Este protocolo descreve a geração cirúrgica de tumores pancreatic ortotópicos e a digestão rápida de tumores pancreatic recentemente isolados do murine. Após a digestão, populações de células imunes viáveis podem ser usadas para análise a jusante, incluindo a estimulação ex vivo das células T para detecção intracelular de citocina por citometria de fluxo.
Os modelos in vivo de câncer de pâncreas fornecem ferramentas inestimáveis para o estudo da dinâmica da doença, infiltração imunológica e novas estratégias terapêuticas. O modelo ortotópico de urina pode ser realizado em grandes coortes de camundongos imunocompetentes simultaneamente, é relativamente barato e preserva o microambiente do tecido cognato. A quantificação da infiltração de células T e da atividade citotóxica dentro de tumores ortotópicos fornece um indicador útil de uma resposta antitumoral.
Este protocolo descreve a metodologia para a geração cirúrgica de tumores pancreatic ortopémicos pela injeção de um baixo número de pilhas singégicas do tumor resuspendidas na membrana do porão de 5 μL diretamente no pâncreas. Camundongos portando tumores ortotópicos levam aproximadamente 30 dias para chegar ao ponto final, momento em que os tumores podem ser colhidos e processados para caracterização da atividade de células T infiltrada tumoral. A digestão enzimática rápida usando colagem e DNase permite que uma suspensão unicelular seja extraída dos tumores. A viabilidade e os marcadores de superfície celular das células imunes extraídos do tumor são preservados; Portanto, é apropriado para múltiplas aplicações a jusante, incluindo a classificação de células assistidas por fluxo de células imunes para a cultura ou extração de RNA, análise de citometria de fluxo de populações de células imunes. Aqui, descrevemos a estimulação ex vivo das populações de células T para quantificação intracelular de citocina (IFNγ e TNFα) e atividade de degranulação (CD107a) como uma medida de citotoxicidade global. Os resumos de tumor inteiro foram estimulados com acetato e ionomicina phorbol myristate por 5 h, na presença de anticorpoanti-CD107a, a fim de upregular a produção e degranulação de citocinas. A adição de brefeldin A e monensin para o final 4 h foi realizada para bloquear o transporte extracelular e maximizar a detecção de citocina. A coloração extra e intracelular das células foi então realizada para análise de citometria de fluxo, onde a proporção de células IFNγ+,TNFα+ e CD107a+ CD4+ e CD8+ T foi quantificada.
Este método fornece uma base de partida para realizar uma análise abrangente do microambiente tumoral.
Este método detalha, do início ao fim, o procedimento cirúrgico para gerar tumores pancreáticos ortotópicos usando uma quantidade mínima de material celular e a subsequente rápida dissociação de tumores estabelecidos para análise abrangente de citometria de fluxo das populações de células imunes, incluindo a análise ex vivo da função das células T.
O adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é um carcinoma agressivo, com apenas 8% dos pacientes sobreviventes de 5 anos1. Como menos de 20% dos pacientes são elegíveis para ressecção cirúrgica2,amostras de pacientes frescos não são facilmente acessíveis para pesquisa e, portanto, os modelos in vivo fornecem ferramentas essenciais para investigar esta doença. Existem vários modelos de urina de PDAC: ortotópico, subcutâneo, transgênico, intravenoso e xenoenxerto derivado do paciente (PDX), amplamente descrito aqui3. O modelo ortotópico descrito aqui permite a injeção de células PDAC singênicas no pâncreas de camundongos imunocompetentes. Isso pode ser realizado em grandes coortes de ratos selvagens ou mutantes e, portanto, fornece um modelo econômico e consistente para comparação de agentes terapêuticos. Importante, o modelo ortotópico fornece o microambiente cognato para o crescimento celular do tumor e metástases em nossas mãos e outros4 para sites clinicamente relevantes (por exemplo, fígado), tornando-o mais clinicamente relevante do que os modelos subcutâneos ou quimicamente induzidos. Tumores ortotópicos exibem características-chave do PDAC, como uma forte reação desmoplástica com abundância de fibroblastos e deposição de matriz extracelular5. Modelos transgênicos de PDAC são o padrão-ouro do modelo de urina e o mais comumente usado é o modelo KPC, que expressa o mutante KrasG12D/+ e Trp53R172H/+ o pâncreas específico pdx-1-Cre promotor6. KPC adicional e outros modelos in vivo PDAC são revisados aqui7. Camundongos KPC desenvolvem espontaneamente tumores pancreáticos com uma progressão da doença que reproduz fielmente as características do PDAC humano6. No entanto, como para todos os modelos transgênicos, o programa de reprodução é caro, a progressão do tumor é variável e, portanto, muitas vezes requer grandes coortes de camundongos. Os modelos PDX usam células tumorais derivadas de pacientes ou pedaços que são cultivados ortotópicamente ou mais frequentemente subcutâneos em camundongos imunocomprometidos. Os modelos xenoenxerto fornecem ferramentas úteis para triagem de compostos terapêuticos e são responsáveis pela heterogeneidade do paciente. No entanto, eles não fornecem um microambiente imunológico completo, limitando assim suas aplicações8,9.
Uma vez estabelecidos, os tumores ortotópicos normalmente levam cerca de 1 mês ou mais para crescer (dependendo da linha celular usada) e formam grandes tumores que podem ser facilmente imageados por ultra-som ou ressonância magnética para rastrear a progressão e determinar a eficácia do tratamento4,5,10. No entanto, uma vez em crescimento exponencial, a última fase do crescimento do tumor pode ser rápida, de modo que a maioria dos regimes de tratamento são iniciados relativamente cedo (por exemplo, 14 dias)11,12. O sistema imunológico desempenha um papel crítico no desenvolvimento do tumor, incluindo no PDAC, que é caracterizado por um tumor imunossupressor infiltrar-se com relativa escassez de células T e presença freqüente de células mieloides13. A alta presença de células T em PDAC confere um melhor prognóstico14,15. No entanto, como agentes individuais, inibidores de pontos de verificação imunes que aliviam a imunossupressão de células T, como anti-CTLA-416 e anti-PD-L117,não mostraram benefício clínico em pacientes pdac, provavelmente porque a reatividade geral das células T é muito baixa. No entanto, os agentes que as respostas das células T prime, como anti-CD40, podem superar a resistência anti-PD-L1/CTLA-418,19 e a vacinação com a vacina PDAC alogênica (GVAX) secretada por GM-CSF pode aumentar a imunogenicidade dos tumores pdac20,indicando que melhorar as respostas às células T forma importante via terapêutica.
Fundamental para uma resposta antitumoral de células T é o reconhecimento de antígenos derivados do tumor através do receptor de células T (TCR) e da subsequente produção de citocinas citotóxicas e grânulos. Embora o reconhecimento de antígenos de células T possa ser determinado pelo sequenciamento do TCR, essa abordagem é cara e demorada. No entanto, a quantificação de subconjuntos de células T infiltradas por tumor estoneca fornece uma boa indicação de uma resposta antitumoral. Um exame mais aprofundado da atividade das células T ex vivo em termos de degranulação, produção de citocina e outros fatores citotóxicos fornece uma análise funcional mais profunda. Estes ensaios podem ser realizados em amostras tumorais frescas e muitos parâmetros da função da célula T podem ser medidos rapidamente pela citometria do fluxo.
CD8+ e CD4+ Células T produzem citocinas como IFNγ e TNFα para potencializar uma resposta imune21. Ifn’ induz mhci upregulation em células-alvo, induz diferenciação e recrutamento de células imunes e ajuda a morte celular. A produção de IFNγ por células T CD8+ é bem caracterizada como parte de uma resposta antitumoral e se correlaciona com a regressão tumoral22,23. TNFα é outra citocina proinflamatória produzida por células CD8+ e CD4+ T. Melhora a ativação dependente do TCR e a proliferação de células T, auxiliando na resposta antitumoral. Após o envolvimento do TCR, as células TCD8 + T citotóxicas podem sofrer degranulação, onde lisomas secretory pré-formados contendo moléculas citotóxicas são liberados na sinapse imunológica para causar degradação de células-alvo21. Estas moléculas incluem Perforin, uma proteína que se liga à membrana celular alvo, formando poros que, em seguida, interromper a integridade da membrana e permitir a difusão21 ou endocitose24 de outras moléculas citotóxicas, como Granzyme B, diretamente no citopplasma da célula-alvo. Granzyme B é uma protease que promulga a degradação de múltiplas proteínas dentro da célula-alvo, levando à morte celular21. A liberação de tais moléculas requer exocitose de endosomes para a superfície celular, onde o marcador endossômico CD107a (também conhecido como LAMP-1) é incorporado transitoriamente na membrana celular25.
A medição da secreção de citocina pelas células T requer seu isolamento por meio de classificação de células assistidas por fluxo ou ensaios de separação baseados em contas, que não podem ser prontamente realizados em grande número de amostras simultaneamente. No entanto, a medição de citocinas intracelulares não requer quaisquer etapas de pré-isolamento e pode ser facilmente realizada em várias amostras ao mesmo tempo, permitindo uma abordagem de taxa de maior rendimento. Como citocinas são rapidamente secretadas por células T, os níveis intracelulares podem ser indetectáveis e, portanto, a célula T requer estimulação para aumentar a produção de citocina basal. Para avaliar a produção de citocinas movidas por antígenos, o antígeno reconhecido pelo TCR deve ser apresentado à célula T por um APC preparado in vitro. Nos casos em que a especificidade do antígeno não é conhecida, é necessária uma abordagem ampla de estimulação. Estimulação TCR pode ser imitado usando contas anti-CD3/28 que fornecem ativação TCR e coestimulação, o que induz a produção e proliferação de citocina. No entanto, uma alternativa mais econômica é o uso de PMA e ionomicina, que juntos ativam amplamente as vias de sinalização que levam à síntese e liberação de citocinas intracelulares. Especificamente, pma ativa proteína quinase C (PKC) e ionomicina levanta intracelular Ca2 + íons, levando ao aumento da sinalização celular. A fim de preservar o conteúdo intracelular de citocinas, esta estimulação pode ser efetivamente combinada com inibidores de transporte de proteínabrefeldina A e monensina, que bloqueiam proteínas no Golgi e, assim, impedem a liberação extracelular. O uso de PMA/ionomicina é um método bem estabelecido para estimular as células T e há uma forte correlação entre citocinas extracelulares e intracelulares26. A estimulação das células T com PMA e ionomicina também aumenta o tráfico de lisosome para a membrana celular e, portanto, CD107a torna-se transitóriamente integrado na superfície celular antes de ser reciclado na célula. Ao incluir um anticorpo anti-CD107a durante a estimulação, é possível usá-lo como um marcador de atividade de degranulação25.
Este método digere rapidamente os tumores para fornecer uma suspensão unicelular. Neste ponto, as populações individuais podem ser diretamente manchadas para citometria de fluxo ou purificadas por métodos a jusante: classificação de células assistidas por fluxo ou separação de contas magnéticas. A preparação de uma suspensão unicelular para análise de citometria de fluxo permite uma análise de alta taxa de taxa de produtividade de múltiplas populações de células imunes e seus marcadores fenotípicos, proporcionando uma quantificação precisa do número de células imunes e fenótipo.
Finalmente, o protocolo de digestão descrito aqui impede a perda de marcadores de superfície celular e mantém a viabilidade das células imunes, permitindo que as células imunes passem por mais passos de purificação celular e cultura, conforme necessário. No entanto, este método não foi testado para derivar células epiteliais desta digestão.
Os modelos in vivo de câncer de pâncreas fornecem ferramentas inestimáveis para entender a progressão da doença e avaliar novas metas terapêuticas3. O modelo ortotópico, em particular, é um modelo rentável e reproduzível que pode ser aplicado em grandes coortes de camundongos simultaneamente4,27. O modelo ortotópico também fornece o microambiente cognato e o sistema imunológico intacto para o crescimento do tumor, tornando-o mais apropriado do que os modelos subcutâneos e PDX. No entanto, descobrimos que alguns elementos da infiltração imunológica podem diferir entre o modelo ortotópico e camundongos KPC, o modelo murine padrão-ouro10. Uma razão para isso poderia ser o crescimento acelerado do tumor visto no modelo ortotópico. Outras diferenças na densidade de subconjuntos de células imunes foram descritas entre os modelos ortotópicos e subcutâneos3,28. Portanto, embora o modelo KPC transgênico seja mais caro e variável6,os principais achados devem ser verificados em uma pequena coorte de camundongos KPC sempre que possível.
A preparação de pilhas do tumor para a cirurgia ortotópica é uma etapa crítica no protocolo. As células devem estar sempre na fase de registro de crescimento e mycoplasma- e sem infecção. A cirurgia ortotópica deve ser adiada se houver alguma preocupação com o crescimento das células tumorais. O uso da membrana do porão melhora a taxa de incidência do tumor sobre pilhas de injeção sem ela29 e reduz o escapamento da pilha e assim a propagação peritoneal27. Entretanto, uma vez suspendido na membrana do porão, as pilhas do tumor devem ràpida ser injetadas (dentro de 2 horas) para evitar toda a perda de pilha. O número de células tumorais necessárias para gerar tumores é susceptível de ser dependente da linha celular, e uma série de números celulares devem ser testados (por exemplo, de 100 – 100.000), que também pode determinar o tempo para chegar ao ponto final. É provável que haja uma margem de erro ao preparar 1.000 células por camundongo para injeção; Portanto, se vários dias de cirurgia são necessários, o tratamento de grupos deve ser distribuído igualmente ao longo dos dias para controlar os efeitos do lote. A maioria dos passos cirúrgicos pode ser modificada dependendo das preferências; entretanto, o cuidado deve ser tomado para não perturbar a membrana do porão ao substituir o pâncreas na cavidade abdominal ou em fechar a parede peritoneal. O escapamento da membrana do porão pode causar o crescimento da pilha do tumor na parede peritoneal, que dão forma ràpida e podem conduzir a ter que sacrificar mais cedo o animal.
Idealmente, os tumores pancreatic devem ràpida ser digeridos após a colheita e preparados para a estimulação do ex vivo imediatamente. No entanto, isso pode não ser possível se houver um grande lote de tumores para colher, neste caso, os tumores devem ser mantidos no gelo e digeridos em lotes. O tipo, concentração e comprimento de exposição a enzimas digestivas têm sido mostrados para afetar um grande número de moléculas de superfície nas células imunes30,31,32. O tempo de digestão também é deliberadamente curto para limitar a morte celular33. As células digeridas podem ser congeladas em meio congelante para armazenamento a longo prazo; no entanto, alguma perda celular ocorrerá ao descongelar. O processo de digestão pode ser menos do que ideal se as partes do tumor não forem cortadas suficientemente antes da incubação da colagem e esta será evidente porque as partes duras do tumor permanecerão no filtro após a digestão. A concentração de colagem pode ser reduzida se trabalhar com pâncreas saudável ou tumores em estágio inicial; relatórios sobre a extração de células ductais pancreáticas saudáveis usam concentrações significativamente mais baixas34. Um alto grau de morte de células epiteliais é de se esperar durante a digestão; no entanto, as células imunes devem tolerar bem o processo. Existem métodos alternativos para isolar células epiteliais viáveis para o crescimento organóide35 ou para preservar a arquitetura do tecido36.
Modificações no protocolo de estimulação podem ser feitas facilmente, dependendo da leitura desejada e célulaimune analisada (por exemplo, macrófagos ou células B). O uso de reagentes de estimulação pan-PMA/ionomicina não discrimina a especificidade do antígeno TCR, tornando-o útil quando o antígeno não é conhecido. No entanto, a produção de IFNestá intimamente associada ao engajamento do TCR37 e tanto a produção ifn’ quanto a tnfα são críticas nas respostas antitumorais do PDAC38. Estimulação PMA/ionomicina reflete a capacidade máxima das células T para produzir citocinas, que podem ou não ser produzidas pelas células T dentro do microambiente tumoral. A produção endógena pode ser medida sem a necessidade de estimulação; no entanto, os níveis podem ser muito mais baixos ou indetectáveis. Existem métodos alternativos para estimular as células T: contas revestidas de anti-CD3/28, que também não exigem antígeno ou mesmo outras populações de células imunes. O benefício deste método é permitir a quantificação da produção de citocina por subconjuntos específicos de células T sem a necessidade de métodos de separação. Outros marcadores de citotoxicidade (granzyme B e Perforin A), atividade (IL-2) ou imunossupressão (IL-10) também podem ser adicionados21. No entanto, anticorpos de citometria de fluxo de alta qualidade não estão disponíveis para detectar todas as citocinas e fatores de interesse. Portanto, se houver outras aplicações, como elisa necessária a estimulação pode ser realizada sem a inclusão de brefeldin A / monensina, permitindo a liberação de citocina no supernatant. No entanto, de nota, isso permitirá a liberação total de citocinas celulares e não será possível determinar quais populações celulares contribuíram.
A produção de IFNγ é uma característica dominante de uma resposta antitumoral da pilha de T, usada frequentemente como um substituto para o reconhecimento do TCR-antígeno37,38. Outros métodos in vivo que definem com mais precisão as respostas específicas de antígeno utilizam células tumorais expressando um antígeno conhecido, como Ovalbumin ou SV40. O antígeno universal pode então ser usado ex vivo para testar o reconhecimento de células T ou em combinação com um mouse hospedeiro restrito ao TCR. Alternativamente, onde o antígeno é desconhecido, a quantificação da expansão clonal de células T pode ser realizada por sequenciamento em massa-TCR, ou mais recentemente sequenciamento de TCR unicelular39,40. Para compreender completamente o estado da resposta intratumoral da pilha de T, os marcadores indicativos de receptores da exaustão ou inibitório devem igualmente ser medidos que incluem: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Além de marcadores de células T efetivas (CD44hi,CD62lo)e atividade proliferativa, ki67+ ou diluição CSFE41,42,43,44. No geral, o modelo ortotópico fornece uma plataforma útil para testar rapidamente estratégias terapêuticas, em particular que podem modular a resposta antitumoral de células T, que pode ser validada em uma coorte menor de camundongos transgênicos, KPC.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer ao Serviço técnico em animais e ao Dr. Alzbeta Talarovicova (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londres, Reino Unido) por sua assistência durante a cirurgia ortotópica. Gostaríamos também de agradecer ao Dr. Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, Reino Unido) por sua orientação em técnica cirúrgica, Dr. Cristina Ghirelli (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londres, Reino Unido) por seu conselho sobre a digestão do tumor e Dr. Fabienne McClanahan (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londres, Reino Unido) por seu conselho sobre protocolos de estimulação de células t vivo ex. Também gostaríamos de agradecer ao Medical Research Council (MRC), Pancreatic Cancer Research Fund (PCFR) e Ovarian Cancer Action, que financiaram esta pesquisa.
6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures | Ethicon | W9500T | |
70 μm pore-size cell strainer | Fisher Scientific | 11597522 | |
9 mm Clay Adams clips | VetTech Solutions | IN015A | |
anti-CD107a PE (clone 1D4B) | Biolegend | 121612 | 1:100 to culture media |
anti-CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) | Biolegend | 46-0032 | Use at final dilution 1:50 |
anti-CD4 FITC (clone GK1.5) | eBioscience | 11-0041 | Use at final dilution 1:100 |
anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) | Biolegend | 103140 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) | Biolegend | 100738 | Use at final dilution 1:100 |
anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) | Biolegend | 505826 | Use at final dilution 1:50 |
anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) | Biolegend | 506314 | Use at final dilution 1:50 |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | BD Biosciences | 354248 | Aliquot on ice and store in -20 °C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) | eBioscience | 00-4970-03 | 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM |
Clay Adams Autoclip Applier | VetTech Solutions | IN015B | |
Clay Adams Autoclip remover | VetTech Solutions | IN015B | |
Collagenase Type V from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9263 | 2 mg/mL in media |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine | PAA | E15-810 | |
DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl | Sigma-Aldrich | D4513 | Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL |
Fixable Viability Dye 506 (FVD506) | eBioscience | 65-0866 | Use at 1:200 in PBS |
Foetal calf-serum (FCS) | GE Healthcare | A15-104 | 10% in RPMI |
Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip | Fisher Scientific | 10100332 | |
Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer | eBioscience | 88-8824-00 | Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O |
Penicillin/streptomycin | PAA | 15140122 | 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) | eBioscience | 00-4980-03 | 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM |
RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Surgical Scalpel Blade No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
Trypsin-EDTA Solution 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration |
U-bottomed 96 microwell plate | VWR | 734-2080 | |
Universal Cotton Tipped Applicators – 6 inch x 100 | Medisave | UN982 | |
V-bottomed 96 microwell plate | VWR | 735-0184 |