkeltcellede og rumligt løste transskriptionomik bliver populært1. Transkripomiske analyser starter med ekstraktion af det samlede RNA fra et udvalgt væv på et bestemt tidspunkt og i definerede vækstbetingelser. Til dette formål anbefaler vi, at der anvendes en nyudviklet metode til udvinding af totalRNA fra prøver med højt stivelses- eller sukkerindhold, såsom kornfrø2. Sammenligningen af transkriptioner mellem forskellige prøver resulterer i identifikation af RNA-molekyler med forskellig tæthed. Disse RNA-molekyler betragtes som differentierede udtrykte gener (DEGs). Den overflod af udskrifter, der er afledt af specifikke markørgener, kan derefter bruges til at vurdere udviklingsstatus eller bestemme en organismes reaktion på miljømæssige udsving. Gener uden påviselige ændringer i deres udskrift overflod på tværs af udviklingsmæssige tidspunkter under undersøgelse bruges ofte som reference eller husholdning gener.

RNA er typisk opdaget og kvantificeret ved forskellige metoder, såsom nordlige blotting og kvantitative omvendt transkripase polymerase kædereaktion (qRT-PCR), men nuværende høj-throughput transkriptionomics metoder er stærkt afhængige af nukleinsyre hybridisering ved hjælp af microarray teknologi samt RNA sekventering (RNA-Seq). RNA-Seq er meget populær iøjeblikket,fordi det giver flere fordele for høj gennemløb transskriptionomiske applikationer som gennemgået andetsteds3,4. Selv om en ældre teknologi, genekspression profilering ved hjælp af microarray chips er stadig meget udbredt, fordi det er en mere etableret teknologi, som kræver mindre af en baggrund i bioinformatik. Sammenlignet med RNA-Seq er de datasæt, der genereres fra mikroarrayeksperimenter, mindre og lettere at analysere. Desuden er det mere omkostningseffektivt, især hvis der beskæftiger sig med store stikprøvenumre. I vores laboratorium bruger vi rutinemæssigt transkriptoriske analyser ved hjælp af microarray-teknologien til at bestemme den rolle, som centrale reguleringsknudepunkter, der styrer de molekylære netværk og veje, der er involveret i vækst, udvikling og metabolisme af korn5,,6,,7,8,9. Vi bruger det også rutinemæssigt til at gennemføre genekspressionsprofileringsundersøgelser for at opnå en mekanistisk forståelse af kornets respons på abiotiske belastninger10,samt i udførelsen af transskriptionsdækkende association (TWAS) og linkage mapping undersøgelser for at identificere gener, der er ansvarlige for kornkvalitet og ernæring11,12. Andre grupper har også anvendt mikroarrayteknologien til at levere udviklingsspecifikt genekspressionsatlas i byg13, ris14,15,16, sorghum17og hvede18.

Formålet med denne publikation er at give et kort tekstresumé og en detaljeret visuel beskrivelse af den metode, vi i øjeblikket anvender i vores laboratorium til transskription af korn ved hjælp af en Agilent microarray platform. Bemærk venligst, at andre microarray platforme er tilgængelige, men vil ikke være dækket i denne metode. Vi begynder protokollen ved at præsentere en detaljeret beskrivelse af RNA-ekstraktion fra udvikling eller spiring af kornfrø. Baseret på vores erfaring, at opnå en høj kvalitet og høj mængde transskription modtagelige for downstream transskriptionomiske analyser er ofte flaskehals, når du bruger korn frø væv. Vi har prøvet flere kommercielt tilgængelige RNA ekstraktionssæt, men ingen har givet tilfredsstillende resultater. Derfor udviklede vi en kemisk ekstraktionsprotokol for at opnå et råT RNA-ekstrakt, som derefter udsættes for kolonnerensning ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit. Ved hjælp af denne metode opnår vi rutinemæssigt og reproducerbart RNA2 af høj kvalitet (Figur 1), som kan bruges til forskellige downstream-applikationer til at generere en transskriptionsprofil.

Protocol

1. Total RNA-ekstraktion og rensning

BEMÆRK: Arbejd altid under røgemhætten, da denne metode indebærer brug af skadelige flygtige organiske opløsningsmidler. Forvarm et mikrofugerør nukleaserfrit vand i 50 °C varmeblok, før forsøget påbegynder. Dette nuklelefrit vand vil blive brugt til at udrede det samlede RNA fra spinkolonne i trin 1.8.

  1. Formalede prøverne, hver med mindst tre biologiske replikater, i et fint pulver ved hjælp af en steriliseret mørtel og støder, der er forkølet i flydende nitrogen.
    1. Scoop de pulveriserede prøver ved hjælp af en lille metalspatel dyppet i flydende nitrogen og læg de pulveriserede prøver i 2,0 ml nuclease-fri mikrofuge rør, også pre-dyppet i flydende nitrogen. Prøverne opbevares straks i fryseren med ultralav temperatur (-80 °C), indtil den dag, der er afsat til batch-RNA-ekstraktion (STOP PUNKT).
      BEMÆRK: Frøprøver kan formales til fint pulver med eller uden afskalning. For ris, vi rutinemæssigt male prøverne uden afskalning, fordi skallerne indeholder silica, der kan støtte under slibning proces.
      FORSIGTIG: Dette trin skal udføres hurtigt og under strengt kryogene forhold. En mulighed for automatisering er at male prøverne ved hjælp af en kryogen kuglemølle for at minimere RNA-nedbrydning og kvalitetsforringelse.
  2. Der anskafs et råt RNA-ekstrakt ved hjælp af ca. 200 mg af den oprindelige pulveriserede prøve. Hver prøve tilsættes individuelt til et nucleasefrit mikrofugerør, der indeholder 750 μL RNA-ekstraktionsbuffer (100 mM Tris, pH 8,0, 150 mM LiCl, 50 mM EDTA, 1,5% SDS, 1,5% 2-mercaptoethanol) og 500 μL phenol:chloroform:isoamyl (25:24:1).
    1. Bland alle prøver på samme tid i 5 min ved stuetemperatur ved hjælp af en multi-tube vortex mixer indstillet ved høj hastighed. Hold straks alle rør på is i to minutter.
      FORSIGTIG: Arbejd altid inde i røgemhætten, især for alle trin, der involverer fenol, chloroform og andre organiske opløsningsmidler. Ideelt set bruge en bred røg hætte, der kan rumme en benchtop centrifuge, vortex mixer, multi-rør vortex mixer, og multi-rør roterende mixer.
  3. Adskil det rå RNA-ekstrakt fra snavset ved centrifugering ved 14.000 x g i 10 min. Udfør alle centrifugeringstrin i de samme indstillinger for dette afsnit.
    1. Ca. 800 μL supernatant overføres til et nyt 2,0 ml mikrofugerør indeholdende 400 μL på 1,2 M NaCl og 700 μL isopropanol. Bland opløsningen forsigtigt ved inversion 5x.
    2. Udfælde RNA ved at inkubere i en almindelig (-20 °C) eller ultralav temperatur fryser (-80 °C), i mindst 1 time (eller natten over).
      STOP eller PAUSE punkt: bare holde prøverne i regelmæssig -20 °C fryser til pause i et par timer. For natten eller et længere stoppunkt opbevares prøverne i frostvæske (-80 °C).
  4. Opnå en rå RNA pellet ved centrifugering ved 18.800 x g i 15 min. Efter kassing supernatanten renses den rå RNA-pellet ved kolonnerensning ved hjælp af et minisæt (Materialetabel).
    1. Pelletsen opløses i friskfremstillede 450 μL RLT Buffer (før brug tilsættes 100 μL β-mercaptoethanol pr. 100 ml RLT-buffer, tilberedt frisk dagligt). Forbedre opløsningen af alle pellets ved at blande alle rør ved stuetemperatur i en multi-rør vortex mixer i mindst 5 min.
  5. Rens den opløste RNA-pellet ved at passere gennem den lilla minispinkolonne med et 2 ml opsamlingsrør. Centrifuger ved stuetemperatur i 1 min ved 9.000 x g og kassér den lilla minispinkolonne.
    1. Der tilsættes 0,5 volumen absolut ethanol (~225 μL) til det rensede lysat i 2 ml opsamlingsrøret. Bland opløsningen ved hjælp af den samme plastspids ved at pipettere op og ned et par gange.
  6. Opsaml det rensede RNA ved straks at overføre opløsningen til en lyserød minispinkolonne med et 2 ml opsamlingsrør. Der centrifugeres ved 9.000 x g i 15 s for at samle RNA'et på silicamembranen i den lyserøde min spin-kolonne. Esér gennemstrømningen gennem og vask RNA'et med 350 μL Buffer RW1 ved centrifugering ved 9.000 x g i 15 s.
  7. Kontamineret genomisk DNA fjernes ved tilsætning af 80 μL fortyndet DNase 1 (50 μL frosset DNase-materiale + 350 μL RDD ved hjælp af DNase-sættet) direkte på membranen og fordøjes ved stuetemperatur i mindst 15 min. (PAUSEPUNKT).
    1. DNase 1 vaskes ved tilsætning af 350 μL RW1 og spinding ned ved 9.000 x g i 15 s. Gentag to gange, men denne gang vaskes med 500 μL Buffer RPE. Overføres til et nyt 2 ml opsamlingsrør og spin ved 9.000 x g i 2 min. for at tørre.
  8. Den tørrede centrifugeringssøjle overføres til et nyt 1,5 ml nukleaserfrit opsamlingsrør. Elueringsprocessen for det rensede RNA-ekstrakt påbegyndes ved tilsætning af 50 μL nukleaserfrit vand (forvarmet ved 50 °C) og inkubering i 3 min ved 50 °C varmeblok.
    1. Efter inkubation enedes det samlede RNA-ekstrakt ved centrifugering ved 9.000 x g i 1 min. Umiddelbart lægges alle prøver på is.
  9. Kvantiteten og kvaliteten af det samlede RNA-ekstrakt bestemmes ved at køre passende fortyndinger (normalt 1:10) i Nanodrop og BioAnalyzer ved hjælp af deres respektive producentprotokoller. RNA-ekstrakter bør mindst have en RIN-værdi på 8,0, og en koncentration på 50 ng/μL. Figur 1 viser et typisk resultat for RNA-ekstrakter fremstillet af bygblade og frø.
    STOPPUNKT: Prøverne opbevares i -80 °C, indtil de tages i brug.

2. cDNA-syntese efterfulgt af cRNA-transskription og mærkning

BEMÆRK: Dette trin er velegnet til behandling af 24 prøver samtidigt. Det foreslås, at hele trinnet udføres kontinuerligt på en dag, men valgfrie stop- og pausepunkter identificeres. Sørg for at forvarme tre mikrofugerørsvarmeblokke ved 80 °C, 65 °C og 37 °C, før nedenstående trin påbegynder. Disse temperaturindstillinger ændres som angivet i nedenstående trin. For eksempel vil 37 °C varmeblokken blive sat til 40 °C, når spikeblandingen er forberedt (eller hvis den allerede er forberedt). Forbered en-farve Spike Mix, T7 Promoter Mix og cDNA master mix ved hjælp af Low Input Quick Amp Gene Expression Labeling Kit (se Tabel over materialer)baseret på producentens anvisninger. Dette præparat er afhængig af mængden af startRNA ekstrakter, som normalt spænder fra 10 til 200 NG for total RNA eller 5 ng for PolyA RNA. Vi bruger rutinemæssigt 50 ng total RNA som udgangsmateriale til microarray hybridisering2 og til den metode, der vil blive beskrevet nedenfor. Ved udarbejdelsen af en master mix til 24 prøver, tilsættes 2 ekstra reaktioner for at tage højde for pipettering variationer. Brug altid nukleaserfri mikrofugerør og nukladefrit vand i dette trin.

  1. På grund af højt udbytte fortyndes RNA-ekstraktet 100 gange for at passe inden for 50-100 ng-området. Baseret på RNA-kvantificeringsresultaterne i trin 1.9, laves en 1:100 fortynding ved at tilsætte 1 μL renset RNA-ekstrakt til 99 μL nukleaslefrit vand i et 1,5 ml mikrofugerør. Den faktiske koncentration af denne fortynding bestemmes ved hjælp af en Nanodråbe.
    1. Der forestilset endnu en enkelt RNA-prøve i 1,5 ml mikrofugerør for at lave 50 ng af det samlede RNA i et endeligt rumfang på 1,5 μL. Hold alle prøver på is.
  2. Forbered Spike Mix fra baseret på producentens anvisninger. Dette trin er også opsummeret i Püffeld et al. 20192. Brug en 37 °C varmeblok til dette. Den første og anden fortynding af enfarvespikeblandes positive kontroller i en frostfrost med ultralav temperatur (-80 °C), og gennemgår kun otte gentagne fryse-/optøningscyklusser.
    1. Forbered den tredje og fjerde fortynding frisk dagligt. Optø og opbevar den tredje og fjerde fortynding af spike mix på is før brug.
      BEMÆRK: Temperaturen i 37 °C varmeblokken omregnes til 40 °C, når spikeblandingen er fremstillet (eller hvis den tidligere er forberedt).
  3. Gør T7 Promoter Mix og opbevar på is før brug. Følgende er tilstrækkeligt til 24 prøver:
    20,8 μL T7 promotor primer
    + 26,0 μL nukle-frit vand
    = 46,8 μL af det samlede volumen T7 Promoter Mix
  4. Der tilsættes 1,8 μL T7 Promoter Primer Mix (trin 2.3) i hvert mikrofugerør, der indeholder 1,5 μL 50 NG RNA-prøve fra trin 2.1. Bland komponenterne korrekt ved pipettering flere gange. Denature RNA skabelon-primer mix ved inkubering i 65 °C varmeblok i 10 min. Straks placere microfuge rør på is som forberedelse til næste trin.
  5. Under denaturering af skabelon-primer mix (Trin 2.4), pre-varm 5x First Strand Buffer ved 80 °C i mindst 4 min. Hurtigt forberede cDNA syntese Master Mix fra Low Input Quick Amp Mærkning Kit (se Tabel af materialer) baseret på producentens anvisninger. Følgende er tilstrækkeligt til 24 reaktioner:
    52,0 μL forvarmet 5x første strandbuffer (trin 2.5)
    + 26,0 μL 0,1 m DTT
    + 13,0 μL af 10 mM dNTP mix
    + 31,2 μL RNase Block Mix
    = 122,2 μL af samlet volumen cDNA syntese Master Mix
    1. Tø hver komponent op på is. Bland hver komponent ved skånsom pipettering. Hold Master Mix ved stuetemperatur før brug.
      FORSIGTIG: RNase-blokblandingen skal straks placeres tilbage i fryseren -20 °C efter brug.
  6. Fjern RNA-skabelon-primer-blandingen på is (trin 2.4), og centrifuger kortvarigt ved stuetemperatur for at dreje alt indholdet ned til bunden af mikrofugerøret. 4,7 μL af cDNA Master Mix (trin 2.5) udleveres til hvert rør, idet det blandes omhyggeligt ved at pipettere op og ned. Den samlede volumen, når alle komponenter tilsættes, skal være 8,0 μL.
    1. Syntetiser cDNA i 2 timer i 40 °C varmeblok. Under 2 timers inkubation flyttes temperaturen på 65 °C varmeblokken til 70 °C som forberedelse til varmeinaktivering (trin 2.7).
      VALGFRIT PAUSEPUNKT: Prøverne opbevares ved -80 °C natten over. Forsøget kan fortsættes den næste dag efter varmeinaktivering (trin 2.7).
  7. Inkuber hvert rør i 70 °C varmeblok i 15 minutter for at opvarme RNase Block Mix. Rørene overføres straks på is, og der indsuges i mindst 5 minutter.
  8. Mens prøverne er på is i 5 min (Trin 2.7), hurtigt forberede Transskription Master Mix. Alle komponenter kan kombineres ved stuetemperatur, men optø komponenter på is. Følgende er tilstrækkeligt til 24 prøver:
    19,5 μL nuklelefrit vand
    + 83,2 μL 5x transskriptionsbuffer
    + 15,6 μL 0,1 m DTT
    + 26,0 μL NTP-blanding
    + 5,5 μL T7 RNA Polymerase Blanding
    + 6,2 μL cyanin 3-CTP (Cy3)
    = 156,0 μL af det samlede volumen Transskription Master Mix
    FORSIGTIG: T7 RNA Polymerase Blend skal opbevares i -20 °C fryseren og placeres tilbage umiddelbart efter brug. Desuden er Cy3 lysfølsom. Blanding (trin 2.9) og dispensering (trin 2.10) bør derfor ske under dårlige lysforhold. Til dette slukker vi normalt lyset direkte over laboratoriebænken.
  9. Da rørene blev udsat for pludselig opvarmning og afkøling (trin 2.7), skal du kortvarigt dreje ned i indholdet af hver prøve ved hjælp af en mikrocentrifuge for at samle al væsken i bunden af hvert mikrofugerør. Der tilsættes 6 μL transskriptionsmastermix (trin 2.8) ved forsigtigt at pipettere op og ned. Det samlede volumen af denne reaktion bør være 16 μL på nuværende tidspunkt. Inkuberrørene ved 40 °C i 2 timer for at generere det Cy3-mærkede cRNA.
    VALGFRIT STOPPUNKT: Rørene kan opbevares ved -80 °C efter transskription.
  10. Under generering af cRNA (trin 2.9) indstilles varmeblokkens temperatur til 55 °C. Der tilsættes mindst ét mikrofugerør nukladefrit vand i varmeblokken. Dette nukledefri vand vil blive brugt til eluering af renset cRNA.
  11. Efter cRNA-transskription og mærkning renses det mærkede cRNA ved hjælp af et RNeasy Mini Kit som beskrevet i trin 3.

3. cRNA-rensning

  1. Rens det mærkede cRNA ved hjælp af et RNeasy Mini Kit (se Materialetabel). Klargør bufferne baseret på producentens anvisninger. Buffer RPE leveres f.eks. Før brug tilsættes 4 mængder molekylærbiologisk kvalitet absolut ethanol (96-100%).
  2. Der tilsættes 84 μL nucleasefrit vand til hver prøve for at justere det samlede volumen til 100 μL. Derefter tilsættes 350 μL buffer RLT og 250 μL absolut ethanol til hvert rør. Bland grundigt ved pipettering.
  3. 700 μL af hver blanding overføres til en minispin-kolonne med et opsamlingsrør på 2 ml. Det mærkede cRNA opsamles på membranen ved centrifugering ved 4 °C i 30 s ved 7.534 x g. Kassér gennemstrømningsvæsken.
  4. Hver prøve vaskes i 500 μL Buffer RPE. Der centrifugeres og kasseres gennemstrømning som i det foregående trin. Gentag dette trin én gang, og gå derefter videre til næste trin.
  5. Overfør minispin-kolonnen til et nyt opsamlingsrør. Prøverne tørres ved centrifugering som i trin 3.3.
  6. Minispin-kolonnen overføres til et nuklefrit 1,5 ml microfuge rør, der følger med sættet. Hver mærket cRNA-prøve ved tilsætning af 30 μL nuklelefrit vand (forvarmet ved 55 °C) direkte i membranfilteret. Forbedre eluering ved inkubering i 55 °C varmeblok i 60 s.
  7. Det mærkede cRNA opsamles ved centrifugering ved stuetemperatur i 30 s ved 7.535 x g. Smid spinsøjlen og luk hvert mikrofugerør. Placer straks hvert rør på is.
    VALGFRIT STOPPUNKT: Prøverne kan opbevares ved -80 °C efter eluering.
  8. Kvantificer cRNA med Nanodrop ved hjælp af microarray funktionen. Indstil prøven til RNA-40. Der anskaf følgende værdier, og der registreres i et regneark: cyanine 3 farvestofkoncentration (pmol/μL), RNA-absorbansforholdet (260 nm/280 nm) og cRNA-koncentration (ng/μL).
    STOPPUNKT: Straks opbevares cRNA-prøverne ved -80 °C efter aflæsning.
  9. Beregn cRNA-udbyttet og den specifikke aktivitet som beskrevet i Püffeld et al. 20192.

4. Microarray hybridisering og scanning

BEMÆRK: Dette trin tager kun 3-4 timer og dermed hybridisering af 24 prøver kan startes efter frokost. En operatør kan nemt køre op til 4 dias (32 prøver). Morgenen den følgende dag er afsat til vask og scanning af microarray dias. Yderligere kørsler kan derefter udføres om eftermiddagen den anden dag. Dette trin gentages, indtil alle prøver er hybridiseret og scannet. Det anbefales stærkt at bruge farvefri, pulverfri latexhandsker til håndtering og behandling af objektglassene for at sikre, at prøverne ikke er forurenet med farvede pigmenter, der kan forstyrre mikroarrayanalyserne. Bortset fra kommercielt tilgængelige microarrays, er følgende brugerdefinerede arrays designet af vores gruppe og kan bestilles fra Agilent: Order Code 028827 for Byg (Hordeumvulgare), 054269 for Rice (Oryzasativa subs. Japonica), 054270 for Rice (Oryzasativa subs. Indica) og 048923 for Hvede (Triticumaestivum).

  1. Udfør hybridisering af mikroarrayet ved hjælp af Genekspressionshybridiseringssættet (se Materialetabel). Klargør 10x blokeringsmiddel i henhold til producentens specifikation2. Aliquot 10x Blokering Agent i 200 μL portioner og opbevares ved -20 °C indtil brug. Hver aliquot er nok til op til 40 hybridiseringer og er stabil op til 2 måneder.
  2. På dagen afsat til mikroarray hybridisering, tø en 200 μL aliquot af 10x Blokering Agent på is. Desuden forvarm hybridiseringovnen til 65 °C og forvarm en varmeblok til 60 °C til brug under cRNA-fragmentering.
  3. Klargør fragmenteringsblandingen for hver prøve som beskrevet af fabrikanten2. I vores laboratorium bruger vi rutinemæssigt 600 ng af lineært forstærket Cy3-mærket cRNA til hybridisering i et 8-pak mikroarray. I dette tilfælde opsummerer nedenstående liste komponenterne i fragmenteringsblandingen pr. prøve:
    600 ng af lineært forstærket cRNA, cyanin 3-mærket
    + 5 μL af 10x blokerende agent
    Juster volumen til 24 μL med nuclease-frit vand
    + 1 μL af 25x Fragmenteringsbuffer
    = 25 μL samlet volumenfragmenteringsblanding
    1. Bland prøver forsigtigt ved hjælp af en vortex mixer. Drej alle prøver kortvarigt ved hjælp af en mikrocentrifuge.
  4. Inkuber alle prøverne i 60 °C varmeblokken i nøjagtig 30 min. Afkøles straks hvert rør på is i et minut og fortsæt derefter hurtigt til næste trin.
  5. Hvis du vil stoppe fragmenteringsreaktionen helt, skal du tilføje 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM til hvert rør. Bland forsigtigt ved pipettering op og ned, idet du skal passe på ikke at indføre bobler under blanding. Vi bruger rutinemæssigt 25 μL hybridiseringsbuffer til at stoppe fragmenteringsreaktionen for 8-pak mikroarrayformatet.
  6. Alle rør centrifugeres i 1 min ved 15.750 x g i den omgivende rumtemperatur. Placer hurtigt alle rør på is, og lad hver prøve så hurtigt som muligt.
  7. Før du forlader laboratoriet for 17 timer natten inkubation, forberede hybridisering forsamling2 som beskrevet i videoen.
    1. KRITISK TRIN: Overfør hver hybridiseringmix og dispenser langsomt i midten af hver pakning godt, observere stor omhu for ikke at indføre nogen bobler under udlevering. Vi bruger rutinemæssigt 44 μL hybridiseringsblanding til 8-pak microarray-formatet. Anbring også 44 μL 1x Hybridization Buffer i ubrugte brønde.
    2. Sæt straks microarray-diaset med korrekt orientering oven på pakningsslidsen. Dette skal gøres meget omhyggeligt for ikke at spilde nogen væske. Luk hybridsamlingen tæt, og drej den for at kontrollere, om der ikke er indført permanente luftbobler. Alle bobler skal bevæge sig inden for pakningsdiaset.
  8. Sæt hybridisering kammer samling i hybridisering ovn rotator. Hvis du bruger 2x GEx Hybridization Buffer, skal du indstille rotationshastigheden til 10 omdrejninger i minuttet og hybridisere ved 65 °C for præcis 17 timer.
  9. Vask hybridiserede mikroarrays ved hjælp af Gene Expression Wash Buffer Kit (se Materialetabel). Klargør geneekspressionsvaskebufferne 1 og 2 på basis af producentens anvisninger2. Der tilsættes 2 ml 10% Triton X-102 til begge buffere (rent valgfrit, men stærkt anbefales for at reducere forekomsten af microarray vaskeartefakter)2.
  10. Klargør tre vaskekammerenheder som beskrevet i den foregående publikation2. Nærmere oplysninger om hvert vaskekammer er i tabel1.
  11. Aliquot 500 ml vaskebuffer 1 i en 1 L reagensflaske og lad ved stuetemperatur. Der fremstilles en ekstra 1 L reagensflaske og mærk med "Wash Buffer 1 Reuse" for at gemme vaskebufferen fra det første kammer. Derudover aliquot 500 ml Vaskebuffer 2 i en reagensflaske og inkubere i et 37 °C vandbad natten over.
    BEMÆRK: Forlad ikke laboratoriet uden at forberede trin 4.9 til 4.11. De er nødvendige for vask trin den næste dag.
  12. Den næste dag forberedes vaskebufferne som beskrevet i tabel 2. Fyld hver skål til tre fjerdedele af deres tilsvarende buffer. Hver vaskebuffer er god til op til 4-5 dias.
  13. Efter præcis 17 h af hybridisering, få en hybridisering kammer og demontere på laboratoriet bænk foret med fnug-fri papir som beskrevet i den foregående publikation2.
    1. KRITISK TRIN: Overfør mikroarraysandwichen til fad 1. Sørg for, at stregkoden i mikroarrayet vender opad i en skrå position, og undgå at nedsænke hele diaset i bufferen. Håndter hvert microarray-dias fra enderne og undgå at berøre den aktive side af sliden.
    2. Adskil de to glasglasglas ved hjælp af en pincet2. Lad pakningen glide forsigtigt ned i bunden af skål 1, samtidig med at det sikres, at mikroarray-diaset holdes fast til næste trin.
  14. KRITISK TRIN: Løft langsomt mikroarrayets glider sidelæns og overfør straks til mikroarrayracket i skål 2 som beskrevet i den foregående publikation2. Det er afgørende, at microarray dias er minimalt udsat for luft.
    1. Gentag trin 4.13 og 4.14, indtil de otte objektglas er i rack'et. Fordel mikroarrayets dias jævnt langs rack'et. Dette trin kan gøres af en operatør uden hjælp til op til 4 dias. Fastgør rackholderen og overfør hele skål 2-opsætningen til den første magnetomrører. Rør forsigtigt i nøjagtig 1 min.
  15. Under omrøring i 1 min (trin 4.14) overføres skål 3 fra mini 37 °C-inkubatoren og anbringes oven på den anden magnetomrører. Anbring forsigtigt Vaskebuffer 2 (fra 37 °C vandbad) på fad 3. Undgå boble dannelse, mens hælde.
    1. Efter 1 min omrøring er gjort (Trin 4.14), forsigtigt og langsomt løfte slide rack fra Parabol 2 og overførsel til Parabol 3. Tag rackholderen ud, og rør rundt i nøjagtigt 1 min.
  16. Løft langsomt og forsigtigt glidestativet fra fad 3. Sørg for at undgå dannelse af stødpudedråber2. Tør siderne af hver slide ved forsigtigt at røre på fnugfrit papir. Placer hver blottørret slide i en slideboks, og gentag trin 4.16, indtil alle microarray-slides er i slideboksen. Tør i ca. 15 min.
    VALGFRIT STOPPUNKT
  17. Placer hvert microarray-objektglas i en objektglasholder, så stregkoden vender opad.
    BEMÆRK: Ozonniveauerne inde i mikroarrayrummet skal være 50 ppb (100 μg/m3)eller mindre. Dette er rent valgfrit, men anbefales stærkt: Brug et ozonbarrierediascover for at undgå ozoninininnedbrydning af cyaninfarvestoffer.
  18. Anbring de monterede objektglas i scanningskarrusellen. Læg prøverne i rækkefølge baseret på stregkodenummer. Scan objektglassene med det samme ved hjælp af en microarray scanner (se Materialetabel), som beskrevet i den forrige publikation2.
  19. Efter kørslen skal du holde dataene til funktionsudtræk og QC-validering som beskrevet i den forrige publikation2.

Representative Results

Denne metode er optimeret til udvinding af prøver af frø af korn, der indeholder betydelige mængder forurenende stivelse eller sukker. Det er designet til at udtrække total RNA fra 24 frøprøver om dagen. Det bør udføres kontinuerligt på én dag, men valgfrie stop- og pausepunkter identificeres i hele protokollen. Alternativt kan læseren bruge deres foretrukne RNA ekstraktionssæt eller manuel kemisk ekstraktionsmetode. Men baseret på vores tidligere erfaringer, kommercielt tilgængelige plante RNA ekstraktionssæt er ikke egnet til frø på grund af betydelige mængder af stivelse, proteiner, sukker og / eller lipid forurening. I den beskrevne metode efterfølges en kemisk ekstraktion af rå RNA af kolonnerensning ved hjælp af et kommercielt RNA-ekstraktionssæt. Dette giver typisk RNA højere kvalitet og udbytte. Figur 1 viser resultatet af en BioAnalyzer-kørsel for at teste kvaliteten af RNA-ekstraktion ved hjælp af den metode, der er beskrevet her. Resultaterne præsenteres for bygblade (prøver 1 og 2, der repræsenterer prøver med lavt stivelsesindhold) og bygfrø (prøver 3 og 4, der repræsenterer prøver med højt stivelsesindhold). RNA-integritetsværdien (RIN) for alle prøver er 10.

Figur 1 viser en repræsentativ gel af det rensede RNA-ekstrakt, hvor kvaliteten blev testet ved hjælp af en Bioanalyzer. Prøver 1 og 2 er typiske resultater for prøver med lavt stivelsesindhold såsom bygblade, hvor yderligere rRNA-bånd fra kloroplaster er tydelige. Prøver 3 og 4 er repræsentative resultater for prøver med højt stivelsesindhold såsom bygfrø, der viser 18S og 28S rRNA. Bemærk, at der ikke kan beregnes nogen automatisk RIN-værdi for grønt plantevæv såsom bladprøver på grund af chloroplast rRNA. Integriteten og den høje kvalitet kan dog konstateres visuelt ved fraværet af nedbrydningsprodukter, der typisk fremstår som lav molekylær udtværing. RIN-værdien for prøver af frø med høj stivelse, såsom bygfrø, anvendes typisk 10 ved hjælp af den protokol, der er beskrevet i dette papir.

Derudover præsenterer vi også her et repræsentativt data for et tidskursus eksperiment af to elite byg indavlede linjer (Sofiara og Victoriana), der anvendes til analyse af maltning kvalitet19. Under maltningsprocessen omdannes stivelsetil sukker. Derfor repræsenterer prøverne væv med varierende andel af stivelse og sukkerindhold. Da den industrielle maltningsproces svarer til spiringsprocessen, blev transskriptionerne af to byglinjer, der er forskellige i deres maltningskvalitet, analyseret. RNAs blev udvundet fra spiring frø på 2, 24, 48, 72, 120, 144 og 196 h efter imbibition i biologiske treeksemplarer. RNA-præparatet og hybridiseringen af den tilpassede bygmicroarray chip blev udført som beskrevet ovenfor. Figur 2 angiver det normaliserede gitter, der er læst ud fra mikroarrayhybridiseringen i rapporten om kvalitetskontrol (QC) (figur 3) og histogrammet for deektrete signaler. Gitteret giver et eksempel på afledte signaler fra hvert hjørne af chippen, herunder baggrund og spike-in læse prikker, der anvendes til kalibrering. Histogrammet angiver afvigelsen af påviselige prikker med respektive signalintensiteter. En vellykket hybridisering giver en bred Gaussisk-formet kurve med kun mindre outliers som vist i figuren. Mislykkede hybridiseringer kan resultere i et stærkt skift i retning af den ene side ("grønne monstre").

Endelig er et repræsentativt resultat af de acceptable værdier vist i kolonne 4 i figur 3. For at angive pålideligheden af de udførte eksperimenter evalueres resultaterne yderligere ved hjælp af GeneSpring-softwaren. De indsamlede data præsenteres som hovedkomponentanalyse (PCA). PCA integrerer værdierne af udvalgte prikker (gener) som vektor. Antallet af evaluerede prikker, der bruges, kan variere fra flere hundrede til hele chippen og er afhængig af den anvendte software. Hver chip (prøve) resulterer i én værdi (vektor), der er resultatet af de integrerede signalintensiteter for de analyserede prikker. Derfor angiver den relative placering i grafen (PCA) ligheden mellem prøverne og hinanden. Jo tættere prøverne er, jo mere ens er de. Tekniske replikater bør være tættere sammen end biologiske, og biologiske replikater af en prøve bør samles tættere på hinanden end prøver fra forskellige tidspunkter, væv eller tilstande.

Figure 1
Figur 1: Elektroforesefilkørselsoversigt opnået efter kontrol af kvaliteten af RNA med Bioanalyzer. Prøver 1 og 2 er bygbladsvæv som angivet med yderligere ribosombånd fra kloroplaster. Prøver 3 og 4 er bygfrøvæv med 18S og 28S rRNA-bånd vist. En RIN faktor er ikke altid beregnet for grønne væv såsom blad, men ifølge gel, kvaliteten af RNA er meget god. RIN-værdien for prøve 3 og 4 er 10. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: QC Rapport fra vellykket byg microarray hybridisering. A + angiver registrerede signaler på nettet fra alle hjørner af chippen. Histogrammet viser antallet af signaler kategoriseret efter signalintensitet (fluorescens) som logaritme efter baggrundssubtraktion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Oversigt over kvalitetskontrol (QC) efter hybridisering og scanning. Værdierne for det hybridiserede dias er angivet i kolonne 2 (værdi), og området med acceptable værdier vises i kolonne 4. Klik her for at se en større version af dette tal.

Vask kammer forsamling Indhold og etiket Formål
Skål 1 Tøm, lad på laboratoriebænken indtil næste dag Fyld med Vaskebuffer 1 næste dag, der bruges til at adskille mikroarraydias
Skål 2 Tilføj en microarray slide rack og en lille magnetisk røre bar; etiketten med "Wash Buffer 1", skal du lade være på laboratoriebænken til næste dag Bruges til at vaske microarray slides med Wash Buffer 1 den næste dag
Skål 3 Tilføj en lille magnetisk røre bar, etiket med "Wash Buffer 2" og sted i en 37 °C mini inkubator. Bruges til at vaske microarray slides med Wash Buffer 2 den næste dag inde i 37 °C mini inkubator

Tabel 1: Forberedelse af vaskekammerets enheder.

Trin Parabol Vask buffer Temperatur Tid
Demontering 1 1 Omgivende Så hurtigt som muligt
(Trin 4.13)
Første vask 2 1 Omgivende 1 min.
(Trin 4.14)
Anden vask 3 2 37 °C 1 min.
(Trin 4.15)

Tabel 2: Inkubationstemperatur og tid til vaskekammerenheder.

Discussion

Den beskrevne metode giver meget reproducerbare resultater for højtydende OG højkvalitets RNA-ekstrakter (figur 1). Baseret på vores erfaring anbefaler vi tre biologiske replikater for en genotype, fase eller tilstand til analyse. For at kunne påvise statistisk meningsfulde forskelle skal den generelle forekomst af mRNA overvejes. Bemærk dog, at der kræves en startmængde på 200 mg vævsprøver i tre eksemplarer til RNA-ekstraktionstrinnet. For forsøg, der har en begrænset mængde prøver såsom genetisk modificerede plantematerialer, er denne metode derfor muligvis ikke hensigtsmæssig.

Under mikroarrayhybridisering er følgende trin mest kritiske: (1) indlæsning af prøverne til pakningsdiaset (trin 4.7) og (2) vask af arrays efter hybridisering (trin 4.13 og 4.14). Prøve belastning skal gøres meget omhyggeligt for at undgå boble dannelse og flydende spilde. Forsigtighed er nødvendig, når du sætter microarray dias på pakningdiaset indeholder de lastede prøver: DNA-side (med plettede sonder) skal vende nedad for at tillade hybridisering. Til vask af mikroarrays er det andet vasketrin særligt kritisk: Her skal fjernelseaf diasene fra vaskebuffer 2 udføres meget langsomt (10 s) for at undgå bufferartefakter på diasene, hvilket kan forstyrre dataindsamlingen og analyserne.

For at modtage resultater fra hybridisering eksperiment, der er berettiget til down-stream bioinformatik analyse, bør man følge et par vigtige kriterier. QC-rapporten, som genereres efter ovenstående protokols ydeevne, giver en god idé om, hvad der skal forbedres, og hvilke data der er i brugbar stand (figur 3). De første modtagne oplysninger er det visualiserede gitter (Figur 2). Her kan man direkte se, om alle områder for fluorescens udlæsning er korrekt justeret. Hvis der er et visuelt påviseligt skift, vil dette påvirke alle andre værdier (baggrund, signalintensitet osv.), og læsningen af denne chip kan ikke bruges. På oversigten (Rumlig fordeling af alle Outliers), kan man nemt få øje på enhver forurening (f.eks støv eller hår), som påvirkede resultatet. Snavs kan fjernes ved at blæse og scanne chippen igen. Histogrammet af signalplot som nævnt ovenfor bør resultere i en bred Gauss-formet kurve, med kun mindre outliers (Figur 2). Afhængigt af det analyserede væv (Figur 1) kan denne kurve se anderledes ud og kan se ud til at have to toppe eller en fremherskende top med en skulder. Dette vil ikke påvirke kvaliteten af data. Kun en stærk forflyttet top, eller høje signaler på kanterne indikerer problemer, såsom "grønne monstre" (for høj fluorescens intensiteter), som ikke kan fjernes ved vask og bør indberettes til chipproducenten. Desuden bør "Spatial Distribution graph for Median Signals" variere omkring en fælles værdi. Dette bør være i intervallet mellem 40 og 100, afhængigt af den generelle intensitet udlæsning af chippen analyseret. En anden vigtig kvalitetskontrol er evalueringen af den kraftige stigning i data: Loggrafen for spidserne i signalerne bør resultere i en lineær og regelmæssig linje. Endelig giver tabellen over "evalueringsmålinger" et godt og pålideligt overblik over de modtagne resultater. Her giver producenten en række værdier, som kan klassificeres som Excellent, Good og Evaluate (Figur 3). Ifølge vores erfaring kan nogle af værdierne ikke altid anvendes for alle chips. For risbrugerdefinerede chips var "nonControl-værdien" ofte uden for området, men påvirker ikke den videre databehandling væsentligt. Desuden kan intervallet for "NegControl" udvides, baseret på væv, organisme og generel produktion af chippen til <80. Intervallet for evaluering for værdi E1 med CV kan udvides til <9, i stedet for <8 ifølge vores erfaring. Efter dette, en ordentlig evaluering af alle chip læse data er muligt. Generelt bør man altid huske på, at uafhængige biologiske replikater altid giver det mest pålidelige resultat.

Fordelen ved denne teknik i forhold til andre metoder ligger i det faktum, at det repræsenterer en omkostningseffektiv, høj-throughput metode til transskriptionel profilering. Desuden er downstream-dataanalysepipelinen lettere og mere etableret. På trods af fordele, der er visse begrænsninger af denne teknik, såsom antallet af gener, der kan analyseres. Mikroarrayet kan kun lette analysen af gener, der tidligere har spottet sonder på arrayet. Derfor gælder denne teknik kun for plantearter med sekvenserede genomer og fuldt kommenterede gener. Vi forestiller os, at mikroarray-baserede transkriptorer fortsat vil være meget nyttige og relevante, ikke kun for genekspressionsprofilering, men også for andre downstream bioinformatikrørledninger såsom genregulerende netværksanalyser og transskriptionsomfattende foreningsundersøgelse.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde er blevet støttet under CGIAR-temaområdet Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stress-Tolerant Rice for Africa and South Asia (STRASA) Phase III og IZN (Interdisciplinary Centre for Crop Plant Research, Halle (Saale), Tyskland. Vi takker Mandy Püffeld for hendes fremragende tekniske bistand og Dr. Isabel Maria Mora-Ramirez for at dele information og erfaring med hvedechippen. Vi takker Dr. Rhonda Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Tyskland) for kommentarer og kritisk læsning af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ß-mercaptoethanol Roth 4227.3 Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies To determine quality and quantity of RNA extract
Crushed ice maker Various brands To keep samples on ice during sample processing
Dewar flask Various brands Used as liquid nitrogen container
Ethanol, absolute Roth 9065.1
Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies 5188-5242 Kit components:
2X Hi-RPM Hybridization Buffer
25X Fragmentation Buffer
10X Gene Expression Blocking Agent
Gene Expression Wash buffer Kit Agilent Technologies 5188-5325 Kit components:
Gene Expression Wash Buffer 1
Gene Expression Wash Buffer 2
Triton X-102
Heat block Various brands It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes
Hybridization oven Agilent G2545A Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.
Hybridization gasket slide kit Agilent G2534-60014
iQAir air cleaner To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area
Isopropanol Roth 9866.5
Lint-free paper, Kimwipes Kimberly-Clark Professional KC34155
Low Input Quick Amp Labeling Kit Agilent Technologies 5190-2305 Kit components:
T7 Primer
5x First Strand Buffer
0.1M DTT
10 mM dNTP Mix
AffinityScript RNAse Block Mix
5x Transcription Buffer
NTP Mix
T7 RNA Polymerase Blend
Nuclease-free water
Cyanine 3-CTP
Metal spatula, small Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.
Microarray scanner Agilent Technologies Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended
Microfuge tubes, nuclease-free Various brands 2.0 mL and 1.5 mL volume
Microcentrifuge Eppendorf 5810 R It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes
Mini incubator Labnet I5110-230V Any small incubator will do.
Mortar and pestle Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.
NaCl Sigma-Aldrich S7653-1KG
Nanodrop 1000 Peqlab / Thermofisher
Nuclease-free water Biozym 351900302
One-Color RNA Spike-In Kit Agilent 5188-5282 Kit components:
One color RNA Spike-Mix
Dilution Buffer
Ozone barrier slide cover kit Agilent G2505-60550 Optional but highly recommended
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free Stratagene Z376426
Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1) Roth A156.2
Pipette tips, nuclease free, filter tips Various brands To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
Pipettor set Various brands For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
RNA Extraction Buffer 10 mM Tri-HCl pH 8.0
150 mM LiCl
50 mM EDTA
1.5% EDTA
15 ul/mL β-mercaptoethanol		 We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Kit components:
RNeasy mini spin column (pink)
1.5 ml collection tubes
2 ml collection tubes
Buffer RLT
Buffer RW
Buffer RPE
Nuclease-free water
RNeasy Plant Mini Kit Qiagen 74904 Kit components:
RNeasy mini spin column (pink)
QIAshredder spin column (purple)
1.5 ml collection tubes
2 ml collection tubes
Buffer RLT
Buffer RLC
Buffer RW1
Buffer RPE
Nuclease-free water
Slide holders for DNA microarray scanner Agilent G2505-60525
Slide staining dish with removable rack DWK Life Sciences 900200 Fisher Scientific 08-812 We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)
Sodium chloride Roth P029.1
Ultralow temperature freezer Various brand Capable of storing sample at -80 °C
Vortex mixer Various brands At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Püffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform. Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).
  3. Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. Catalyzing plant science research with RNA-seq. Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).
  4. Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. RNA-Seq methods for transcriptome analysis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  5. Radchuk, V. V., et al. Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain. Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).
  6. Sreenivasulu, N. Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination. Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).
  7. Sreenivasulu, N., Wobus, U. Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots. Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).
  8. Butardo, V. M. Jr, et al. Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis. Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).
  9. de Guzman, M. K., et al. Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination. Scientific Reports. 7 (1), 5854 (2017).
  10. Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress. Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).
  11. Anacleto, R., et al. Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice. Plant Biotechnology Journal. , (2018).
  12. Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling. BMC Plant Biology. 9, 4 (2009).
  13. Druka, A., et al. An atlas of gene expression from seed to seed through barley development. Functional & Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).
  14. Fujita, M., et al. Rice Expression Atlas In Reproductive Development. Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).
  15. Wang, L., et al. A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice. The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).
  16. Yamakawa, H., Hakata, M. Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation. Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).
  17. Shakoor, N., et al. A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums. BMC Plant Biology. 14, 35 (2014).
  18. Yu, Y. L., et al. Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development. Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).
  19. Kochevenko, A., et al. Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress. BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).

Tags

Biokemi cDNA syntese cRNA mærkning microarray nukleinsyre hybridisering total RNA ekstraktion transkription

Erratum

Formal Correction: Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling
Posted by JoVE Editors on 06/26/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling. Two author names were updated.

The names were corrected from:

Christianne Seiler
Nese Sreeenivasulu

to:

Christiane Seiler
Nese Sreenivasulu

Opnåelse af udskriftsdata af høj kvalitet fra kornfrø ved en modificeret metode til genekspressionsprofilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Butardo Jr., V. M., Seiler, C.,… More

Butardo Jr., V. M., Seiler, C., Sreenivasulu, N., Kuhlmann, M. Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling. J. Vis. Exp. (159), e60602, doi:10.3791/60602 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter