Summary
Vi presenterar ett protokoll med flytande kromatografi tillsammans med tandem massa spektrometri för att identifiera och kvantifiera stora cellulära lipider i Saccharomyces cerevisiae. Den beskrivna metoden för en kvantitativ bedömning av större lipidklasser i en jästcell är mångsidig, robust och känslig.
Abstract
Lipider är strukturellt olika amfipatiska molekyler som är olösliga i vatten. Lipider är viktiga bidragsgivare till organisationen och funktionen av biologiska membran, energilagring och produktion, cellulär signalering, fordonstransport av proteiner, organelle biogenes och reglerad celldöd. Eftersom den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae är en encellig eukaryote mottaglig för grundliga molekylära analyser, hjälpte dess användning som modellorganism till att avslöja mekanismer som kopplar lipidmetabolism och intracellulära transporter till komplexa biologiska processer inom eukaryota celler. Tillgången till en mångsidig analysmetod för robust, känslig och korrekt kvantitativ bedömning av större klasser av lipider i en jästcell är avgörande för att få djupa insikter i dessa mekanismer. Här presenterar vi ett protokoll för att använda flytande kromatografi tillsammans med tandem masspektrometri (LC-MS/MS) för kvantitativ analys av större cellulära lipider av S. cerevisiae. LC-MS/MS-metoden som beskrivs är mångsidig och robust. Det möjliggör identifiering och kvantifiering av många arter (inklusive olika isobariska eller isomeric former) inom var och en av de 10 lipidklasser. Denna metod är känslig och möjliggör identifiering och kvantiering av vissa lipidarter vid koncentrationer så låga som 0,2 pmol/μL. Metoden har framgångsrikt tillämpats på att bedöma lipidomer av hela jästceller och deras renade organeller. Användningen av alternativa mobila fastillsatser för elektrosprayjonisering massa spektrometri i denna metod kan öka effektiviteten i jonisering för vissa lipidarter och kan därför användas för att förbättra deras identifiering och kvantisering.
Introduction
En mängd bevis tyder på att lipider, en av de viktigaste klasserna av biomolekyler, spelar viktiga roller i många viktiga processer inom en eukaryota cell. Dessa processer omfattar montering av lipidbilayers som utgör plasmamembran och membran kring cellulära organeller, transport av små molekyler över cellmembran, svar på förändringar i den extracellulära miljön och intracellulära signaltransduktion, generering och lagring av energi, import och export av proteiner som är begränsade till olika organeller, fordonshandel med proteiner inom endomembranesystemet och proteinutsöndringen samt flera sätt att reglera disponikeldöd1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Den spirande jäst S. cerevisiae, en encellig eukaryota organism, har framgångsrikt använts för att avslöja några av de mekanismer som ligger till grund för de väsentliga rollerna av lipider i dessa viktiga cellulära processer4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae är en värdefull modell organism för att avslöja dessa mekanismer eftersom det är mottagliga för omfattande biokemiska, genetiska, cell biologiska, kemiska biologiska, system biologiska, och mikrofluidiska dissekering analyser21,22,23,24,25. Ytterligare framsteg i förståelse mekanismer genom vilka lipidmetabolism och intracellulära transporter bidrar till dessa viktiga cellulära processer kräver känsliga massa spectrometri teknik för kvantitativ karakterisering av cellulära lipidom, förstå lipidom molekylär komplexitet, och integrera kvantitativa lipidomik i en tvärvetenskaplig plattform av systembiologi1,2,3,26, 27,28,29,30.
Nuvarande metoder för masspektrometriassisterad kvantitativa lipidomik av jästceller och celler i andra eukaryota organismer är inte tillräckligt mångsidiga, robusta eller känsliga. Dessutom är dessa metoder som för närvarande används inte kan skilja olika isobariska eller isomeric lipidarter från varandra. Här beskriver vi en mångsidig, robust och känslig metod som tillåter användning av flytande kromatografi tillsammans med tandem masspektrometri (LC-MS/MS) för kvantitativ analys av större cellulära lipider av S. cerevisiae.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av sterila medier för odling av jäst
- Förbered 90 ml av ett komplett YP-medium som innehåller 1% (w/v) jästextrakt och 2% (w/v) bactopepton.
- Förbered 90 ml av ett syntetiskt minimalt YNB-medium som innehåller 0,67% (w/v) jästkvävebas utan aminosyror, 20 mg/L L-histidin, 30 mg/L L-leucin, 30 mg/L L-lysin och 20 mg/L uracil.
- Dela upp 90 ml av hela YP-mediet lika i två 250 ml Erlenmeyer-flaskor (dvs. 45 ml vardera).
- Dela upp 90 ml av det syntetiska minimala YNB-mediet i två 250 ml Erlenmeyer-flaskor (dvs. 45 ml vardera).
- Autoklav kolvarna med YP- och YNB-media vid 15 psi/121 °C i 45 minuter före användning.
2. Jäst stam
- Använd den vilda typstammen BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).
3. Odling av jäst i hela YP-mediet med glukos
- Autoklav en 20% (w / v) lager lösning av glukos vid 15 psi/121 °C för 45 minuter före användning.
- Tillsätt 5 ml steril a20% (w/v) lagerlösning av glukos till var och en av de två Erlenmeyerkolvarna som innehåller det sterila YP-mediet för en slutlig koncentration på 2 % glukos (w/v).
- Använd en mikrobiologisk slinga för att vaccinera celler av den vilda typen stam BY4742 i var och en av de två Erlenmeyer kolvarna som innehåller YP-mediet med glukos.
- Odla cellerna över natten vid 30 °C med roterande skakningar vid 200 varv/min.
- Ta en alikvot av jästkultur. Använd en hemocytometer för att bestämma det totala antalet jästceller per ml kultur.
4. Överföra jäst till och odla dem i det syntetiska minimala YNB-mediet med glukos
- Tillsätt 5 ml steril a2% (w/v) lagerlösning av glukos till var och en av de två Erlenmeyerkolvarna som innehåller det sterila YNB-mediet till en slutlig koncentration på 2 % glukos (w/v).
- Använd en steril pipett för att överföra en volym av den övernatten jäst kultur som innehåller det totala antalet 5,0 x 107 celler i var och en av de två Erlenmeyer kolvar som innehåller YNB medium med glukos.
- Odla cellerna i minst 24 timmar (eller mer, om experimentet kräver) vid 30 °C med roterande skakning vid 200 varv/min.
5. Beredning av reagenser, labware och utrustning för lipidutvinning
- Förbered följande: 1) hög kvalitet (>99.9%) Kloroform; 2) hög kvalitet (>99.9%) Metanol. 3) 28% (v/v) ammoniumhydroxidlösning i nanorent vatten. 4) glaspärlor (syratvättade, 425-600 μM). 5) en virvel med lämplig adapter; 6) 15 mL höghastighetsglascentrifugrör med polytetrafluoretenfodrade lock. 7) 17:1 och 2:1 blandningar av kloroform och metanol; 8) en kloroform/metanol (2:1) blandning med 0,1 % ammoniumhydroxid (v/v). 9) ABC-lösning (155 mM ammoniumbikarbonat, pH = 8,0); 10) En blandning av interna lipidstandarder som utarbetats i en blandning av kloroform och metanol enligt tabell 1. och 11) 2 mL glasprovflaskor med polytetrafluoretenfodrade lock för utvinning av celllipider.
6. Beredning av reagenser, labware och utrustning för LC
- Förbered följande: 1) acetonitril/2-propanol/nano-rent vatten (65:35:5) blandning; 2) en virvel med lämplig adapter; 3) en ultraljudsonicator; 4) glasflaskor med skär för en brunnsplatta; 5) ett LC-system utrustat med en binär pump, degasser och en autosampler; 6) en C18 omvänd fas kolonn (2,1 mm; 75 mm; porstorlek 130 Å; pH-intervall på 1-11) kopplad till ett pre-column system; 7) blandning A: acetonitril/vatten (60:40); och 8) blandning B: isopropanol/acetonitril (90:10).
7. Lipidextraktion från jästceller
- Ta en alikvot av jästkultur. Använd en hemocytometer eller mät OD600 för att bestämma det totala antalet jästceller per ml kultur.
- Ta en volym jästkultur som innehåller ett totalt antal 5,0 x 107 celler (3,3 enheter OD600). Placera denna volym av kultur i en prekylerad 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 16 000 x g i 1 min vid 4 °C. Kasta supernatanten.
- Tillsätt 1,5 ml iskallt nanorent vatten och tvätta cellerna genom centrifugering vid 16 000 x g i 1 min vid 4 °C. Kasta supernatanten.
- Tillsätt 1,5 ml iskall ABC-lösning och tvätta cellerna genom centrifugering vid 16 000 x g i 1 min vid 4 °C. Kasta supernatanten. Cellpelleten kan förvaras vid -80 °C före lipidextraktion.
- För att påbörja lipidextraktionen tina cellpelleten på is.
- Återhäng cellkulanten igen i 200 μL iskallt nanorent vatten. Överför cellsuspensionen till ett 15 ml höghållfast centrifugrör med höghållfast glasskruv med ett polytetrafluoretenfodrad lock. Tillsätt följande till detta rör: 1) 25 μL av blandningen av interna lipidstandarder som bereds i kloroform/metanol (2:1) blandning; 2) 100 μL av 425-600 μM syratvättade glaspärlor. och 3) 600 μL kloroform/metanol (17:1) blandning.
- Virvel röret i hög hastighet i 5 min vid rumstemperatur (RT) för att störa cellerna.
- Vortex röret vid låg hastighet för 1 h på RT för att underlätta utvinning av lipider.
- Inkubera provet i 15 min på is för att främja proteinutfällning och separation av vatten- och organiska faser från varandra.
- Centrifugera röret i en klinisk centrifug vid 3 000 x g i 5 min vid RT. Detta centrifugeringssteg gör det möjligt att separera den övre vattenfasen från den nedre organiska fasen, som innehåller alla lipidklasser.
- Använd en borosilikatglaspipett för att överföra den nedre organiska fasen (~400 μL) till ytterligare 15 ml höghållfast glasskruvtoppcentrifugrör med ett polytetrafluoretenfodrad lock. Stör inte glaspärlorna eller övre vattenfasen under överföringen. Håll den nedre organiska fasen under flödet av kvävegas.
- Tillsätt blandningen av kloroform-metanol (2:1) till den återstående övre vattenfasen så att det kan utvinna sfingolipider och PA, PS, PI och CL. Vortex röret kraftigt i 5 min på RT.
- Centrifugera röret i en klinisk centrifug vid 3 000 x g i 5 min vid RT.
- Använd en borosilikatglaspipett för att överföra den nedre organiska fasen (~ 200 μL) som bildas efter centrifugering till den organiska fas som samlats in i steg 7.13.
- Använd flödet av kvävegas för att avdunsta lösningsmedlet i de kombinerade organiska faserna. Stäng rören som innehåller lipidfilmen under flödet av kvävegas. Förvara dessa rör vid -80 °C.
8. Separation av extraherade lipider av LC
- Tillsätt 500 μL acetonitril/2-propanol/nanorent vatten (65:35:5) blandning till ett rör som innehåller lipidfilmen som erhållits i steg 7.16. Virvel röret 3x för 10 s på RT.
- Utsätt innehållet i röret till ultraljud ultraljudsbehandling i 15 min. Vortex röret 3x för 10 s på RT.
- Ta 100 μL av ett prov från röret och tillsätt det i en glasflaska med en insats som används för en brunnsplatta. Eliminera luftbubblor i insatsen innan du går in i brunnsplattan.
- Använd ett LC-system för att separera olika lipidarter i en omvänd fas C18 kolumn CSH kopplad till ett pre-column system (se Tabell över material). Under separationen, håll kolonnen vid 55 °C och vid en flödeshastighet på 0,3 ml/min. Förvara provet i brunnsplattan på RT.
- Använd de mobila faser som består av blandning A (acetonitril/vatten [60:40 (v/v)]) och blandning B (isopropanol/acetonitrile [90:10 (v/v)]). För ett positivt sätt att detektera föräldrajoner som skapats med hjälp av joniseringskällan (ESI) innehåller ESI-läget (+) ammoniumformatet vid den slutliga koncentrationen på 10 mM. För ett negativt läge för identifiering av föräldrajoner innehåller ESI-läget (-) de mobila faserna A och B ammoniumacetat vid den slutliga koncentrationen på 10 mM.
- Använd en provvolym på 10 μL för injektionen i både ESI-läge (+) och ESI (-).
- Separera olika lipidarter med LC med hjälp av följande LC-gradient: 0-1 min 10% (fas B); 1-4 min 60% (fas B); 4-10 min 68% (fas B); 10-21 97% (fas B); 21-24 min 97% (fas B); 24-33 min 10% (fas B).
- Kör extraktionsämnen som det första provet, mellan vart fjärde prov och som det sista provet. Subtrahera bakgrunden för att normalisera data.
- En representativ total jonkrotogram från LC/MS-data från lipider som utvinns ur celler av den vilda typstammen BY4742 visas i figur 1.
9. Massspektrometrisk analys av lipider åtskilda av LC
- Använd en massspektrometer utrustad med en HESI (uppvärmd elektrosprayjonisering) jonisering) jonisering) jonisering) jonisering) jonisering) jonisering) jonisering) jonisering) jonisering) jonisering) jonisering) jonisering) för att analysera lipider som separerades med LC. Använd inställningarna i tabell 2.
- Använd Fourier transform analyzer för att upptäcka överordnade joner (MS1) med en upplösning på 60.000 och inom massintervallet 150-2,000 Da.
- Använd inställningarna i tabell 3 för att identifiera sekundära joner (MS2).
10. Identifiering och kvantifiering av olika lipidklasser och arter genom bearbetning av rådata från LC-MS/MS
- Se tabellen över material för programvara för att utföra identifiering och kvantiering av olika lipider från råa LC-MS/MS-filer. Denna programvara använder den största lipiddatabasen, som innehåller mer än 1,5 miljoner lipidjonprekursorer (MS1) och deras förväntade fragmentjoner (MS2). Programvaran använder också MS1 toppar för lipid kvantering och MS2 för lipid identifiering. Ett representativt kromatogram av två isomeric phosphatidylserin bildar (34:0) som har samma m/z värderamen olika retentiontider, as well as deras MS1 och MS2 spektra, visas i figurera 2, Figurera 3,och Figurer4,respektive.
- Sök LC-MS-råfiler som innehåller fullscan MS1-data och databeroende MS2-data gratis (oesterifierade) fettsyror (FFA), kardiovasonin (CL), fytoceramid (PHC), phytosphingosine (PHS), fosfatidylkolin (PC), fosphatidyletanola (PE), fosfatidylglycerol (PG), fostidylinositol (PI), fosfatidylserin (PS) och triacylglycerol (TAG) lipidklasser med en m/z tolerans på 5 ppm för prekursorjoner och 10 ppm för produktjoner. Andra sökparametrar visas i tabell 4. Följ instruktionerna i programbruksanvisningen. Identiteterna på interna lipidstandarder och lipidarter med ovanlig fettsyrasammansättning måste verifieras manuellt.
- För att identifiera och kvantifiera olika lipidklasser och arter med hjälp av fritt tillgängliga alternativ med öppen källkod för lipidsökprogramvaran använder du lipiddataanalysatoren (http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml),MZmine 2(http://mzmine.github.io/)eller XCMS-programvara (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)för att bearbeta rådata från LC-MS/MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår metod för en kvantitativ bedömning av större cellulära lipider i en jästcell med hjälp av LC-MS/MS var mångsidig och robust. Det tillät oss att identifiera och kvantifiera 10 olika lipidklasser i S. cerevisiae celler odlade i syntetiska minimal YNB medium som ursprungligen innehåller 2% glukos. Dessa lipidklasser inkluderar fria (oesterade) fettsyror (FFA), CL, fytoceramid (PHC), fytosphingosin (PHS), PC, PE, PG, PI, PS och TAG (Supplemental Tabell 1). Många molekylära arter av var och en av dessa klasser identifierades och kvantifierades med hjälp av denna LC-MS/MS-metod (Kompletterande tabell 1).
Vår LC-MS/MS-metod var också känslig. Det möjliggjorde identifiering och kvantifiering av molekylära arter av lipider vid koncentrationer så låga som 0,165 pmol/μL (se data för fytoceramid i tabell 5). Denna gräns för kvantiering skiljer sig åt för olika lipidklasser inom ett brett spektrum av koncentrationer (tabell 5).
Viktigt, vår metod tillåtet identifiering och kvantifiering av olika isobariska eller isomeric former av lipider. Isobariska former av lipider är lipidarter med samma nominella massa (dvs. summan av massorna av de mest rikliga isotoperna) men olika exakta massorna 31. Isomriska former av lipider är lipidarter med samma molekylära formel men med olika kemisk struktur31. Till exempel, användningen av vår LC-MS/MS-metod som skiljer mellan PHC (16:0_26:0) och isobariska lipidarter PC (16:0_10:0): även om de har samma nominella massvärde på 650, deras exakta massor är 650.6457 och 650.4755, respektive. Dessutom skiljer denna LC-MS/MS-metod mellan två par isomeric lipidarter med samma molekylära formel men olika kemiska struktur: 1) PC (18:0_18:1) och PC (20:0_16:1), med molekylär formel (C44H87N1O8P1) och exakt massa (788.6163); och 2) PE (16:0_16:0) och PE (14:0_18:0), med den molekylära formeln (C37H75N1O8P1) och exakt massa (692.5224).
Vår LC-MS/MS-metod kan användas för att öka effektiviteten i jonisering för lipider i alla klasser, vilket förbättrar identifieringen och kvantifieringen av större celllipider. En sådan förbättring kan uppnås genom användning av alternativa mobila fastillsatser för ESI MS(tabell 6). Dessa alternativa faser inkluderar ammoniumformat, ammoniumformat e med myrsyra, ammoniumacetat, ammoniumacetat med ättiksyra och ammoniumacetat med myrsyra. Var och en av dessa alternativa mobila fastillsatser kan användas för både normalfas och omvänd fas LC-kolumner(tabell 6).
En annan fördel med vår LC-MS/MS-metod är förmågan att använda två olika metoder för fragmentering av prekursorjoner (MS1) av lipider i MS2-produkter. Dessa två metoder är hög energi kollisionsdissociation (HCD) och kollision-inducerad dissociation (CID)32. Vi fann att CID-metoden är fördelaktig om den används i kombination med ammoniumacetat mobil fas tillsats för ESI (-) läge ms, eftersom det under dessa förhållanden möjliggör en ökning av effektiviteten i MS1 lipidjonfragmentering i MS2 produkter för PHC, CL, FFA, PE, PG, PI och PS(tabell 7). Däremot är HCD-metoden gynnsam om den används i kombination med ammoniumformaten siärföra dis(+) för MS:s (+) läge, eftersom det under dessa förhållanden möjliggör en ökning av effektiviteten hos MS1-lipidjonfragmentering i MS2-produkter för PC, PHS och TAG (tabell 8).
Figur 1: Den totala jonkromattogram (TIC) från flytande kromatografi/masspektrometri (LC/MS) data från lipider som extraherades från celler av vilda typstam BY4742. TIC av lipider åtskilda av LC på en omvänd fas kolumn CSH C18 och detekteras av MS av överordnade joner som skapades med hjälp av den negativa elektrospray joniseringläge. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Ett kromatogram av två isomeric fosfatidylserin former (34:0) som har samma m / z värde (M-H) på 762.5294 men olika retention gånger 7,65 min och 8,49 min. Lipiderna extraherades från celler av den vilda typen stam BY4742 och separeras med flytande kromatografi på en omvänd fas kolumn CSH C18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: MS1-spektra av två isomeric fosfatidylserinarter (34:0) som har samma m/z-värde (M-H) på 762,5294 men olika retentionstider på 7,65 min och 8,49 min. Lipiderna extraherades från celler av vilda typ stam BY4742, åtskilda av flytande kromatografi på en omvänd fas kolumn CSH C18 (som visas i figur 2)och detekteras av massa spektrometri av förälder (MS1) joner som skapades med hjälp av den negativa elektrospray jonisering läge. A)MS1-spektrumet av fosfatidylserinform (34:0) med m/z-värdet (M-H) på 762,5294 och lagringstiden på 7,65 min. (B)MS1-spektrumet av fosfatidylserinform (34:0) med m/z-värdet (M-H) på 762.5294 och retentionstiden på 8,49 min. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: MS2-spektra av två isomeric fosfatidylserinarter (34:0) som har samma m/z-värde (M-H) på 762,5294 men olika retentionstider på 7,65 min och 8,49 min. Lipiderna extraherades från celler av den vilda typstammen BY4742, åtskilda av flytande kromatografi på en omvänd faskolumn CSH C18 (som visas i figur 2)och detekterats genom masspektrometri av MS1-joner (som visas i figur 3). Sekundära joner (MS2) upptäcktes sedan av masspektrometri. A)MS2-spektrumet av fosfatidylserinform (34:0) med m/z-värdet (M-H) på 762,5294 och lagringstiden på 7,65 min. Förlusten av en serine moiety producerade en jon med m / z värde (M-H) på 675,6149. (B)MS2-spektrumet av fosfatidylserinform (34:0) med m/z-värdet (M-H) på 762,5294 och retentionstiden på 8,49 min. Förlusten av en serine moiety producerade en jon med m / z värde (M-H) på 675,8843. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Identifieringsläge | Lipidklass | Hydrofoba svans sammansättning | Beräknat m/z-värde | Koncentration (pmol/μl) |
| Negativa | Ceramide (ceramid) | 18:1_17:0 | 550.5204675 | 226 |
| Negativa | Cardiolipin (på plats) | 14:0_14:0_14:0_14:0 | 1239.839755 | 196 |
| Negativa | Fri fettsyra | 19:0 | 297.2799035 | 837 |
| Negativa | Fosfatidyletanolamin | 15:0_15:0 | 662.4766305 | 377 |
| Negativa | Fosfatidylglycerol | 15:0_15:0 | 693.4712115 | 349 |
| Negativa | Fosfatidylinositol | 17:0_20:4 | 871.5342065 | 3 |
| Negativa | Fosfatidylserin | 17:0_17:0 | 762.5290605 | 318 |
| Positiva | Fosfatidylkolin | 13:0_13:0 | 650.4755335 | 385 |
| Positiva | Phytosphingosine | 16:1 | 272.2584055 | 225 |
| Positiva | Triacylglycerol (olika) | 28:1_10:1_10:1 | 818.7232155 | 367 |
Tabell 1: Sammansättningen av en blandning av interna lipidstandarder. Interna lipidstandarder har utarbetats i kloroform/metanol (2:1) blandning. Detektionsläge avser ett positivt eller negativt läge för identifiering av överordnade joner med hjälp av en Orbitrap Velos Mass Spectrometer utrustad med elektrosprayjonisering (ESI) joniseringskälla. De beräknade m/z-värdena är för lipidernas akddukter.
| FTMS + p-upplösning | 60000 |
| Massräckvidd (dalton) | 150-2000 |
| Ion-källtyp | HESI (på honom) |
| Kapillärtemperatur (°C) | 300 |
| Värmetemperatur för källa (°C) | 300 |
| Skida gasflöde | 10 |
| Aux gasflöde | 5 |
| Positiv polaritetsspänning (kV) | 3 |
| Negativ polaritetsspänning (kV) | 3 |
| Källström (μA) | 100 |
Tabell 2: Orbitrap Velos Mass Spectrometer inställningar som används för att analysera lipider som separerades av LC. Förkortningar: FTMS + p = Fourier transform-based masspektrometri i ESI -läge (+). HESI = uppvärmd elektrosprayjonisering.
| Instrumentpolaritet | Positiva | Negativa |
| Typ av aktivering | Högenergiinducerad kollisionsdissociation | Kollision-inducerad-dissociation |
| Minimal signal krävs | 5000 | 5000 |
| Bredd för isolering | 2 | 2 |
| Normaliserad kollisionsenergi | 55 | 35 |
| Standardladdningstillstånd | 2 | 2 |
| Aktiveringstid | 0.1 | 10 |
| FTMS + C-upplösning | 7500 | |
| 5 mest intensiva toppar valdes ut för ms/ms |
Tabell 3: Orbitrap Velos Mass Spectrometer inställningar som används för att upptäcka sekundära joner (MS2). Förkortning: FTMS + C = Fourier transform-based masspektrometri i ESI (+) läge.
| Identifiering | |
| Databas | Orbitrap (omloppsbanarap) |
| Maximal upptäckt | Recall isotop (ON) |
| Sök alternativ | Produktsökning Orbitrap |
| Söktyp | Produkt |
| Experimenttyp | LC-MS |
| Tolerans för föregångare | 10 ppm |
| Produkttolerans | Högenergiinducerad kollisionsdissociation [ESI-läge (+)]: 20 ppm |
| Kollisionsinducerad dissociation [ESI (-) läge]: 0,5 Daltons | |
| Kvantitering | |
| Utföra kvantiering | På |
| m/z tolerans | -5.0; +5,0 |
| Toleranstyp | Ppm |
| Filter | |
| Toppfilter | På |
| Huvudnodfilter | Huvudisomer topp |
| tröskel värdepunkt för m-poäng | 5 |
| c-poängtröskel | 2 |
| FFA prioritet | På |
| ID-kvalitetsfilter | A: Lipidklass och alla fettsyror är helt identifierade |
| B: Lipidklass och vissa fettsyror identifieras | |
| C: Lipidklass eller FA identifieras | |
| D: Lipid identifierad av andra fragmentjoner (H2O, etc.) | |
| Lipid klass | |
| Högenergiinducerad kollisionsdissociation [ESI-läge (+) | PC, TAG |
| Kollisionsinducerad dissociation [ESI (-) läge] | CER, CL, FFA, PE, PG, PI, PS |
| Joner | |
| Högenergiinducerad kollisionsdissociation [ESI-läge (+) | + H; + NH4; + Na (na) |
| Kollisionsinducerad dissociation [ESI (-) läge] | - H. - 2H. - HCOO |
Tabell 4: De sökparametrar som används för att identifiera olika lipidklasser och arter med hjälp av lipididentifieringsprogramvaran "Lipid Search" (V 4.1). Förkortningar: CER = ceramid; CL = cardiolipin; FFA = fri (oesterifierad) fettsyra; PC = fosfatidylkolin; PE = fosfatidyletanolamin; PG = foshatidylglycerol; PI = fosfatidylinositol; PS = fosfatidylserin; TAG = triacylglycerol.
Tabell 5: De lägsta koncentrationerna av molekylära arter av olika lipidklasser som kan identifieras och mängder med hjälp av vår LC-MS/MS-metod. En uppskattning av den lägsta kvantifierbara koncentrationen för varje lipidklass baseras på MS-toppområdena för dess interna standard (dessa MS-toppområden och lipidstandardkoncentrationer visas i fetstil) och dess representativa molekylära form som finns vid den lägsta detekterbara koncentrationen. Data presenteras som medelvärden för två oberoende experiment, för var och en av dem tre tekniska replikat utfördes. Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).
| Lipidstandard | ESI-läge | Amf | AmF/FA | Amac | Amac/AA | AmAc/FA |
| Phc | - | 74 | 75.2 | 85.8 | 77 | 74.8 |
| Cl | - | 72.9 | 75.1 | 78.3 | 68.4 | 74 |
| Ffa | - | 77.1 | 77.2 | 75.5 | 84 | 72.9 |
| Pe | - | 98 | 96 | 95 | 91.5 | 86 |
| Sida | - | 64 | 45.1 | 75.9 | 60.5 | 55 |
| Pi | - | 79.3 | 76 | 82.5 | 80.3 | 77 |
| Ps | - | 73.7 | 61.6 | 85.8 | 81.4 | 73.7 |
| Pc | + | 93.5 | 86.9 | 69.3 | 60.5 | 62.7 |
| Phs | + | 89.1 | 79.2 | 78.1 | 73.7 | 69.3 |
| Etiketten | + | 92.4 | 88 | 86.9 | 80.3 | 84.7 |
Tabell 6: Effekterna av alternativa mobila fastillsatser för ESI MS på joniseringens effektivitet för lipider i olika klasser. Olika lipider separerades från varandra genom omvänd fas flytande kromatografi. Kommersiella lipidstandarder som tillhör olika klasser av lipider nämns i tabell 1. ESI-läget (-) eller ESI (+) användes för MS i närvaro av olika mobila fastillsatser. Procentandelen jonisering för varje lipidstandard visas som ett medelvärde från tre tekniska replikat. För varje lipid beräknades joniseringsprocenten baserat på MS:s toppområde. Ett värde av den högsta joniseringseffektiviteten för varje lipid visas i fetstil. Förkortningar: AmF = ammoniumformat; AmF/FA = ammoniumformat med myrsyra; AmAc = ammoniumacetat; AmAc/AA = ammoniumacetat med ättiksyra; AmAc/FA = ammoniumacetat med myrsyra; CL = cardiolipin; FFA = fri (oesterifierad) fettsyra; PC = fosfatidylkolin; PE = fosfatidyletanolamin; PG = foshatidylglycerol; PHC = fytoceramid; PHS = fytosphingosin; PI = fosfatidylinositol; PS = fosfatidylserin; TAG = triacylglycerol.
| Lipidstandard | ESI-läge | Amf | Amac |
| Phc | - | 75 | 83.8 |
| Cl | - | 70.9 | 79.3 |
| Ffa | - | 76.1 | 74.5 |
| Pe | - | 98 | 95 |
| Sida | - | 64 | 75.9 |
| Pi | - | 79.3 | 82.5 |
| Ps | - | 71.5 | 84.8 |
| Pc | + | 52.3 | 60.5 |
| Phs | + | 78.4 | 75.2 |
| Etiketten | + | 65.7 | 69.7 |
Tabell 7: Effekten av den kollisionsinducerade dissociationsmetoden (CID) på effektiviteten hos prekursorjoner (MS1) fragmentering. Kommersiella lipidstandarder som tillhör olika klasser av lipider nämns i tabell 1. ESI-läget (-) eller ESI (+) för jonisering användes för MS, i närvaro av ett ammoniumformat (AmF) eller ammoniumacetat (AmAc) mobilfastillsats. Andelen MS1-lipidjoner som var fragmenterade i MS2-produkter visas som ett medelvärde från tre tekniska replikat. För varje lipid beräknades joniseringsprocenten baserat på MS2-toppområdet. Värdet av den högsta andelen MS1-lipidjoner som var fragmenterade visas i fetstil för varje lipid (jämför med de data som presenteras i tabell 8). Detta värde är det högsta om effektiviteten i MS2 produktjonbildning är den högsta. Förkortningar: CL = cardiolipin; FFA = fri (oesterifierad) fettsyra; PC = fosfatidylkolin; PE = fosfatidyletanolamin; PG = foshatidylglycerol; PHC = fytoceramid; PHS = fytosphingosin; PI = fosfatidylinositol; PS = fosfatidylserin; TAG = triacylglycerol.
| Lipidstandard | ESI-läge | Amf | Amac |
| Phc | - | 68.4 | 65.4 |
| Cl | - | 74.3 | 75.2 |
| Ffa | - | 84.2 | 81.2 |
| Pe | - | 85.1 | 73.1 |
| Sida | - | 68.4 | 67.1 |
| Pi | - | 58.7 | 55.8 |
| Ps | - | 67.4 | 68.5 |
| Pc | + | 92.5 | 65.3 |
| Phs | + | 87.1 | 75.1 |
| Etiketten | + | 91.4 | 84.9 |
Tabell 8: Effekten av metoden för högenergikollisionsdissociation (HCD) på effektiviteten hos fragmenteringen av prekursorjoner (MS1). Kommersiella lipidstandarder som tillhör olika klasser av lipider nämns i tabell 1. ESI-läget (-) eller ESI (+) för jonisering användes för MS, i närvaro av ett ammoniumformat (AmF) eller ammoniumacetat (AmAc) mobilfastillsats. Andelen MS1-lipidjoner som var fragmenterade i MS2-produkter visas som ett medelvärde från tre tekniska replikat. För varje lipid beräknades joniseringsprocenten baserat på MS2-toppområdet. Värdet av den högsta andelen MS1-lipidjoner som var fragmenterade visas i fetstil för varje lipid (jämför med de data som presenteras i tabell 7). Detta värde är det högsta om effektiviteten i MS2 produktjonbildning är den högsta. Andra förkortningar: CL = cardiolipin; FFA = fri (oesterifierad) fettsyra; PC = fosfatidylkolin; PE = fosfatidyletanolamin; PG = foshatidylglycerol; PHC = fytoceramid; PHS = fytosphingosin; PI = fosfatidylinositol; PS = fosfatidylserin; TAG = triacylglycerol.
Kompletterande tabell 1: En lista över molekylära arter av 10 olika lipidklasser som identifierats och kvantifierats i S. cerevisiaeceller med hjälp av vår LC-MS/MS-metod. Dessa lipidklasser inkluderade fria (oesterade) fettsyror (FFA), kardiolipin (CL), fytoceramid (PHC), phytosphingosine (PHS), fosfatidylkolin (PC), fosito (PHSp), fosfat hatidyletanolamin (PE), fosfahatidylglycerol (PG), fosfatidylinositol (PI), fostidylserin (PS) och triacylglycerol (TAG). S. cerevisiae celler odlades i syntetiska minimal YNB medium ursprungligen innehåller 2% glukos. Aliquots av jästceller för lipidextraktion och LC-MS/MS analys av extraherade lipider återfanns på dag 1, 2, 3, 4, 6, 8 och 10 av odling. Alla lipidarter i varje lipidklass som identifierades i jästceller som återvunnits på olika dagar av odling visas. Några av dessa lipidarter fanns endast i kronologiskt unga jästceller återhämtade sig på dagar 1-4 av odling, andra endast i kronologiskt gamla jästceller återhämtade sig på dagar 6-10 av odling, medan vissa var närvarande i både kronologiskt unga och gamla jästceller. Den högsta MS toppområde för varje lipidart av varje lipidklass identifieras på en viss dag av odling visas. Lipid standarder för olika lipid klasser som användes för kvantering av andra arter inom denna lipidklass visas i röd färg. De beräknade m/z-värdena är för lipidernas akddukter. Förkortning: ESI (-) = MS ESI-läge (-); ESI (+) = MS:s ESI-läge (+) presenteras som medelvärden för två oberoende experiment, för var och en av dem tre tekniska replikat utfördes. Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Följande försiktighetsåtgärder är viktiga för ett framgångsrikt genomförande av det protokoll som beskrivs här:
1. Kloroform och metanol är giftiga. De extraherar effektivt olika ämnen från ytor, inklusive laboratorieplastoch din hud. Därför hantera dessa organiska lösningsmedel med försiktighet genom att undvika användning av plast i steg som innebär kontakt med kloroform och / eller metanol, med borosilikat glas pipetter för dessa steg, och skölja dessa pipetter med kloroform och metanol före användning.
2. Under lipidextraktion med metanol/kloroform (17:1) blandning, använd en borosilikat glas pipett för att överföra den nedre organiska fasen (~ 400 μL) till en 15 ml höghållfast glas skruv topp centrifugröret med en polytetrafluoretylen fodrad lock. Stör inte glaspärlorna eller övre vattenfasen under överföringen. Håll den nedre organiska fasen under flödet av kvävegas.
3. Under provberedningen för LC-MS/MS är det viktigt att eliminera alla luftbubblor i glasflaskorna innan injektionsflaskorna sätts in i en brunnsplatta.
4. För att uppnå en fullständig löslig av ammoniumformat och ammoniumacetat i mobila faser A och B före lipidseparation av LC, lös upp varje salt i 500 μL nanorent vatten innan du blandar lösningen med den mobila fasen och sonicating i 20 min.
5. Förvara inte lipidfilmen som bildas efter avdunstning av lösningsmedel under en längre tid innan den körs. Vi lagrar denna film på -80 °C i högst en vecka innan vi löser upp den i acetonitril/2-propanol/nano-rent vatten (65:35:5) blandning och sedan utsätta lipider till LC-MS/MS.
LC-MS/MS-metoden som beskrivs här är en mångsidig, robust och känslig teknik för en kvantitativ bedömning av många lipidarter som består av celllipidom av jäst eller någon annan eukaryota organism. Metoden gör det möjligt att identifiera och kvantifiera olika isobariska eller isomeric lipidarter, gör det möjligt att använda alternativa mobila fastillsatser för ESI MS för att främja lipidjonisering och göra lipididentifiering och kvantifiering effektivare, och kan använda både HCD och CID metoder för fragmentering eller aktivering av MS1 lipidjoner.
Vi använder denna LC-MS/MS-metod för att studera åldersrelaterade förändringar i cell- och organellarlipidomes under kronologiskt åldrande av den spirande jästen S. cerevisiae. Vi använder också denna metod för att undersöka hur många åldrande-fördröja genetiska, kost- och farmakologiska interventioner påverkar lipidsammansättningen av hela S. cerevisiae cellen och dess olika organeller. På grund av dess mångsidighet, robusthet och känslighet, denna LC-MS/MS-metod kan framgångsrikt användas för kvantitativ bedömning av cellulära och organellarlipidomes i eukaryota organismer över phyla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot nuvarande och tidigare medlemmar av Titorenkolaboratoriet för diskussioner. Vi erkänner Centrum för biologiska tillämpningar av masspektrometri och Centrum för strukturell och funktionell genomik (båda vid Concordia University) för enastående tjänster. Studien stöddes av bidrag från Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada (RGPIN 2014-04482) och Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. stöddes av Concordia University Merit Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
References
- Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
- Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
- Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
- Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
- Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
- Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
- Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
- Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
- Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
- Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
- Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
- Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
- Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
- Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
- Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
- Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
- Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
- Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
- Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
- Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
- Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
- Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
- Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).
