Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

Summary

A termoforese de microescala obtém constantes de ligação rapidamente a baixo custo de material. A termoforese de microescala rotulada ou sem rótulo está comercialmente disponível; no entanto, a termoforese livre de rótulos não é capaz da diversidade de medidas de interação que podem ser realizadas usando rótulos fluorescentes. Fornecemos um protocolo para medições de termoforese rotuladas.

Abstract

A capacidade de determinar a afinidade vinculante dos lipídios às proteínas é uma parte essencial da compreensão das interações proteína-lipídicas no tráfico de membranas, transdução de sinais e remodelagem citoesquelética. Ferramentas clássicas para medir tais interações incluem ressonância de plasmon superficial (SPR) e calorimetria de titulação isotermal (ITC). Embora ferramentas poderosas, essas abordagens têm contratempos. O ITC requer grandes quantidades de proteína purificada, bem como lipídios, que podem ser caros e difíceis de produzir. Além disso, o ITC e o SPR são muito demorados, o que poderia agregar significativamente ao custo de realizar esses experimentos. Uma maneira de contornar essas restrições é usar a técnica relativamente nova de termoforese de microescala (MST). O MST é rápido e econômico usando pequenas quantidades de amostra para obter uma curva de saturação para um determinado evento de vinculação. Atualmente existem dois tipos de sistemas MST disponíveis. Um tipo de MST requer rotulagem com um fluoróforo no espectro azul ou vermelho. O segundo sistema conta com a fluorescência intrínseca de aminoácidos aromáticos na faixa UV. Ambos os sistemas detectam o movimento das moléculas em resposta à indução localizada de calor de um laser infravermelho. Cada abordagem tem suas vantagens e desvantagens. O MST sem rótulos pode usar proteínas nativas não cometas; no entanto, muitos analitos, incluindo farmacêuticos, fluoresce na faixa UV, que podem interferir com a determinação de valores de KD precisos. Em comparação, o MST rotulado permite uma maior diversidade de interações paridas mensuráveis utilizando sondas fluorescentes rotuladas ligadas a ligantes com absorções mensuráveis na faixa visível em oposição à UV, limitando o potencial de interferência de sinais de analitos.

Introduction

A termoforese de microescala é uma técnica relativamente nova na determinação das constantes de desassociação (KD), bem como as constantes de inibição (_IC50) entre ligantes bioquimicamente relevantes. O principal varejista comercial para MST (por exemplo, NanoTemper) oferece duas tecnologias populares de MST: 1) Rotular MST livre exigindo uma marca fluorescente, e 2) rotulada termoforese usando a fluorescência inerente de proteínas dependentes do número de resíduos aromáticos presentes em cada ^proteína1. Uma desvantagem da termoforese sem rótulo é que, na maioria dos casos, não permite a medição de interações proteína-proteína. No entanto, pode ser possível projetar proteínas sem aminoácidos aromáticos, como o triptofano para uso na termoforese gratuita ^{de rótulo2}.

O MST mede o movimento das partículas em resposta à indução de campos de temperatura microscópicos iniciados por um laser infravermelho em tecnologias atualmente ^{disponíveis1}. O MST pode ser usado para medir interações proteína-proteína, interações proteína-lipídicas, moléculas proteicas pequenas, experimentos de competição e até interações entre pequenas moléculas, desde que se possa produzir separação de sinal suficiente. Além disso, o MST permite a medição de interações à base de proteína de membrana embutidas em lipossomos ou nanodiscos. A termoforese rotulada aproveita o uso de etiquetas fluorescentes rotuladas permitindo a separação quimicamente controlável do sinal entre ligante e analito. Os valores de KD podem ser obtidos utilizando termoforese para interações envolvendo ligação proteica em baixas concentrações de nanomolar, que na maioria dos casos é uma concentração de proteína muito menor do que a necessária para a calimeto isotermal (ITC)³. Além disso, o MST não possui requisitos rigorosos de tampão, conforme exigido para a ressonância de plasmon superficial (SPR)⁴ e a termoforese rotulada pode até mesmo ser usada para medir constantes vinculantes de proteínas de interesse de soluções proteicas não totalmente ^purificadas5 com tags fluorescentes geneticamente inseridas6. Uma desvantagem do MST é que os parâmetros cinéticos não podem ser obtidos prontamente para o MST como no ^SPR2.

As medidas de termoforese dependem da diferença de temperatura local de uma solução. Este calor pode ser gerado a partir de um laser infravermelho. O dispositivo MST tem um detector de fluorescência acoplado a um feixe infravermelho (IR) e pode captar alterações na fluorescência das mudanças de concentração locais das moléculas fluorescentes no ponto em que o laser IR é alvo. O dispositivo MST utiliza um laser direcionado ao IR acoplado diretamente a um detector de fluorescência focado no mesmo ponto em que o calor é gerado na solução. Isso permite uma detecção robusta de mudanças de temperatura correspondentes ao esgotamento das moléculas no ponto de calor gerado pelo laser IR. A fluorescência medida geralmente diminui mais perto do laser ir em resposta ao aumento da temperatura. As diferenças medidas como resultado podem ser devido a vários fatores, incluindo carga, tamanho ou entropia de solvação. Essas diferenças são medidas como mudanças na fluorescência em resposta à indução do calor ou movimento de moléculas de partes quentes a mais frias do capilar.

Ao carregar um capilar com uma determinada solução, é importante deixar o ar em cada extremidade do capilar e não carregar o capilar completamente cheio. O capilar comercial contém cerca de 10 μL de solução. Pode-se obter medições precisas com 5 μL de solução desde que a solução seja manipulada para o centro do capilar, não há bolhas de ar (potencialmente degas antes do carregamento capilar), e é preciso carregar o rack para não sacudir a solução do centro do capilar, onde o laser infravermelho é alvo. Se o laser não entrar em contato totalmente com a solução, o resultado provavelmente será uma das três saídas inutilizáveis para essa concentração: 1) não ou baixa detecção de fluorescência, 2) maior detecção de fluorescência (potencialmente com pico irregular), ou 3) detecção de fluorescência dentro de outros valores a partir dada titulação, mas com um pico irregular e não encaminhado.

Para termoforese rotulada é ideal ter um sinal de fluorescência acima de 200 e abaixo de 2000 unidades de fluorescência7. O dispositivo MST usa uma gama de intensidades led de 0 a 100, que podem ser selecionadas para alcançar um sinal acima de 200 ou abaixo de 2000. Alternativamente, pode-se usar diferentes concentrações do ligante rotulado para modificar o sinal de fluorescência a um nível ideal. É importante executar uma varredura de tampa com uma determinada medição MST como referência ao analisar dados, pois uma verificação de tampa ruim pode muitas vezes resultar em um ponto que pode ser mais tarde determinado como um outlier. Cada execução deve levar aproximadamente 30 minutos se medir uma única potência MST com uma varredura de tampa. Os dispositivos comerciais permitem alterações na potência do MST. Em versões de software mais antigas isso poderia ser definido de 0 a 100; e nas versões posteriores pode-se selecionar MST baixo, médio ou alto. Para alcançar traços robustos, um pesquisador pode precisar tentar cada um desses e decidir qual configuração do MST resulta nos dados mais robustos para uma determinada interação.

Protocol

1. Preparação de materiais Preparar soro fisco tampão de fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 e 2 mM KH2PO4, pH 7.41. Prepare o corante NTA-Atto 647 N. Diluir o estoque NTA-Atto 647 N corante para 100 nM de uma solução DMSO 100% em PBS sem Interpol. Express Vam7-His8 – Proteína como proteína de fusão em E. coli e purificar usando Ni-NTA e exclusão de tamanho cromatografia8.<sup class="xre…

Representative Results

Esta é uma saída amostral usando a análise de afinidade. O MST rotulado foi usado para determinar a constante de ligação do Vam7-His8 ao dioctanoyl solúvel (DiC8) PA de um de seus substratos naturais9. A Figura 1 apresenta os traços termoforéticos de um ensaio de uma titulação de 1:1 de DiC8 PA a partir de 500 μM contra 50 nM de Vam7-His8. Fluorescência inicial (tempo antes do laser infravermelho ligado), Tjump (tempo inicialmente após o laser infravermel…

Discussion

A determinação de Vam7-His8binding para DiC8-PA forneceu um _KD robusto para a interação dada, que é um pouco menor do que o KD medido de Vam7-His8 para lipossomos pa (inédito). Essa diferença é mais provável devido à falta de uma membrana, o que geralmente resulta em menor afinidade para interações de ligação lipídica específica da membrana e, portanto, demonstra o papel do andaime de membrana liposso para esta ^{interação11</sup…}

Materials

Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye	GE Healthcare	PA23031	For protein labeleing
Graphpad Prsim	Graphpad software
Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)	Nanotemper	MO-K022	Capillaries for MST
Monolith NT.115 machine	Nanotemper		University equipment
NTA-Atto 647 N	Sigma	2175	label for His tags
Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	P-3008	Lipid for binding experiments