Die mikroskalige Thermophorese erhält schnell Bindungskonstanten bei geringen Materialkosten. Entweder gekennzeichnete oder markierungsfreie mikroskalige Thermophorese ist kommerziell erhältlich; Die markierungsfreie Thermophorese ist jedoch nicht in der Lage, die Vielfalt der Wechselwirkungsmessungen zu erreichen, die mit fluoreszierenden Markierungen durchgeführt werden können. Wir bieten ein Protokoll für markierte Thermophoresemessungen an.
Die Fähigkeit, die Bindungsaffinität von Lipiden an Proteine zu bestimmen, ist ein wesentlicher Bestandteil des Verständnisses von Protein-Lipid-Wechselwirkungen beim Membrantransport, der Signaltransduktion und dem Zytoskelett-Umbau. Klassische Werkzeuge zur Messung solcher Wechselwirkungen sind die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC). Obwohl diese Ansätze mächtige Werkzeuge sind, haben sie Rückschläge. ITC erfordert große Mengen an gereinigtem Protein sowie Lipiden, die teuer und schwierig herzustellen sein können. Darüber hinaus sind sowohl ITC als auch SPR sehr zeitaufwendig, was die Kosten für die Durchführung dieser Experimente erheblich erhöhen könnte. Eine Möglichkeit, diese Einschränkungen zu umgehen, besteht darin, die relativ neue Technik der Mikroskalen-Thermophorese (MST) zu verwenden. MST ist schnell und kostengünstig, wenn kleine Probenmengen verwendet werden, um eine Sättigungskurve für ein bestimmtes Bindungsereignis zu erhalten. Derzeit stehen zwei Arten von MST-Systemen zur Verfügung. Eine Art von MST erfordert die Kennzeichnung mit einem Fluorophor im blauen oder roten Spektrum. Das zweite System beruht auf der intrinsischen Fluoreszenz aromatischer Aminosäuren im UV-Bereich. Beide Systeme erkennen die Bewegung von Molekülen als Reaktion auf die lokalisierte Induktion von Wärme durch einen Infrarotlaser. Jeder Ansatz hat seine Vor- und Nachteile. Markierungsfreie MST kann native Proteine ohne Tags verwenden; Viele Analyten, einschließlich Pharmazeutika, fluoreszieren jedoch im UV-Bereich, was die Bestimmung genauer KD-Werte beeinträchtigen kann. Im Vergleich dazu ermöglicht die markierte MST eine größere Vielfalt messbarer paarweiser Wechselwirkungen unter Verwendung fluoreszierend markierter Sonden, die an Liganden mit messbaren Absorptionen im sichtbaren Bereich im Gegensatz zu UV befestigt sind, wodurch das Potenzial für Störsignale von Analyten begrenzt wird.
Die mikroskalige Thermophorese ist eine relativ neue Technik zur Bestimmung von Dissoziationskonstanten (KD) sowie Hemmungskonstanten (IC50) zwischen biochemisch relevanten Liganden. Der führende kommerzielle Einzelhändler für MST (z. B. NanoTemper) bietet zwei beliebte MST-Technologien an: 1) labelfreie MST, die einen fluoreszierenden Tag erfordert, und 2) markierte Thermophorese, die die inhärente Fluoreszenz von Proteinen in Abhängigkeit von der Anzahl der in jedem Protein vorhandenen aromatischen Rückstände verwendet1. Ein Nachteil der markierungsfreien Thermophorese besteht darin, dass sie in den meisten Fällen keine Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zulässt. Es könnte jedoch möglich sein, Proteine ohne aromatische Aminosäuren wie Tryptophan für die Verwendung in der markierungsfreien Thermophorese zu entwickeln2.
MST misst die Bewegung von Partikeln als Reaktion auf die Induktion mikroskopischer Temperaturfelder, die von einem Infrarotlaser in derzeit verfügbaren Technologien initiiert werden1. MST kann verwendet werden, um Protein-Protein-Interaktionen, Protein-Lipid-Interaktionen, Protein-Kleinmolekül-Experimente, Wettbewerbsexperimente und sogar Interaktionen zwischen kleinen Molekülen zu messen, solange man eine ausreichende Signaltrennung erzeugen kann. Darüber hinaus ermöglicht MST die Messung von Membran-Protein-basierten Interaktionen, die entweder in Liposomen oder Nanoscheiben eingebettet sind. Die markierte Thermophorese nutzt die Verwendung fluoreszierend markierter Tags, die eine chemisch kontrollierbare Trennung des Signals zwischen Ligand und Analyt ermöglichen. KD-Werte können mittels Thermophorese für Wechselwirkungen mit Proteinbindung bei niedrigen nanomolaren Konzentrationen erhalten werden, was in den meisten Fällen eine viel niedrigere Proteinkonzentration darstellt als für die isotherme Kalorimetrie (ITC)3. Darüber hinaus hat MST keine strengen Pufferanforderungen, wie sie für die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)4 erforderlich sind, und die markierte Thermophorese kann sogar verwendet werden, um Bindungskonstanten von Proteinen von Interesse aus nicht vollständig gereinigten Proteinlösungen5 mit genetisch eingefügten fluoreszierenden Tags zu messen6. Ein Nachteil von MST ist, dass kinetische Parameter für MST wie in SPR2 nicht ohne weiteres erhalten werden können.
Thermophoresemessungen hängen von der lokalen Temperaturdifferenz einer Lösung ab. Diese Wärme kann von einem Infrarotlaser erzeugt werden. Das MST-Gerät verfügt über einen Fluoreszenzdetektor, der an einen Infrarotstrahl (IR) gekoppelt ist und Änderungen der Fluoreszenz durch lokale Konzentrationsänderungen der fluoreszierenden Moleküle an dem Punkt aufnehmen kann, an dem der IR-Laser anvisiert wird. Das MST-Gerät verwendet einen IR-gezielten Laser, der direkt mit einem Fluoreszenzdetektor gekoppelt ist, der auf den gleichen Punkt fokussiert ist, an dem die Wärme in der Lösung erzeugt wird. Dies ermöglicht eine robuste Detektion von Temperaturänderungen, die der Erschöpfung von Molekülen an der vom IR-Laser erzeugten Wärmestelle entsprechen. Die gemessene Fluoreszenz nimmt im Allgemeinen näher am IR-Laser als Reaktion auf Temperaturerhöhungen ab. Die als Ergebnis gemessenen Unterschiede können auf mehrere Faktoren zurückzuführen sein, darunter Ladung, Größe oder Solvatationsentropie. Diese Unterschiede werden als Änderungen der Fluoreszenz als Reaktion auf die Induktion von Wärme oder die Bewegung von Molekülen von heißen zu kälteren Teilen der Kapillare gemessen.
Beim Laden einer Kapillare mit einer gegebenen Lösung ist es wichtig, Luft an beiden Enden der Kapillare zu belassen und die Kapillare nicht vollständig voll zu laden. Die kommerzielle Kapillare fasst etwa 10 μL Lösung. Man kann genaue Messungen mit 5 μL Lösung erreichen, solange die Lösung bis zur Mitte der Kapillare manipuliert wird, es keine Luftblasen gibt (möglicherweise vor dem Laden der Kapillare entgasen) und man vorsichtig ist, das Rack zu laden, um die Lösung nicht aus der Mitte der Kapillare zu drängen, wo der Infrarotlaser anvisiert wird. Wenn der Laser nicht vollständig mit der Lösung in Berührung kommt, wird das Ergebnis höchstwahrscheinlich einer von drei unbrauchbaren Ausgängen für diese Konzentration sein: 1) keine oder niedrige Fluoreszenzdetektion, 2) höhere Fluoreszenzdetektion (möglicherweise mit gezacktem Peak) oder 3) Fluoreszenzdetektion innerhalb anderer Werte aus gegebener Titration, jedoch mit einem gezackten und ungerundeten Peak.
Für die markierte Thermophorese ist es optimal, ein Fluoreszenzsignal über 200 und unter 2000 Fluoreszenzeinheiten zu haben7. Das MST-Gerät verwendet einen Bereich von LED-Intensitäten von 0 bis 100, die ausgewählt werden können, um ein Signal über 200 oder unter 2000 zu erreichen. Alternativ kann man verschiedene Konzentrationen des markierten Liganden verwenden, um das Fluoreszenzsignal auf ein optimales Niveau zu modifizieren. Es ist wichtig, bei der Datenanalyse einen Cap-Scan mit einer bestimmten MST-Messung als Referenz durchzuführen, da ein schlechter Cap-Scan oft zu einem Punkt führen kann, der später als Ausreißer eingestuft werden kann. Jeder Durchlauf sollte ungefähr 30 Minuten dauern, wenn eine einzelne MST-Leistung mit einem Cap-Scan gemessen wird. Die kommerziellen Geräte ermöglichen Änderungen der MST-Leistung. In älteren Softwareversionen konnte dies von 0 auf 100 eingestellt werden; und in späteren Versionen kann man niedrige, mittlere oder hohe MST wählen. Um robuste Ablaufverfolgungen zu erhalten, muss ein Forscher möglicherweise jede dieser Ablaufverfolgungen ausprobieren und entscheiden, welche MST-Einstellung zu den robustesten Daten für eine bestimmte Interaktion führt.
Die Bestimmung der Vam7-His8-Bindung an DiC8-PA ergab ein robustes angepasstes KD für die gegebene Wechselwirkung, das eine etwas geringere Affinität aufweist als das gemessene KD von Vam7-His8 zu PA-Liposomen (unveröffentlicht). Dieser Unterschied ist höchstwahrscheinlich auf das Fehlen einer Membran zurückzuführen, was im Allgemeinen zu einer geringeren Affinität für membranspezifische Lipidbindungsinteraktionen führt und daher die Rolle des Liposomenme…
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation (MCB 1818310) an RAF unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil von der Chemical Biology Core Facility/Protein Crystallography Unit am H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH/NCI: P30-CA076292) unterstützt.
Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye | GE Healthcare | PA23031 | For protein labeleing |
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Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipid for binding experiments |