Summary
Detta protokoll beskriver den kirurgiska generationen av ortotopiska pankreastumörer och den snabba nedbrytning av nyligen isolerade murin pankreastumörer. Efter matsmältningen kan livskraftiga immun cells populationer användas för ytterligare nedströms analys, inklusive ex vivo stimulering av T-celler för intracellulär cytokindetektion genom flödescytometri.
Abstract
In vivo modeller av pankreascancer ger ovärderliga verktyg för att studera sjukdomsdynamik, immun infiltration och nya terapeutiska strategier. Den ortotopiska murin modellen kan utföras på stora kohorter av immunkompetenta möss samtidigt, är relativt billigt och bevarar den besläktat vävnad microenvironment. Kvantifiering av T cell infiltration och cytotoxisk aktivitet inom ortotopiska tumörer ger en användbar indikator på en antitumöreffekt svar.
Detta protokoll beskriver metoden för kirurgisk generering av ortotopisk pankreastumörer genom injektion av ett lågt antal uterustransplantat tumörceller återsuspenderas i 5 μl basalmembran direkt i bukspottkörteln. Möss som bär ortotopiska tumörer tar cirka 30 dagar att nå Endpoint, varvid tumörer kan skördas och bearbetas för karakterisering av tumörinfiltrerande T-cellsaktivitet. Snabb enzymatisk nedbrytning med hjälp av kollagenas och DNase gör att en encellig suspension kan extraheras från tumörer. Livskraften och cellytan markörer för immunceller som utvinns ur tumören bevaras; Därför är det lämpligt för flera nedströms applikationer, inklusive flödesassisterad cell sortering av immunceller för odling eller RNA-extraktion, flödescytometri analys av immun cells populationer. Här beskriver vi ex vivo -stimulering av T-cellpopulationer för intracellulär cytokinkvantifiering (IFNγ och TNFα) och degranuleringsaktivitet (CD107a) som ett mått på total cytotoxicitet. Hela-tumör smälter stimulerades med phorbol myristate acetat och ionomycin för 5 h, i närvaro av anti-CD107a antikropp för att upregulate cytokin produktion och degranulering. Tillägget av brefeldin A och monensin för den slutliga 4 h utfördes för att blockera extracellulära transport och maximera cytokin upptäckt. Extra-och intra-cellulär färgning av celler utfördes sedan för flödescytometri analys, där andelen av IFNγ+, TNFα+ och CD107a+ CD4+ och CD8+ T celler kvantifierades.
Denna metod ger en utgångspunkt för att utföra omfattande analys av tumören mikromiljö.
Introduction
Denna metod detaljer, från start-till-avslut, det kirurgiska förfarandet för att generera ortotopisk pankreastumörer med en minimal mängd av cellulära material och efterföljande snabb dissociation av etablerade tumörer för omfattande flödescytometri analys av immunceller, inklusive ex vivo analys av T-cells funktion.
Pankreascancer duktal adenocarcinom (PDAC) är en aggressiv carcinoma med endast 8% av patienterna överlevande 5 år1. Eftersom mindre än 20% av patienterna är berättigade till kirurgisk resektion2, är färska patientprover inte lättillgängliga för forskning och därmed in vivo -modeller ger viktiga verktyg för att undersöka denna sjukdom. Det finns flera murina modeller av PDAC: ortoämne, subkutan, transgena, intravenös och patient-derived xenograft (PDX), utförligt beskrivs här3. Den neobladder modell som beskrivs här tillåter injektion av uterustransplantat PDAC celler i bukspottkörteln hos immunkompetenta möss. Detta kan utföras i stora kohorter av vildtyp eller muterade möss, och därmed ger en kostnadseffektiv och konsekvent modell för jämförelse av terapeutiska medel. Viktigt, den neobladder modellen ger den besläktat mikromiljö för tumörcelltillväxt och metastaser i våra händer och andra4 till kliniskt relevanta områden (t. ex., levern), vilket gör det mer kliniskt relevant än den subkutana eller kemiskt inducerad modeller. Ortotopiska tumörer Visa viktiga funktioner i PDAC, såsom en stark desmoplastisk reaktion med ett överflöd av fibroblaster och extracellulär matrix deposition5. Transgena modeller av PDAC är guld-standard av murina modell och den mest använda är KPC-modellen, som uttrycker Mutant KRASG12D/+ och Trp53R172H/+ under bukspottkörteln-specifika PDX-1-CRE promotor6. Ytterligare KPC och andra in vivo PDAC modeller granskas här7. KPC-möss utvecklar spontant pankreastumörer med en sjukdomsprogression som troget replikerar egenskaper hos humant PDAC6. Men som för alla transgena modeller är avelsprogrammet kostsamt, tumörprogression varierar och kräver därför ofta stora kohorter av möss. PDX modeller använder patient-derived tumörceller eller bitar som sedan odlas antingen ortotopiskt eller oftare subkutant i immunkomprometterade möss. Xenograft modeller ger användbara verktyg för screening terapeutiska föreningar och redogöra för patientens heterogenitet. Emellertid, de ger inte en komplett immun mikromiljö, vilket begränsar deras tillämpningar8,9.
När etablerad, ortotopiska tumörer tar vanligtvis runt 1 månad eller mer att växa (beroende på cell linjen används) och bilda stora tumörer som lätt kan avbildas med ultraljud eller MRI för att spåra progression och bestämma behandlingseffekt4,5,10. Men en gång i exponentiell tillväxt, den sista fasen av tumörtillväxt kan vara snabb, så de flesta behandlingsregimer påbörjas relativt tidigt (t. ex., 14 dagar)11,12. Immunförsvaret spelar en avgörande roll i tumörutveckling, inklusive i PDAC, som kännetecknas av en immunsuppressiv tumör infiltrera med relativ brist på T-celler och frekvent förekomst av myeloida celler13. En hög förekomst av T-celler i PDAC ger en bättre prognos14,15. Men som enstaka agenter, immunkontrollpunktshämmare som lindrar T-cellsimmunsuppression, såsom anti-CTLA-416 och anti-PD-L117, har inte visat klinisk nytta hos PDAC patienter, troligen eftersom den totala T-cellernas reaktivitet är mycket låg. Emellertid, agenter som Prime T cell svar, såsom anti-CD40, kan övervinna anti-PD-L1/CTLA-4 motstånd18,19 och vaccination med GM-CSF-utsöndring allogena PDAC vaccin (gvax) kan öka immunogeniciteten av PDAC tumörer20, vilket tyder på att förbättra T-cellsvar bildar viktiga terapeutiska Avenue.
Kritisk till en antitumöreffekt T-cellsrespons är erkännandet av tumör-härledda antigener via T-cells receptorn (TCR) och den efterföljande produktionen av cytotoxiska cytokiner och granulat. Medan T-cellernas antigen-erkännande kan bestämmas genom TCR-sekvensering, är denna metod kostsam och tidskrävande. Kvantifiering av tumörinfiltrerande T-cellsundergrupper ger dock en bra indikation på ett antitumoraliskt svar. Ytterligare undersökning av T-cellsaktivitet ex vivo när det gäller degranulering, cytokinproduktion och andra cytotoxiska faktorer ger en djupare funktionell analys. Dessa analyser kan utföras på färska tumörprover och många parametrar för T-cellernas funktion kan mätas snabbt med flödescytometri.
CD8+ och CD4+ T-celler producerar cytokiner såsom Ifnγ och TNFα för att potentiera ett immunsvar21. IFNɣ inducerar MHCI uprekling på målceller, inducerar differentiering och rekrytering av immunceller och aids celldöd. Ifnγ produktion av CD8+ T-celler är väl kännetecknas att vara en del av en antitumöreffekt svar och korrelerar med tumörregression22,23. TNFα är en annan proinflammatorisk cytokin som produceras av både CD8+ och CD4+ T-celler. Det förbättrar TCR-beroende aktivering och spridningen av T-celler, medhjälp den anti-tumoral svar. Vid TCR engagemang, cytotoxiska CD8+ T-celler kan genomgå degranulering, där förformade sekretoriska lysosomer som innehåller cytotoxiska molekyler släpps ut i den immunologiska synapsen att orsaka mål-cell nedbrytning21. Dessa molekyler inkluderar perforin, ett protein som binder till mål cellmembranet, bildar porer som sedan stör membranet integritet och tillåter diffusion21 eller endocytos24 av andra cytotoxiska molekyler, såsom granzym B, direkt i cytoplasman i målcellen. Granzyme B är ett proteas som antar nedbrytningen av flera proteiner inom målcellen, vilket leder till celldöd21. Frisläppandet av sådana molekyler kräver exocytos av endosomer till cellytan, där den endosomala markören CD107a (även känd som LAMP-1) är transitivt införlivas i cellmembranet25.
Mätningen av cytokinsekretion av T-celler kräver isolering genom antingen flödesassisterad cell sortering eller pärlbaserade separations analyser, som inte lätt kan utföras på ett stort antal prover samtidigt. Emellertid, mätning av intracellulära cytokiner kräver inte någon pre-isolering steg och kan enkelt utföras på flera prover på en gång, vilket möjliggör en högre genomströmning strategi. Som cytokiner snabbt utsöndras av T-celler, de intracellulära nivåerna kan vara omöjlig att upptäcka och därmed T-cellen kräver stimulering för att öka basal cytokin produktion. För att bedöma antigendriven cytokinproduktion måste det antigen som erkänns av TCR uppvisas för T-cellen av en primas APC in vitro. I de fall där antigenspecificiteten inte är känd krävs en bred stimulans metod. TCR stimulering kan imicked med anti-CD3/28 pärlor som ger både TCR aktivering och costimulation, som inducerar cytokin produktion och proliferation. Emellertid, ett mer kostnadseffektivt alternativ är användningen av PMA och ionomycin, som tillsammans i stort sett aktivera signalering vägar som leder till syntes och frisättning av intracellulära cytokiner. Specifikt aktiverar PMA proteinkinas C (PKC) och ionomycin höjer intracellulära ca2 + joner, vilket leder till ökad cellsignalering. För att bevara intracellulärt innehåll av cytokiner, denna stimulering kan effektivt kombineras med protein-transport hämmare brefeldin A och monensin, som blockerar proteiner i Golgi och därmed förhindra extracellulär frisättning. Användning av PMA/ionomycin är en väletablerad metod för att stimulera T-celler och det finns ett starkt samband mellan extracellulära-släppta och intracellulära cytokiner26. Stimulering av T-celler med PMA och ionomycin ökar också Lysosomen smuggling till cellmembranet och därmed CD107a blir transitivt integreras på cellytan innan de återvinns i cellen. Genom att inkludera en anti-CD107a antikropp under stimulering, är det möjligt att använda den som en markör för degranulering aktivitet25.
Denna metod smälter snabbt tumörer för att ge en encellig suspension. Vid denna punkt, kan enskilda populationer direkt färgas för flödescytometri eller renas genom nedströms metoder: Flow-Assisted cell sortering eller magnetisk pärla separation. Beredning av en encellig suspension för flödescytometri analys möjliggör hög genomströmning analys av flera immunceller populationer och deras fenotypiska markörer, vilket ger en korrekt kvantifiering av immun cells nummer och fenotyp.
Slutligen, den digestionsprotokoll som beskrivs här förhindrar cell-ytan markörer förlust och upprätthåller immuncellernas lönsamhet, vilket gör att immunceller att genomgå ytterligare cell rening steg och kultur som krävs. Emellertid, denna metod har inte testats för att härleda epitelceller från denna matsmältning.
Protocol
Orthotopic pankreastumörer genererades som tidigare beskrivits10 i enlighet med den brittiska hemmakontor Animal och Scientific förfaranden Act 1986 och europeiska direktivet 2010/63/EU. Alla möss övervakades perioperativt för tecken på smärta eller lidande, inklusive men inte begränsat till viktminskning (> 15% i 72 h eller 20% under en given period), piloerektion, förträngning av ögon, upphöjd gång, böjd utseende, samt tecken på sårinfektion inklusive blödning, rodnad och sårbildning. Tumörtillväxt övervakades av palpation, och ytterligare kliniska tecken såsom ansträngd andning, gulsot och kalla extremiteter övervakades också för att bedöma om tecken på endpoint hade uppnåtts. Alla procedurer bör utföras under sterila förhållanden. Alla reagenser som används före flödescytometri ska beredas under sterila förhållanden.
1. beredning av tumörceller för injektion
- Ta en delmängd av basalmembranet från-20 ° c och placera på is vid 4 ° c över natten.
Anmärkning: basalmembran koncentration kan variera från parti till parti; Därför måste parti specifika källare membran partier testas in vivo för att säkerställa reproducerbarhet. En ny sats av basalmembran Tinas på is vid 4 ° c över natten sedan aliciteras i användardefinierade alikvoter, på is, och sedan vidare lagras i-20 ° c tills det behövs. Detta minimerar pipettering och frysa-upptinning när du använder basalmembran.- Placera steril PBS vid 4 ° c över natten för att kyla.
- Placera sterila 200 μL och 1000 μL pipettspetsar vid-20 ° c över natten till Chill.
- Använd tumörceller som är Mycoplasma fri, odlas för minst 2-10 passager efter upptining och i log-fas av tillväxt före skörd. Detta protokoll använder den kvinnliga murin C57BL/6 KPC-derived cell linjen: TB32048 tillhandahålls som en generös gåva av labbet av David Tuveson.
- När tumörceller krävs för skörd, avlägsna medel från kolven och tvätta celler två gånger i PBS (förvärmd till 37 ° c).
- Tillsätt 2x trypsin (förvärmas till 37 ° c) till kolven i 10 min vid 37 ° c (till en T175 kolv, tillsätt 5 mL).
- Efter 10 min, tillsätt en lika stor volym av komplett medium (10% FBS, 1x penicillin, 1x streptomycin i DMEM) till kolven och separera celler genom att knacka försiktigt på kolven och resuspendera väl i medium.
- Överför cellerna till ett rör och Centrifugera i 5 min vid 300 x g och rumstemperatur (RT).
- Ta bort supernatanten och Omsuspendera cellerna i fullständigt medium för cellräkning.
- Centrifugera celler igen för 5 min vid 300 x g och RT, och ta bort supernatanten.
- Omsuspendera celler i förkyld PBS för att uppnå en koncentration på 1x106 celler/ml.
Obs: denna lager koncentration är beredd att uppnå en slutlig injektion koncentration av 1000 celler i 5 μl. Vi fann injektion av ett lägre antal celler i en låg insprutnings volym minimerat cellläckage och därmed ökad reproducerbarhet. tumörtillväxten kan dock vara cellinsberoende därför bör användare optimera varje cell linje.
- Vid sidan av detta, placera en pre-aliciterad basalmembran alikvot, på is, i huven.
- Förhållandet mellan den slutliga lösningen av basalmembran, PBS och tumörceller i PBS beredd för injektion är 5:3:2. Därför till en 500 μL alikvot av basalmembran tillsätt 300 μL av pre-kyld PBS med en pre-kyld 1000 μL pipett spets.
- Tillsätt PBS direkt till basalmembranet alikvot för att minimera pipettering.
- Håll P1000 inställd på 300 μL och Omsuspendera PBS och basalmembranet, att se till att hålla röret på isen för att bevara basalmembranet i flytande tillstånd.
- När du är klar mata ut alla basalmembranet från P1000 spetsen, lämna spetsen i röret så att någon källare membran/PBS att komma ner pipettspetsen.
- Efter 5-10 min, mata ut mer basalmembran från P1000 spetsen tillbaka in i röret och lämna röret att sitta på isen.
- Ta 200 μL av återsuspenderade tumörceller i PBS och tillsätt direkt till basalmembranet med hjälp av en pre-kyld 200 μL pipett spets.
- Ta en färsk pre-kyld P1000 pipettspetsen, Ställ pipetten på 300 μL och Omsuspendera 30-40 gånger. En större pipettspets, inställd på en låg volym, är att föredra eftersom basalmembranet kan färdas upp i spetsen och peka på pipettfiltret under resuspension.
- Tumörcellerna är redo för injektion. Håll tumör cell/basalmembran på is under operationen.
2. ortotopisk injektion av tumörceller
- Acclimate mössen i djuranläggningen i 7 dagar.
- Runt 2 h före operationen, raka vänster sida av buken och tillbaka, sedan administrera preoperativa analgetiska subkutant under skruff av halsen (buprenorfin på 50-100 μg/kg).
- Förbered kirurgiskt fält, med en Värmematta att lägga musen på och draperier för omgivande utrustning och över musen. Sterilisera alla kirurgiska verktyg; Förbered tillräckligt med verktygsuppsättningar för varje mus.
- Placera musen i en 5% isofluran med O2 kammare tills medvetslös.
- Överför musen, liggande på ryggen, på en Värmematta och underhålla anestesi med hjälp av en mask, vanligtvis vid en lägre 2-3% isofluran.
- Bekräfta djup anestesi; som identifierats genom förlust av pedal-uttag reflex när baktass är klämd och övervaka andningsfrekvens förblir konstant.
- Täck kroppen i drapera, med endast den rakade delen exponeras. Se till att musen är ordentligt i anestesi masken.
- Med hjälp av en steril bomulls knopp, tillsätt jod lösning i en cirkelrörelse över det rakade området: från centrum och cirkling ut till kanten. Upprepa processen igen med färsk bomulls knopp och jod.
- Använd skalpell att göra en 1 cm snitt direkt ovanför bukspottkörteln/Mjältens plats (övre vänstra kvadrant). Steril sax kan också användas för att göra snittet, om så är att föredra.
- Dra isär huden med hjälp av pinps. Med nya tång, lokalisera peritonealväggen och använda sax för att göra ytterligare 1 cm snitt genom peritonealväggen.
- Extrahera bukspottkörteln, som kan komma med mjälten, från kroppen med hjälp av andra par tång.
- Vänd försiktigt injektionsflaskan med tumörceller/basalmembran flera gånger för att blanda.
- Förbered glassprutan med 5 μL som innehåller 1 000 tumörceller i basalmembranet och placera på Värmemattan i några sekunder så att den kan värma.
Obs: den korta uppvärmningen av sprutan gör det möjligt för basalmembranet att börja stelnar, för att göra det lättare att injicera utan att läcka. Detta måste dock hållas kort, om den lämnas för länge basalmembranet kommer att stelna helt och kommer inte att injiceras. Användning av en glasspruta gör att en låg volym kan injiceras exakt. - Håll bukspottkörteln på svansen för att förlänga den och sätt in nålen direkt i mitten av bukspottkörteln, parallellt med bukspottkörteln själv med ett försök att undvika synliga blodkärl.
Obs: mitten av bukspottkörteln har ett stort område och det är lättast att injicera. Emellertid, huvudet eller svansen i bukspottkörteln kan också vara specifikt injiceras om föredra. - Injicera långsamt 5 μL basalmembran i bukspottkörteln och håll nålen stadigt i bukspottkörteln i minst 30 s efter injektion för att låta basalmembranet stelna och förhindra läckage. Basalmembranet bör vara synlig som en liten klar bubbla kommer att ha bildats; men det kanske inte syns.
Obs: större volymer av tumörceller/basalmembran kan injiceras; den exakta volymen måste dock testas för att säkerställa att läckage inte uppstår. - Ta bort nålen från bukspottkörteln och vänta med att bekräfta att ingen blödning har inträffat. Försiktigt in bukspottkörteln tillbaka i bukhålan, noga med att inte röra basalmembranet bubblan.
- Dra den peritoneala väggen tillsammans och utför en enda sutur, eller två avbrutna suturer om det behövs.
- Dra de två sidorna av huden snitt tillsammans och utföra flera avbrutna suturer som behövs eller infoga två kirurgiska clips.
- Administrera en annan subkutan injektion av buprenorfin i skruffen.
- Överför musen till en uppvärmd 37 ° c bur i minst 30 min efter operationen för att bibehålla kroppstemperaturen innan du överför tillbaka till en ny bur.
- Förbered en mäsk diet finns i buren, för att säkerställa rehydrering och kroppsvikt.
- Re-administrera postoperativ analgesi som rekommenderas och titta noga på tecken på sår öppning, smärta eller infektion och viktminskning. Om du använder kirurgiska clips kan dessa tas bort 7-10 dagar senare med en klipp Remover.
- Efter cirka 14 dagar ärrvävnad kommer att ha läkt tillräckligt för att börja palperas buken. Övervaka tumörstorlek noga via palpation tills möss når Endpoint.
- Vid ändpunkten är musen gallrats via cervikal dislokation följt av halshuggning. Huden och bukhålan öppnas med hjälp av sax och bukspottkörteln tumören censurerade med hjälp av pinkippar att hålla tumören, och sax för att ta bort omgivande vävnad.
3. nedbrytning av pankreastumörer
- Placera dissekerade bukspottkörtel tumör, metastatisk webbplats tumörer, eller friska pankreasvävnad i iskalla PBS, och lagra på is.
- Använd tång för att överföra tumören på en petriskål.
- Tillsätt 5,0 mL digestionsmedium (2 mg/mL Kollagenase, 0,025 mg/mL DNase RPMI) i ett 50 mL-rör; Förvara på is för att förhindra enzymaktivitet påbörjas.
Anmärkning: detta protokoll använder Kollagenase typ V, som har en aktivitet av ≥ 1 enheter/mg FALGPA och > 125 kollagen rötning enheter (CDU)/mg fast. Kollagenas och DNase-aliquoter kan förvaras vid-20 ° c och tinas på is före användning. När båda är helt solubilized i steril RPMI, de kan passera genom ett 0,2 μm filter för att avlägsna föroreningar. Kollagenase måste vara helt solubilized före filtrering för att undvika förlust av material. - Ta en liten alikvot av denna lösning för att täcka tumören på petriskål.
- Använd steril skalpell och pinps för att skära tumören i små bitar, ungefär mindre än 3 mm i längd.
- Skrapa tumör bitarna i röret och försiktigt Invertera röret tills alla bitar är nedsänkt i matsmältningen media. Förvara på is om andra tumörprover måste förberedas i ett parti.
- Överför till en skakapparat i 20 min vid 37 ° c. Se till att alla bitar av tumören är nedsänkt och inte fastnat på kanten av röret. Om skakningar inte är möjligt, sedan Vortex provet var 5 min för att underlätta matsmältningen.
4. beredning av encellig suspension från smält tumör
- Omedelbart efter digestionssteget, placera röret på isen för att bromsa enzymaktivitet.
- Tillsätt EDTA för att uppnå en slutlig koncentration på 20 mM och kort Vortex prov att blanda. Detta kommer att ytterligare bromsa enzymaktivitet.
- Öppna röret och skölj alla tumör smälta bort locket på röret med färskt RPMI medium.
- Bered en 70 μm sil (den μm storlek av SIL kan ändras som önskas) på en 50 mL öppna röret, på is.
- Pre-våt filtret med medium.
- Omsuspendera de smälta cellerna och tvätta sidorna av röret med hjälp av en 25 mL stripette, eller större. Den bredare öppningen av stripette är viktigt att låta den tjocka smälta att passera lätt.
- Överför alla Digest, med hjälp av 25 mL stripette, på SIL.
- Mosa tumören ovanpå filtret med hjälp av en 1 mL sprutkolven. Mosa bara direkt upp och ner för att minimera skjuvning stress till celler.
- Kontinuerligt tvätta celler genom SIL med RPMI. Se till att tvätta med tillräckligt med kraft för att driva celler igenom.
- Om det fortfarande finns material att mosa, men RPMI slutar spola igenom, den SIL kommer att vara mättad. Överför därför provet till ett nytt filter och fortsätt.
Notera: så småningom endast extracellulära matrix komponenter kommer att finnas kvar i filtret, alla enskilda celler bör ha passerat.
- Centrifugera röret i 5 min vid 300 x g och 4 ° c.
- Noggrant Omsuspendera cellpelleten i komplett RPMI och passera direkt genom ett annat filter för att ta bort alla extracellulära matris eller stora cell klumpar som inte kan vara tillräckligt reupphängd.
- Vid denna punkt, om ingen stimulering krävs, omedelbart fläcka de isolerade cellerna för flödescytometri analys genom att hoppa till steg 6,1. Alternativt, Omsuspendera dem i frys medium (10% DMSO i FBS) och förvara vid-80 ° c följt av långtidslagring i flytande kväve.
Anmärkning: frys steget kan möjliggöra rening av immunceller vid ett senare tillfälle; kvantifieringen av immun cells undergrupper kan dock kräva optimering för att bekräfta att cell nummer och fenotyp inte påverkas av frys/Tina-processen. Ex vivo T cell stimulering utförs bäst på färska tumörprover. Vid denna punkt provet kan renas ytterligare genom pärlbaserad död cell avlägsnande eller immunceller berikande analyser om det behövs.
5. förberedelse av celler för ex vivo -stimulering
- Räkna cellerna för att uppnå en koncentration av 2 x 106/100 μl i komplett medium (RPMI 10% FBS, 1x penicillin och 1x streptomycin).
Obs: det höga antalet totala celler pläterade säkerställer att det kommer att finnas tillräckliga T-celler i detta prov för att analysera. Men antalet kan skalas upp eller ned beroende på exempel tillgänglighet och sällsynta typ av T-cells undergrupper av intresse.- Platta 100 μL av celler i en U-bottnad 96-brunn plattan.
- Tillsätt 100 μL komplett medium som innehåller en 2x beredning av PMA/ionomycin (för att uppnå en slutlig koncentration 0,081 μM respektive 1,34 μM, enligt tillverkarens rekommendationer).
Anmärkning: om mätning av degranulering/exocytos, också inkludera här en överföras konjugerat anti-Mouse CD107a i media. Ett kontrollprov som inte innehåller CD107a måste också utföras. - Placera i 37 ° c inkubator med 5% CO2 för 1 h.
- Tillsätt 20 μL av en 10X beredning av brefeldin A och monensin (för att uppnå en slutlig koncentration på 1,06 μM respektive 2,0 μM (enligt tillverkarens rekommendationer) i kompletta medier.
Anmärkning: Brefeldin A och monensin är proteintransport hämmare och därmed blockera extracellulära frisättning av cytokiner, etc. tillåter deras detektion genom flödescytometri. Om att mäta cytokin release i supernatanten med ELISA eller liknande metoder – då detta steg kan hoppas över. - Placera plattan i en 37 ° c inkubator med 5% CO2 för ytterligare 4 h.
6. extracellulär och intracellulär färgning för flödescytometri
- Ta bort plattan och Omsuspendera varje brunn för att överföra allt material till en V-bottnad plåt, placerad på isen.
Obs: epitelceller, makrofager och andra vidhäftande celler kan inte helt hämtas genom omresuspeningar. Men som nedströms analysen är bara på T-celler, detta är inte ett problem.- 6.1.1 Centrifugera plattan i 5 min vid 300 x g och 4 ° c (Använd dessa villkor för efterföljande steg om inte annat anges).
- Avlägsna supernatanten genom att snärta plattan upp och ner i en skarp rörelse.
- Omsuspenderas i 50 μL av ett fixerbart bärgnings medel, berett i iskall PBS. Vid ombildning, Ställ in pipetten på en lägre volym för att undvika att göra bubblor.
- Inkubera i 20 minuter vid 4 ° c, i mörker.
- Tvätta steg: Tillsätt 100 μL FACS buffert, Centrifugera och ta bort supernatanten.
- Omsuspendera varje brunn med 50 μL av anti-CD16/CD32 (2,5 μg/mL) i FACS buffert (0,5% BSA, 2,0 mM EDTA i PBS) för att blockera icke-specifik bindning av detekterings antikroppar mot FC-receptorer.
- Inkubera i 15 min vid 4 ° c, i mörker.
- Lägg direkt till varje brunn en 2x Mastermix av fluorochrome-konjugerat anti-Mouse CD45, CD3, CD4 och CD8 (ytterligare extracellulära markörer kan läggas till som önskat) i FACS buffert.
- Inkubera i 30 minuter vid 4 ° c, i mörker.
- Tvätta steg: Tillsätt 100 μL FACS buffert, Centrifugera och ta bort supernatanten.
- Tillsätt 100 μL av 1x intracellulär fixeringbuffert och inkubera i 30 minuter vid RT, i mörker.
- Förbered centrifugen vid RT.
- Tillsätt 100 μL FACS-buffert, Centrifugera i 5 min vid 300 x g och RT och ta bort supernatanten. Upprepa med 1x depolarisering buffert och centrifugera för 5 min vid 300 x g; ta sedan bort supernatanten.
- Tillsätt 50 μL 1x Mastermix av fluorkromkonjugerade anti-Mouse IFNγ, TNFα och andra intracellulära markörer som bereds i 1x permeabiliseringsbuffert.
- Inkubera i 1 h vid RT, i mörker.
- Tillsätt 100 μL permeabiliseringsbuffert för att tvätta. Centrifugera sedan i 5 minuter vid 300 x g och RT och ta bort supernatanten.
- Tillsätt 100 μL FACS-buffert för att tvätta, Centrifugera i 5 min vid 300 x g och RT och ta bort supernatanten.
- Efter denna sista centrifugering, Omsuspendera celler i en volym som är kompatibel för flödescytometern. Det kan variera beroende på storleken på FACS rör.
- Överför denna volym till lämpliga FACS-rör för förvärv.
- Täck från ljus och förvara i kylen och förvärva proverna inom 24 h.
Representative Results
Efter injektion 1000 TB32048 celler i bukspottkörteln, ortotopiska tumörer tar cirka 30 dagar att utveckla (figur 1A, B). Basalmembran läckage under kirurgi kan orsaka stora tumörer att bildas direkt på peritonealväggen, som är väl synlig genom huden (figur 1C). Vi skulle ta bort dessa möss från studien. Men med goda kirurgiska färdigheter minimeras förekomsten av läckage. Ortotopiska tumörer skördas vid Endpoint kan växa till en betydande storlek i C57BL/6 Wild-typ möss (figur 1D). Skördade ortotopiska tumörer kräver matsmältning i kollagenas/DNase för 20 min för att uppnå en encellig suspension (figur 2). Vid denna punkt, tumör-härledda celler kan pläteras i en U-bottnat plattan på 2 x 106 celler/brunn. Antalet celler som pläteras kan ändras beroende på förekomsten av T-celler i provet; cellnumret kan sänkas om T-celler är i hög densitet. Kontroll mjälte eller lymfkörtel prover kan också pläteras på denna punkt för stimulering. Varje brunn stimuleras med PMA och ionomycin i 5 h och efter 1 h inkubering tillsätts brefeldin A och monensin för att blockera extracellulär frisättning av cytokiner (figur 2). Efter inkubationen är proverna färgade för extracellulära epitoper och intracellulära cytokiner för analys av flödescytometri (figur 2).
Prover av mjälte och tumörer från möss som bär ortotopiska tumörer analyserades av flödescytometri. Den gating strategi som används i flödescytometri analys för mjälten och ortotopiska tumörer utesluter skräp med hjälp av FSC-a, SSC-a, dubletter av FSC-a/FSC-H och SSC-a/SSC-W, sedan döda eller apoptotiska celler som positiva för fixerbar livskraft färg (figur 3A). Immunceller sedan gated på som CD45+, och T-celler ytterligare gated på som CD3+ från vilken CD4+ och CD8+ undergrupper definieras (figur 3A). En fluorescens minus en (FMO) utförs för att bestämma bakgrundfluorescensen för gating och en brefeldin A/monensin-endast kontroll utförs för att bestämma basal produktion av cytokiner (figur 3B-D).
För IFNγ resulterade inkubering med brefeldin A/monensin i ingen ökning av IFNγ över FMO-kontroll i både mjälte-och tumörprover. Emellertid, tillägg av PMA och ionomycin ökade% av intracellulära IFNɣ detekterbar i både mjälten och tumör-derived CD4+ och CD8+ T celler.
Splenic CD4+ och CD8+ T celler, används som en positiv kontroll, har en relativt högre ifnγ produktion än tumörinfiltrerande T cell undergrupper, med ett genomsnitt på 6,60 ± 1,5% och 12,97 ± 3,4% jämfört med 4,81 ± 1,0% och 4,13 ± 1,3%, indikerar immunsuppression sker inom tumören (figur 3B och 4a). Med hjälp av samma strategi för TNFα, visualiseras vi att en hög andel av mjälten CD4+ t-celler är positiva för intracellulära TNFα (65,93 ± 2,3%), jämfört med tumörinfiltrerande CD4+ t-celler (22,45 ± 5,4%). Mjälte-och tumörinfiltrerande CD8+ T-celler ger liknande halter av TNFα (25,15 ± 3,7% och 19,91 ± 5,1%) (figur 3C, figur 4B).
Slutligen, CD107a är en endosomala markör som uttrycks transitivt på cellytan under exocytos av cytotoxiska granulat och cytokiner, som sådan, det används som en surrogatmarkör för cytotoxicitet. Fördelen med färgning för CD107a under stimulering är att alla transitivt cell-yta uttryckt CD107a kommer att fångas upp av fluorescerande-antikropp. De basala nivåerna av CD107a visas i brefeldin A/monensin endast behandlade celler. För mjälten CD8+ T celler, stimulering med PMA/ionomycin ökar nivån av CD107a upptäcks, med den starkaste uppreglering i CD8+ celler som var 23,95 ± 3,5% CD107a+, jämfört med 5,8 ± 1,9% i tumörinfiltrerande CD8+ celler, indikerar mjälten CD8+ hade en högre grad av degranulering. Å andra sidan, mjälten och tumörinfiltrerande CD4+ uttryckt jämförbara nivåer av CD107a 9,37 ± 1,5% och 11,50 ± 1,8% (figur 3D och 4c).
Sammantaget dessa resultat belyser att ortotopiska tumörer kan genereras från injektion av ett mycket lågt antal (1 000) av tumörceller i bukspottkörteln. Dessa tumörer kan snabbt smältas för isolering av T-celler för ex vivo stimulering. Detektion av intracellulära cytokiner är möjligt och belyser den basala nivån av immunsuppression av infiltrerande T-celler, jämfört med T-celler i sekundära lymfoida organ.
Figur 1: generering av ortotopisk pankreastumörer. A) tidsplan för in vivo -experiment. (B) den makroskopiska utseende ortotopiska tumörer i bukhålan (vänster) och efter excision (höger) där tumören visas har halverats. (C) bevis på basalmembran läckage under operationen kan orsaka tumörer att utveckla som är synliga genom huden (övre bilden) och form på peritonealväggen (lägre foto). Dortotopisk bukspottkörtel tumör vikter skördade från möss som hade uppnått Endpoint (n = 22). Varje datapunkt representerar en enskild mus, stapeldiagrammet visar medelvärdet ± SEM. Uppgifterna i denna siffra har modifierats från tidigare publicerat arbete10. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk bearbetning av ortotopiska tumörer för ex vivo T-cellstimulering. Efter skörd, pankreastumörer snabbt smälta i Kollagenase (2 mg/mL) och DNase (0,025 mg/mL) för 20 min vid 37 ° c. Efter detta återsuspenderas cellerna vid 2 x 106/ml i komplett RPMI-media och pläterade i en U-bottnad plåt. En stimulering cocktail av PMA och ionomycin tillsätts för 5 h, vid vilken punkt anti-mus CD107a antikropp kan också läggas till kulturen. Efter 1 h inkubering de intracellulära transport blockerare, brefeldin A och monensin, tillsätts. Efter ex vivo -stimulering överförs cellerna till en v-bottnad platta för färgning med fixerbar genomförbarhet färg (i PBS) för 20 min 4 ° c. Cellerna tvättas i FACS buffert och inkuberas i anti-CD16/32 (FcR block) för 15 min (i FACS buffert) och sedan inkuberas med extracellulära fluorescerande-konjugerade antikroppar för ytterligare 30 min (i FACS buffert). Cellerna tvättas igen i FACS buffert och Omsuspendera cellerna under i intracellulär fixering buffert för 20 min. Efter detta, celler tvättas en gång i FACS buffert och en gång i 1x depolarisering buffert. Cellerna återsuspenderas för 1 h vid RT i intracellulära fluorescerande-konjugerade antikroppar för 1 h (i 1x depolarisering buffert). Cellerna tvättas en gång i 1x depolarisering buffert och en gång i FACS buffert innan resuutgifterna i FACS buffert för förvärv på flödescytometern inom 24 h. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: flödescytometri analys av ex vivo stimulerade mjälte-och tumör-härledda T-celler. (A) flödescytometri gating strategi som används för mjälte (positiv kontroll) och ortotopiska tumörer prover. Celler diskrimineras från skräp med hjälp av FSC-A/SSC-A och enstaka celler isoleras ytterligare med FSC-A/FSC-H och SSC-A/SSC-W. Döda eller apoptotiska celler utesluts med hjälp av den fixerbara livskraften Dye-FVD506 och immunceller är gated på av CD45+. Efter detta CD3+ T celler och CD4+ och CD8+ undergrupper definieras. Data förvärvades på en BD Fortessa. (B) den gating strategi som används för att kvantifiera IFNγ+ CD4+ och CD8+ T celler. En fluorescerande minus en (FMO) kontroll används på fullt stimulerade prover (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) för att bestämma bakgrundfluorescensen. En brefeldin A/monensin-kontroll (endast B + M) används för att bestämma den basala cytokin-produktionen. Det fullt stimulerade provet används sedan för att beräkna% IFNγ+ T-celler. Cden gating-strategi som används för att kvantifiera TNFα+ CD4+ och CD8+ T-celler. En FMO-kontroll används på fullt stimulerade prover (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) för att bestämma bakgrundfluorescensen. En brefeldin A/monensin-kontroll (endast B + M) används för att bestämma den basala cytokin-produktionen. Det fullt stimulerade provet används sedan för att beräkna% TNFα+ T-celler. (D) den gating strategi som används för att definiera CD107a+ CD4+ och CD8+ T celler. En FMO-kontroll används på fullt stimulerade prover (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) för att bestämma bakgrundfluorescensen. En brefeldin A/monensin-kontroll (endast B + M) används för att bestämma den basala degranuleringen. Det fullt stimulerade provet används sedan för att beräkna% CD107a+ T-celler. Alla flödescytometridata analyserades på FlowJo version 10.6.1. Uppgifterna i denna siffra har modifierats från tidigare publicerat arbete10. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: kvantifiering av ex vivo mjälte-och tumör-derived T cellsaktivitet. Andelen CD4+ och CD8+ T-celler positivt för (a) ifnγ+ (B) TNFα+ och (C) CD107a+ kvantifierades i mjälten (n = 4) och tumör (n = 7) av ortoämne-tumörsombär möss. Varje datapunkt representerar en enskild mus och felstaplar visar medelvärdet ± SEM. statistisk signifikans testades med ett icke-parat t-test där * = p < 0,05 och * * * = p < 0,001. Alla data analyserades med Prism 8. Uppgifterna i denna siffra har modifierats från tidigare publicerat arbete10. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
In vivo modeller av pankreascancer ger ovärderliga verktyg för att förstå sjukdomsprogression och bedöma nya Therapeutics mål3. Den ortotopiska modellen i synnerhet är en kostnadseffektiv och reproducerbar modell som kan tillämpas i stora kohorter av möss samtidigt4,27. Den neobladder modellen ger också den besläktat mikromiljö och intakt immunförsvar för tumörtillväxt, vilket gör det mer lämpligt än den subkutana och PDX-modeller. Emellertid, vi har funnit att vissa delar av immun infiltration kan skilja mellan ortotopisk modell och KPC möss, guldmynt-standard murina modell10. En anledning till detta kan vara den accelererade tumörtillväxt ses i ortotopisk modell. Ytterligare skillnader i densiteten av immun cells undergrupper har beskrivits mellan ortoämnet och subkutana modeller3,28. Därför, även om den transgena KPC-modellen är dyrare och variabel6, bör viktiga fynd verifieras i en liten kohort av KPC-möss där det är möjligt.
Beredningen av tumörceller för ortotopisk kirurgi är ett kritiskt steg i protokollet. Celler ska alltid vara i logg fasen av tillväxt och Mycoplasma-och infektions fria. Ortotopisk kirurgi bör skjutas upp om det finns några farhågor över tumörcelltillväxt. Användningen av basalmembran förbättrar tumör incidens över injicera celler utan det29 och minskar cellläckage och därmed peritonealdialys spridning27. Emellertid, när suspenderade i basalmembranet, tumörceller bör snabbt injiceras (inom 2 timmar) för att undvika någon cellförlust. Antalet tumörceller som krävs för att generera tumörer är sannolikt att cell-line beroende, och en rad cell nummer bör testas (t. ex. från 100 – 100 000) som också kan bestämma tiden för att nå Endpoint. Det är sannolikt att det kommer att finnas en felmarginal när du förbereder 1 000 celler per mus för injektion; Därför, om flera dagar av kirurgi krävs, behandling av grupper bör spridas jämnt över dagar för att kontrollera för batcheffekter. De flesta kirurgiska steg kan ändras beroende på preferenser; emellertid, försiktighet måste vidtas för att inte störa basalmembranet när du byter bukspottkörteln i bukhålan eller stänga peritonealväggen. Basalmembran läckage kan orsaka tumörcelltillväxt på peritonealväggen, som bildar snabbt och kan resultera i att behöva offra djuret tidigare.
Helst, pankreastumörer bör snabbt smälta efter skörd och förberett för ex vivo stimulering omedelbart. Emellertid, detta kanske inte är möjligt om det finns ett stort parti av tumörer att skörda, i detta fall tumörer bör hållas på is och smält i partier. Typ, koncentration och längd av exponering för matsmältningsenzymer har alla visat sig påverka ett stort antal ytmolekyler på immunceller30,31,32. Digestionstiden är också medvetet kort för att begränsa celldöd33. Smält celler kan frysas ned i frys medium för långtidsförvaring. emellertid, vissa cellförlust kommer att inträffa när upptinning. Digestionsprocessen kan vara mindre än optimal om tumör bitarna inte är tillräckligt tärnad innan kollagenase inkubering och detta kommer att vara uppenbart som hårda tumör bitar kommer att finnas kvar i filtret efter matsmältningen. Kollagenaskoncentrationen kan sänkas om man arbetar med friska bukspottkörteln eller tidiga tumörer; rapporter om utvinna friska bukspottskörteln duktal celler använder betydligt lägre koncentrationer34. En hög grad av epitelial celldöd är att förväntas under matsmältningen; men, immunceller bör tolerera processen väl. Alternativa metoder finns för att isolera livskraftiga epitelceller för Organoid tillväxt35 eller för att bevara vävnads arkitektur36.
Ändringar av stimuleringsprotokollet kan göras enkelt, beroende på önskad avläsnings-och immuncell analyseras (t. ex. makrofager eller B-celler). Användning av panstimuleringsmedel PMA/ionomycin diskriminerar inte för TCR-antigen-specificitet, vilket gör det användbart när antigenet inte är känt. Dock är produktionen av IFNɣ nära förknippad med TCR Engagement37 och både IFNɣ och TNFα produktion är kritiska i PDAC antitumöreffekt svar38. PMA/ionomycin stimulering återspeglar den maximala kapaciteten hos T-celler att producera cytokiner, som kan eller inte kan produceras av T-celler i tumören mikromiljö. Endogena produktionen kan mätas utan behov av stimulering; emellertid, nivåer kan vara mycket lägre eller omätbara. Det finns alternativa metoder för att stimulera T-celler: anti-CD3/28-belagda pärlor, som också inte kräver antigen eller även andra immunceller populationer. Fördelen med denna metod är att tillåta kvantifiering av cytokin produktion av specifika T cell delmängder utan behov av separationsmetoder. Andra markörer för cytotoxicitet (granzym B och perforin A), aktivitet (IL-2) eller immunsuppression (IL-10) kan också tillsättas21. Emellertid, hög kvalitet flödescytometri antikroppar är inte tillgängliga för att upptäcka alla cytokiner och faktorer av intresse. Därför, om det finns andra tillämpningar såsom ELISA krävs stimulering kan utföras utan införandet av brefeldin A/monensin, vilket gör att cytokin release i supernatanten. Emellertid, av anmärkning, detta kommer att tillåta total cell cytokin release och det kommer inte att vara möjligt att avgöra vilken cellpopulationer bidragit.
Ifnγ-produktion är ett dominerande inslag i en antitumöreffekt T-cellsrespons, som ofta används som ersättning för TCR-antigen-igenkänning37,38. Andra in vivo metoder som mer exakt definierar antigen-specifika svar utnyttja tumörceller som uttrycker ett känt antigen, såsom ovalbumin eller SV40. Universal antigen kan sedan användas ex vivo för att testa T cell igenkänning eller i kombination med en TCR-begränsad värdmus. Alternativt, där antigenet är okänt, kan kvantifiering av T-cellsklon expansion utföras genom bulk-TCR-sekvensering, eller mer nyligen encellig TCR-sekvensering39,40. För att till fullo förstå tillståndet i den intratumorala T-cellsrespons, bör markörer som indikerar utmattning eller hämmande receptorer också mätas inklusive: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Samt markörer för effektort celler (CD44Hi, CD62Lo) och proliferativ aktivitet, Ki67+ eller csfe utspädning41,42,43,44. Sammantaget, den neobladder modellen ger en användbar plattform för att snabbt testa terapeutiska strategier, i synnerhet som kan modulera den antitumöreffekt T-cell svar, som kan sedan valideras på en mindre kohort av transgena, KPC, möss.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Animal Technician service och Dr Alzbeta Talarovicova (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannien) för deras hjälp under ortotopisk kirurgi. Vi skulle också vilja tacka Dr Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, Storbritannien) för hennes vägledning i kirurgisk teknik, Dr Cristina Ghirelli (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannien) för hennes råd om tumör matsmältning och Dr Fabienne McClanahan (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannien) för hennes råd om ex vivo T cell stimulering protokoll. Vi vill också tacka Medicinska forskningsrådet (MRC), pankreascancer forskningsfonden (PCFR) och äggstockscancer åtgärder som finansierade denna forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures | Ethicon | W9500T | |
| 70 μm pore-size cell strainer | Fisher Scientific | 11597522 | |
| 9 mm Clay Adams clips | VetTech Solutions | IN015A | |
| anti-CD107a PE (clone 1D4B) | Biolegend | 121612 | 1:100 to culture media |
| anti-CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Use at final dilution 1:200 |
| anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) | Biolegend | 46-0032 | Use at final dilution 1:50 |
| anti-CD4 FITC (clone GK1.5) | eBioscience | 11-0041 | Use at final dilution 1:100 |
| anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) | Biolegend | 103140 | Use at final dilution 1:200 |
| anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) | Biolegend | 100738 | Use at final dilution 1:100 |
| anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) | Biolegend | 505826 | Use at final dilution 1:50 |
| anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) | Biolegend | 506314 | Use at final dilution 1:50 |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | BD Biosciences | 354248 | Aliquot on ice and store in -20 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) | eBioscience | 00-4970-03 | 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM |
| Clay Adams Autoclip Applier | VetTech Solutions | IN015B | |
| Clay Adams Autoclip remover | VetTech Solutions | IN015B | |
| Collagenase Type V from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9263 | 2 mg/mL in media |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
| DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine | PAA | E15-810 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl | Sigma-Aldrich | D4513 | Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL |
| Fixable Viability Dye 506 (FVD506) | eBioscience | 65-0866 | Use at 1:200 in PBS |
| Foetal calf-serum (FCS) | GE Healthcare | A15-104 | 10% in RPMI |
| Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip | Fisher Scientific | 10100332 | |
| Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer | eBioscience | 88-8824-00 | Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O |
| Penicillin/streptomycin | PAA | 15140122 | 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
| Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) | eBioscience | 00-4980-03 | 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM |
| RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Surgical Scalpel Blade No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
| Trypsin-EDTA Solution 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration |
| U-bottomed 96 microwell plate | VWR | 734-2080 | |
| Universal Cotton Tipped Applicators - 6 inch x 100 | Medisave | UN982 | |
| V-bottomed 96 microwell plate | VWR | 735-0184 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Conroy, T., et al. Current standards and new innovative approaches for treatment of pancreatic cancer. European Journal of Cancer. 57, 10-22 (2016).
- Lee, J. W., Komar, C. A., Bengsch, F., Graham, K., Beatty, G. L. Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer: The KPC model (LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre), its variants, and their application in immuno-oncology drug discovery. Current Protocols in Pharmacology. 2016, (2016).
- Tseng, W. W., et al. Development of an Orthotopic Model of Invasive Pancreatic Cancer in an Immunocompetent Murine Host. Clinical Cancer Research. 16 (14), 3684-3695 (2010).
- Majumder, K., et al. A Novel Immunocompetent Mouse Model of Pancreatic Cancer with Robust Stroma: a Valuable Tool for Preclinical Evaluation of New Therapies. Journal of Gastrointestinal Surgery. 20 (1), 53-65 (2016).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. Integrated Patient-Derived Models Delineate Individualized Therapeutic Vulnerabilities of Pancreatic Cancer. Cell Reports. , (2016).
- Nicolle, R., et al. Pancreatic Adenocarcinoma Therapeutic Targets Revealed by Tumor-Stroma Cross-Talk Analyses in Patient-Derived Xenografts. Cell Reports. , (2017).
- Spear, S., et al. Discrepancies in the Tumor Microenvironment of Spontaneous and Orthotopic Murine Models of Pancreatic Cancer Uncover a New Immunostimulatory Phenotype for B Cells. Frontiers in Immunology. 10, 542 (2019).
- Zhu, Y., et al. CSF1/CSF1R blockade reprograms tumor-infiltrating macrophages and improves response to T-cell checkpoint immunotherapy in pancreatic cancer models. Cancer Research. , (2014).
- Lee, J. J., Huang, J., England, C. G., McNally, L. R., Frieboes, H. B. Predictive Modeling of In vivo Response to Gemcitabine in Pancreatic Cancer. PLoS Computational Biology. , (2013).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the Immune Reaction to Pancreatic Cancer from Inception to Invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Fukunaga, A., et al. CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes together with CD4+ tumor-infiltrating lymphocytes and dendritic cells improve the prognosis of patients with pancreatic adenocarcinoma. Pancreas. 28 (1), 26-31 (2004).
- Tewari, N., et al. The presence of tumor-associated lymphocytes confers a good prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma: an immunohistochemical study of tissue microarrays. BMC Cancer. 13 (1), 436 (2013).
- Royal, R. E., et al. Phase 2 Trial of Single Agent Ipilimumab (Anti-CTLA-4) for Locally Advanced or Metastatic Pancreatic Adenocarcinoma. Journal of Immunotherapy. 33 (8), 828-833 (2010).
- Brahmer, J. R., et al. Safety and Activity of Anti–PD-L1 Antibody in Patients with Advanced Cancer. New England Journal of Medicine. 366 (26), 2455-2465 (2012).
- Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
- Beatty, G. L., et al. CD40 Agonists Alter Tumor Stroma and Show Efficacy Against Pancreatic Carcinoma in Mice and Humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
- Lutz, E. R., et al. Immunotherapy converts nonimmunogenic pancreatic tumors into immunogenic foci of immune regulation. Cancer Immunology Research. 2 (7), 616-631 (2014).
- Barry, M., Bleackley, R. C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. Nature Reviews. Immunology. 2 (6), 401-409 (2002).
- Mojic, M., Takeda, K., Hayakawa, Y. The dark side of IFN-γ: Its role in promoting cancer immunoevasion. International Journal of Molecular Sciences. , (2018).
- Castro, F., Cardoso, A. P., Gonçalves, R. M., Serre, K., Oliveira, M. J. Interferon-gamma at the crossroads of tumor immune surveillance or evasion. Frontiers in Immunology. , (2018).
- Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nature Immunology. , (2011).
- Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).
- Schuerwegh, A. J., De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Stevens, W. J. Comparison of intracellular cytokine production with extracellular cytokine levels using two flow cytometric techniques. Cytometry. 55 (1), 52-58 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the panc02 and 6606PDA cell lines. European Surgical Research. , (2011).
- An, X., et al. Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Jiang, Y. J., et al. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: Cells suspended and injected in Matrigel. World Journal of Gastroenterology. , (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2017).
- Liu, Q., et al. Effects of enzymatic digestion, cell culture and preservation conditions on surface CD62L expression of primary murine CD3+CD4+T cells. Biomedical Research (India). 29 (10), 2153-2159 (2018).
- Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO Journal. , (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. , (2015).
- Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. , (2019).
- Moran, A. E., Polesso, F., Weinberg, A. D. Immunotherapy Expands and Maintains the Function of High-Affinity Tumor-Infiltrating CD8 T Cells In Situ. The Journal of Immunology. , (2016).
- Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. , (2015).
- Singh, M., et al. High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes. Nature Communications. 10 (1), 3120 (2019).
- Jiang, N., Schonnesen, A. A., Ma, K. Y. Opinion Ushering in Integrated T Cell Repertoire Profiling in Cancer. Trends in Cancer. 5, 85-94 (2019).
- Schietinger, A., et al. Tumor-Specific T Cell Dysfunction Is a Dynamic Antigen-Driven Differentiation Program Initiated Early during Tumorigenesis. Immunity. 45 (2), 389-401 (2016).
- Raghav, S. K., et al. Exhaustion of tumor-specific CD8+ T cells in metastases from melanoma patients. Journal of Clinical Investigation. , (2011).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific in filtrating human tumors. The Journal of Clinical Investigation. , (2014).
- Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8 + T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. , (2019).
