Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Entstehung von orthotopischen Bauchspeicheldrüsentumoren und die schnelle Verdauung von frisch isolierten murinen Bauchspeicheldrüsentumoren. Nach der Verdauung können lebensfähige Immunzellpopulationen für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden, einschließlich der Ex-vivo-Stimulation von T-Zellen zur intrazellulären Zytokindetektion durch Durchflusszytometrie.
In-vivo-Modelle von Bauchspeicheldrüsenkrebs bieten unschätzbare Werkzeuge zur Untersuchung von Krankheitsdynamik, Immuninfiltration und neuen therapeutischen Strategien. Das orthotopische Murinmodell kann gleichzeitig an großen Kohorten immunkompetenter Mäuse durchgeführt werden, ist relativ kostengünstig und bewahrt die Mikroumgebung des Kognaatgewebes. Die Quantifizierung von T-Zell-Infiltration und zytotoxischer Aktivität bei orthotopen Tumoren liefert einen nützlichen Indikator für eine antitumorale Reaktion.
Dieses Protokoll beschreibt die Methodik für die chirurgische Erzeugung von orthotopischen Bauchspeicheldrüsentumoren durch Injektion einer geringen Anzahl syngenischer Tumorzellen, die in einer 5-L-Kellermembran direkt in die Bauchspeicheldrüse resuspendiert werden. Mäuse, die orthotopische Tumoren tragen, brauchen etwa 30 Tage, um den Endpunkt zu erreichen, an dem Tumoren geerntet und verarbeitet werden können, um die tumorinfiltrierende T-Zellaktivität zu charakterisieren. Die schnelle enzymatische Verdauung mit Kollagenase und DNase ermöglicht die Extraktion einer einzelzelligen Suspension aus Tumoren. Die Lebensfähigkeit und Zelloberflächenmarker von Immunzellen, die aus dem Tumor extrahiert werden, bleiben erhalten; Daher ist es für mehrere nachgeschaltete Anwendungen geeignet, einschließlich der durchflussunterstützten Zellsortierung von Immunzellen für die Kultur- oder RNA-Extraktion, die Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellpopulationen. Hier beschreiben wir die Ex-vivo-Stimulation von T-Zellpopulationen zur intrazellulären Zytokinquantifizierung (IFN und TNF) und Degranulationsaktivität (CD107a) als Maß für die Gesamtzytotoxizität. Ganztumor-Digests wurden mit Phorbol-Myristateacetat und Ionomycin für 5 h in Gegenwart von Anti-CD107a-Antikörper n. Chr. stimuliert, um die Zytokinproduktion und Degranulation zu regulieren. Die Zugabe von Brefeldin A und Monensin für die letzten 4 h wurde durchgeführt, um den extrazellulären Transport zu blockieren und die Zytokindetektion zu maximieren. Die extra- und intrazelluläre Färbung von Zellen wurde dann für die Durchflusszytometrieanalyse durchgeführt, bei der der Anteil der IFN-Zellen+, TNF+ und CD107a+ CD4+ und CD8+ T quantifiziert wurde.
Diese Methode bietet eine Ausgangsbasis für eine umfassende Analyse der Tumormikroumgebung.
Diese Methode beschreibt vom Start bis zum Ende das chirurgische Verfahren zur Erzeugung orthotopischer Bauchspeicheldrüsentumoren mit einer minimalen Menge an zellulärem Material und die anschließende schnelle Dissoziation etablierter Tumoren für eine umfassende Durchflusszytometrieanalyse von Immunzellpopulationen, einschließlich ex vivo-Analyse der T-Zellfunktion.
Pankreasduktodalsocarkinom (PDAC) ist ein aggressives Karzinom mit nur 8 % der Patienten, die 5 Jahreüberleben 1. Da weniger als 20 % der Patienten für die chirurgische Resektion2in Frage kommen, sind frische Patientenproben für die Forschung nicht leicht zugänglich und daher bieten In-vivo-Modelle wesentliche Instrumente zur Untersuchung dieser Krankheit. Es gibt mehrere murine Modelle von PDAC: orthotopisch, subkutan, transgene, intravenöse und patientenabgeleitete Xenograft (PDX), ausführlich beschrieben hier3. Das hier beschriebene orthotopische Modell ermöglicht die Injektion syngenischer PDAC-Zellen in die Bauchspeicheldrüse immunkompetenter Mäuse. Dies kann in großen Kohorten von Wildtyp- oder Mutantenmäusen durchgeführt werden und bietet somit ein kostengünstiges und konsistentes Modell für den Vergleich von therapeutischen Wirkstoffen. Wichtig ist, dass das orthotopische Modell die kognitierte Mikroumgebung für das Wachstum von Tumorzellen und Metastasen in unseren Händen und anderen4 an klinisch relevante Stellen (z. B. Leber) liefert und damit klinisch relevanter ist als die subkutanen oder chemisch induzierten Modelle. Orthotopische Tumoren zeigen wichtige Merkmale von PDAC, wie eine starke desmoplastische Reaktion mit einer Fülle von Fibroblasten und extrazelluläre Matrixabscheidung5. Transgene Modelle von PDAC sind der Goldstandard des murinen Modells und das am häufigsten verwendete ist das KPC-Modell, das mutierte KrasG12D/+ und Trp53R172H/+ unter dem Pankreas-spezifischen Pdx-1-Cre Promoter6ausdrückt. Weitere KPC- und andere in vivo PDAC-Modelle werden hier überprüft7. KPC-Mäuse entwickeln spontan Bauchspeicheldrüsentumoren mit einem Krankheitsverlauf, der die Merkmale des menschlichen PDAC6originalgetreu nachbildet. Wie bei allen transgenen Modellen ist das Zuchtprogramm jedoch kostspielig, die Tumorprogression ist variabel und erfordert daher oft große Mäusekohorten. PDX-Modelle verwenden patientenabgeleitete Tumorzellen oder -stücke, die dann entweder orthotopisch oder häufiger subkutan in immungeschwächten Mäusen angebaut werden. Xenograft-Modelle bieten nützliche Werkzeuge zum Screening therapeutischer Verbindungen und berücksichtigen die Heterogenität der Patienten. Sie bieten jedoch keine vollständige Immunmikroumgebung und beschränken damit ihre Anwendungen8,9.
Einmal etabliert, orthotopische Tumoren in der Regel etwa 1 Monat oder mehr zu wachsen (abhängig von der verwendeten Zelllinie) und bilden große Tumoren, die leicht durch Ultraschall oder MRT abgebildet werden können, um progression zu verfolgen und die Behandlungswirksamkeit4,5,10. Sobald jedoch exponentielles Wachstum, die letzte Phase des Tumorwachstums kann schnell sein, so dass die meisten Behandlungsschemas relativ früh begonnen werden (z.B. 14 Tage)11,12. Das Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle bei der Tumorentwicklung, auch bei PDAC, das durch einen immunsuppressiven Tumor gekennzeichnet ist, der mit relativer Knappheit von T-Zellen und häufiger Anwesenheit von myeloiden Zellen13infiltriert ist. Eine hohe Präsenz von T-Zellen in PDAC verleiht eine bessere Prognose14,15. Als Einzelwirkstoffe haben Immun-Checkpoint-Inhibitoren, die die Immunsuppression von T-Zellen lindern, wie Anti-CTLA-416 und Anti-PD-L117,jedoch keinen klinischen Nutzen bei PDAC-Patienten gezeigt, wahrscheinlich weil die reaktivität der T-Zellen insgesamt sehr gering ist. Jedoch, Agenten, die Prime T-Zell-Antworten, wie Anti-CD40, Anti-PD-L1/CTLA-4-Resistenz18,19 und Impfung mit GM-CSF-sekretierenden allogenen PDAC-Impfstoff (GVAX) kann die Immunogenität der PDAC-Tumoren20erhöhen , was darauf hindeutet, dass die Verbesserung der T-Zell-Antworten wichtige therapeutische Möglichkeit bildet.
Entscheidend für eine antitumorale T-Zell-Antwort ist die Erkennung von tumorabgeleiteten Antigenen über den T-Zell-Rezeptor (TCR) und die anschließende Produktion von zytotoxischen Zytokinen und Granulaten. Während die T-Zell-Antigen-Erkennung durch TCR-Sequenzierung bestimmt werden kann, ist dieser Ansatz kostspielig und zeitaufwändig. Die Quantifizierung von tumorinfiltrierenden T-Zell-Teilmengen liefert jedoch einen guten Hinweis auf eine antitumorale Reaktion. Eine weitere Untersuchung der T-Zellaktivität ex vivo in Bezug auf Degranulation, Zytokinproduktion und andere zytotoxische Faktoren liefert eine tiefere funktionelle Analyse. Diese Assays können an frischen Tumorproben durchgeführt werden und viele Parameter der T-Zellfunktion können schnell durch Durchflusszytometrie gemessen werden.
CD8+ und CD4+ T-Zellen produzieren Zytokine wie IFN und TNF, um eine Immunantwort zu potenzieren21. IFN-induziert MHCI-Upregulation auf Zielzellen, induziert Differenzierung und Rekrutierung von Immunzellen und unterstützt den Zelltod. Die IFN-Produktion durch CD8+ T-Zellen ist gut charakterisiert, um Teil einer antitumoralen Reaktion zu sein und korreliert mit der Tumorregression22,23. TNF ist ein weiteres proinflammatorisches Zytokin, das sowohl von CD8+ als auch von CD4+ T-Zellen hergestellt wird. Es verbessert die TCR-abhängige Aktivierung und die Proliferation von T-Zellen und unterstützt die antitumorale Reaktion. Bei TCR-Engagement können zytotoxische CD8+ T-Zellen einer Degranulation unterzogen werden, bei der vorgebildete sekretore Lysosomen, die zytotoxische Moleküle enthalten, in die immunologische Synapse freigesetzt werden, um einen Zielzellabbau zu verursachen21. Zu diesen Molekülen gehört Perforin, ein Protein, das an die Zielzellmembran bindet und Poren bildet, die dann die Membranintegrität stören und die Diffusion21 oder Endozytose24 anderer zytotoxischer Moleküle, wie Granzyme B, direkt in das Zytoplasma der Zielzelle ermöglichen. Granzyme B ist eine Protease, die den Abbau mehrerer Proteine innerhalb der Zielzelle inszeniert, was zum Zelltodführt 21. Die Freisetzung solcher Moleküle erfordert eine Exozytose von Endosomen an die Zelloberfläche, wo der endosomale Marker CD107a (auch bekannt als LAMP-1) vorübergehend in die Zellmembran25eingearbeitet wird.
Die Messung der Zytokinsekretion durch T-Zellen erfordert deren Isolierung durch strömungsunterstützte Zellsortierung oder perlenbasierte Separationstests, die bei einer großen Anzahl von Proben gleichzeitig nicht ohne weiteres durchgeführt werden können. Die Messung von intrazellulären Zytokinen erfordert jedoch keine Vorisolationsschritte und kann leicht an mehreren Proben gleichzeitig durchgeführt werden, was einen höheren Durchsatz ermöglicht. Da Zytokine schnell von T-Zellen abgesondert werden, können die intrazellulären Ebenen nicht nachweisbar sein und daher benötigt die T-Zelle Stimulation, um die Basalzytokinproduktion zu erhöhen. Um die antigengetriebene Zytokinproduktion zu bewerten, muss das von der TCR anerkannte Antigen der T-Zelle durch ein grundiertes APC in vitro vorgelegt werden. In Fällen, in denen die Antigenspezifität nicht bekannt ist, ist ein breiter Stimulationsansatz erforderlich. Die TCR-Stimulation kann mit Anti-CD3/28-Perlen nachgeahmt werden, die sowohl TCR-Aktivierung als auch Costimulation bieten, was die Zytokinproduktion und -proliferation induziert. Eine kostengünstigere Alternative ist jedoch die Verwendung von PMA und Ionomycin, die zusammen Signalwege, die zur Synthese und Freisetzung von intrazellulären Zytokinen führen, weitgehend aktivieren. Insbesondere aktiviert PMA die Proteinkinase C (PKC) und Ionomycin erhöht intrazelluläre Ca2+-Ionen, was zu einer erhöhten Zellsignalisierung führt. Um den intrazellulären Gehalt an Zytokinen zu erhalten, kann diese Stimulation effektiv mit den Protein-Transport-Inhibitoren Brefeldin A und Monensin kombiniert werden, die Proteine im Golgi blockieren und so eine extrazelluläre Freisetzung verhindern. Die Verwendung von PMA/Ionomycin ist eine etablierte Methode zur Stimulierung von T-Zellen und es besteht eine starke Korrelation zwischen extrazellulär freigesetzten und intrazellulären Zytokinen26. Die Stimulation von T-Zellen mit PMA und Ionomycin erhöht auch den Lysosomenhandel zur Zellmembran und so wird CD107a vorübergehend auf die Zelloberfläche integriert, bevor es in die Zelle recycelt wird. Durch die Einbeziehung eines Anti-CD107a-Antikörpers während der Stimulation ist es möglich, ihn als Marker der Degranulationsaktivität25zu verwenden.
Diese Methode verdaut die Tumore schnell, um eine einzellige Suspension zu ermöglichen. An dieser Stelle können einzelne Populationen direkt für die Durchflusszytometrie gebeizt oder mit nachgeschalteten Methoden gereinigt werden: strömungsunterstützte Zellsortierung oder Magnetperlentrennung. Die Vorbereitung einer einzelzelligen Suspension für die Durchflusszytometrieanalyse ermöglicht eine Hochdurchsatzanalyse mehrerer Immunzellpopulationen und ihrer phänotypischen Marker und liefert eine genaue Quantifizierung der Immunzellzahl und des Phänotyps.
Schließlich verhindert das hier beschriebene Verdauungsprotokoll den Verlust von Zell-Oberflächen-Markern und hält die Lebensfähigkeit der Immunzellen aufrecht, so dass Immunzellen weitere Zellreinigungsschritte und Kultur nach Bedarf durchlaufen können. Diese Methode wurde jedoch nicht auf die Ableitung von Epithelzellen aus dieser Verdauung getestet.
In-vivo-Modelle von Bauchspeicheldrüsenkrebs bieten unschätzbare Werkzeuge, um das Fortschreiten der Krankheit zu verstehen und neue Therapeutika ziele3zu bewerten. Insbesondere das orthotopische Modell ist ein kostengünstiges und reproduzierbares Modell, das in großen Mäusekohorten gleichzeitig angewendet werden kann4,27. Das orthotopische Modell bietet auch die kognitierte Mikroumgebung und das intakte Immunsystem für das Tumorwachstum, was es besser geeignet macht als die subkutanen und PDX-Modelle. Wir haben jedoch festgestellt, dass einige Elemente der Immuninfiltration zwischen dem orthotopischen Modell und KPC-Mäusen, dem Goldstandard-Murine-Modell10,unterscheiden können. Ein Grund dafür könnte das beschleunigte Tumorwachstum im orthotopischen Modell sein. Weitere Unterschiede in der Dichte von Immunzell-Untergruppen wurden zwischen den orthotopischen und subkutanen Modellen3,28beschrieben. Obwohl das transgene KPC-Modell teurer und variabel6ist, sollten wichtige Befunde nach Möglichkeit in einer kleinen Kohorte von KPC-Mäusen überprüft werden.
Die Vorbereitung von Tumorzellen für die orthotopische Chirurgie ist ein kritischer Schritt im Protokoll. Zellen sollten sich immer in der Logphase des Wachstums und mykoplasma- und infektionsfrei befinden. Orthotopische Chirurgie sollte verschoben werden, wenn es irgendwelche Bedenken über Tumorzellwachstum gibt. Die Verwendung von Kellermembran verbessert die Tumorinzidenzrate gegenüber injizierenden Zellen ohne sie29 und reduziert Zelllecks und damit peritoneale Ausbreitung27. Sobald sie jedoch in der Kellermembran ausgesetzt sind, sollten Tumorzellen schnell injiziert werden (innerhalb von 2 Stunden), um Zellverlust zu vermeiden. Die Anzahl der Tumorzellen, die zur Erzeugung von Tumoren benötigt werden, ist wahrscheinlich zelllinienabhängig, und es sollte ein Bereich von Zellnummern getestet werden (z. B. von 100 – 100.000), die auch die Zeit bestimmen können, um den Endpunkt zu erreichen. Es ist wahrscheinlich, dass es eine Fehlermarge bei der Vorbereitung von 1.000 Zellen pro Maus für die Injektion geben wird; Daher sollte die Behandlung von Gruppen, wenn mehrere Tage operiert werden müssen, gleichmäßig auf Tage verteilt werden, um Chargeneffekte zu kontrollieren. Die meisten chirurgischen Schritte können je nach Vorlieben geändert werden; Es ist jedoch darauf zu achten, dass die Kellermembran nicht gestört wird, wenn die Bauchspeicheldrüse in der Bauchhöhle ersetzt oder die Peritonealwand geschlossen wird. Kellermembranlecks können Tumorzellwachstum an der Peritonealwand verursachen, die sich schnell bilden und dazu führen können, dass das Tier früher geopfert werden muss.
Idealerweise sollten Bauchspeicheldrüsentumoren nach der Ernte schnell verdaut und sofort auf ex vivo-Stimulation vorbereitet werden. Dies ist jedoch möglicherweise nicht möglich, wenn es eine große Charge von Tumoren zu ernten, in diesem Fall Tumoren sollten auf Eis gehalten und in Chargen verdaut werden. Art, Konzentration und Dauer der Exposition gegenüber Verdauungsenzymen haben gezeigt, dass sie eine große Anzahl von Oberflächenmolekülen auf den Immunzellen30,31,32beeinflussen. Die Verdauungszeit ist auch absichtlich kurz, um den Zelltod zu begrenzen33. Verdautierte Zellen können im Gefriermedium für die langfristige Lagerung eingefroren werden; jedoch tritt beim Auftauen ein gewisser Zellverlust auf. Der Verdauungsprozess kann weniger optimal sein, wenn die Tumorstücke vor der Kollagenase-Inkubation nicht ausreichend gewürfelt sind, und dies wird offensichtlich sein, da harte Tumorstücke nach der Verdauung im Filter verbleiben. Die Kollagenase-Konzentration kann gesenkt werden, wenn sie mit gesunden Bauchspeicheldrüsen- oder Tumoren im Frühstadium arbeitet; Berichte über die Extraktion gesunder Pankreasduktalzellen verwenden deutlich niedrigere Konzentrationen34. Ein hohes Maß an Epithelzelltod ist während der Verdauung zu erwarten; Immunzellen sollten den Prozess jedoch gut vertragen. Alternative Methoden existieren, um lebensfähige Epithelzellen für organoides Wachstum zu isolieren35 oder um Gewebearchitektur zu erhalten36.
Änderungen am Stimulationsprotokoll können je nach gewünschtem Auslesen und analysierten Immunzellen (z.B. Makrophagen oder B-Zellen) problemlos vorgenommen werden. Die Verwendung von Panstimulationreagenzien PMA/Ionomycin diskriminiert nicht die TCR-Antigen-Spezifität, was sie nützlich macht, wenn das Antigen nicht bekannt ist. Die Produktion von IFN ist jedoch eng mit dem TCR-Engagement37 verbunden, und sowohl die IFN-Produktion als auch die TNF-Produktion sind bei den PDAC-Antitumorreaktionen von entscheidender Bedeutung38. Die PMA/Ionomycin-Stimulation spiegelt die maximale Fähigkeit von T-Zellen zur Herstellung von Zytokinen wider, die von den T-Zellen innerhalb der Tumormikroumgebung erzeugt werden könnten oder auch nicht. Die endogene Produktion kann ohne Stimulation gemessen werden; Die Pegel können jedoch weit niedriger oder nicht nachweisbar sein. Es gibt alternative Methoden, um T-Zellen zu stimulieren: Anti-CD3/28-beschichtete Perlen, die auch kein Antigen oder sogar andere Immunzellpopulationen benötigen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, die Quantifizierung der Zytokinproduktion durch bestimmte T-Zell-Teilmengen ohne Trennmethoden zu ermöglichen. Andere Marker der Zytotoxizität (Granzym B und Perforin A), Aktivität (IL-2) oder Immunsuppression (IL-10) können ebenfalls21hinzugefügt werden. Es stehen jedoch nicht alle Zytokine und Interessensfaktoren zur Verfügung, um hochwertige Strömungszytometrie-Antikörper zu erkennen. Daher, wenn es andere Anwendungen wie ELISA erforderlich gibt, kann die Stimulation ohne die Einbeziehung von Brefeldin A/Monensin durchgeführt werden, so dass Zytokin in den Überstand freigesetzt werden kann. Allerdings wird dies eine vollständige Freisetzung von Zellzytokin ermöglichen und es wird nicht möglich sein, zu bestimmen, welche Zellpopulationen dazu beigetragen haben.
Die IFN-Produktion ist ein dominantes Merkmal einer antitumoralen T-Zell-Antwort, die häufig als Ersatz für die TCR-Antigenerkennung37,38verwendet wird. Andere In-vivo-Methoden, die antigenspezifische Reaktionen genauer definieren, nutzen Tumorzellen, die ein bekanntes Antigen exdrücken, wie Ovalbumin oder SV40. Das universelle Antigen kann dann ex vivo zur Prüfung der T-Zellerkennung oder in Kombination mit einer TCR-beschränkten Wirtsmaus verwendet werden. Wenn das Antigen unbekannt ist, kann die Quantifizierung der klonalen T-Zell-Erweiterung durch Bulk-TCR-Sequenzierung oder neuerdings durch einzellige TCR-Sequenzierung39,40durchgeführt werden. Um den Zustand der intratumoralen T-Zell-Antwort vollständig zu verstehen, sollten auch Marker gemessen werden, die auf Erschöpfung oder hemmende Rezeptoren hinweisen, einschließlich: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Neben Markern von Effektor-T-Zellen (CD44hi, CD62lo) und proliferativer Aktivität, Ki67+ oder CSFE-Verdünnung41,42,43,44. Insgesamt bietet das orthotopische Modell eine nützliche Plattform, um therapeutische Strategien schnell zu testen, insbesondere, die die antitumorale T-Zell-Antwort modulieren können, die dann auf einer kleineren Kohorte von transgenen, KPC-Mäusen validiert werden kann.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken dem Animal Technician Service und Dr. Alzbeta Talarovicova (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Vereinigtes Königreich) für ihre Unterstützung während der orthotopischen Chirurgie. Wir danken auch Dr. Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, Vereinigtes Königreich) für ihre Anleitung in der chirurgischen Technik, Dr. Cristina Ghirelli (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Vereinigtes Königreich) für ihre Beratung zur Tumorverdauung und Dr. Fabienne McClanahan (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Vereinigtes Königreich) für ihre Beratung zu Ex-vivo-T-Zellstimulationsprotokollen. Wir möchten auch dem Medical Research Council (MRC), dem Pancreatic Cancer Research Fund (PCFR) und der Ovarian Cancer Action danken, die diese Forschung finanziert haben.
6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures | Ethicon | W9500T | |
70 μm pore-size cell strainer | Fisher Scientific | 11597522 | |
9 mm Clay Adams clips | VetTech Solutions | IN015A | |
anti-CD107a PE (clone 1D4B) | Biolegend | 121612 | 1:100 to culture media |
anti-CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) | Biolegend | 46-0032 | Use at final dilution 1:50 |
anti-CD4 FITC (clone GK1.5) | eBioscience | 11-0041 | Use at final dilution 1:100 |
anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) | Biolegend | 103140 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) | Biolegend | 100738 | Use at final dilution 1:100 |
anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) | Biolegend | 505826 | Use at final dilution 1:50 |
anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) | Biolegend | 506314 | Use at final dilution 1:50 |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | BD Biosciences | 354248 | Aliquot on ice and store in -20 °C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) | eBioscience | 00-4970-03 | 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM |
Clay Adams Autoclip Applier | VetTech Solutions | IN015B | |
Clay Adams Autoclip remover | VetTech Solutions | IN015B | |
Collagenase Type V from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9263 | 2 mg/mL in media |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine | PAA | E15-810 | |
DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl | Sigma-Aldrich | D4513 | Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL |
Fixable Viability Dye 506 (FVD506) | eBioscience | 65-0866 | Use at 1:200 in PBS |
Foetal calf-serum (FCS) | GE Healthcare | A15-104 | 10% in RPMI |
Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip | Fisher Scientific | 10100332 | |
Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer | eBioscience | 88-8824-00 | Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O |
Penicillin/streptomycin | PAA | 15140122 | 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) | eBioscience | 00-4980-03 | 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM |
RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Surgical Scalpel Blade No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
Trypsin-EDTA Solution 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration |
U-bottomed 96 microwell plate | VWR | 734-2080 | |
Universal Cotton Tipped Applicators – 6 inch x 100 | Medisave | UN982 | |
V-bottomed 96 microwell plate | VWR | 735-0184 |