Summary
Denne protokol beskriver den kirurgiske generation af ortotopiske pancreastumorer og den hurtige fordøjelse af frisk isolerede murine pancreas tumorer. Efter fordøjelsen kan levedygtige immuncelle populationer anvendes til yderligere downstream-analyse, herunder ex vivo -stimulering af T-celler til intracellulær cytokindetektion ved strømnings cytometri.
Abstract
In vivo modeller af kræft i bugspytkirtlen giver uvurderlige værktøjer til at studere sygdoms dynamik, immun infiltration og nye terapeutiske strategier. Den ortotopiske murine model kan udføres på store kohorter af immunkompetente mus samtidigt, er relativt billig og bevarer det hyggelige vævs mikromiljø. Kvantificeringen af T-celleinfiltration og cytotoksisk aktivitet inden for ortotopiske tumorer giver en nyttig indikator for en antitumoralsk respons.
Denne protokol beskriver metoden til kirurgisk generering af ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen ved injektion af et lavt antal syngeneiske tumorceller ophængt i 5 μL kælder membran direkte ind i bugspytkirtlen. Mus, der bærer ortotopiske tumorer tage cirka 30 dage at nå endepunkt, på hvilket tidspunkt tumorer kan høstes og forarbejdes til karakterisering af tumor-infiltrerende T celle aktivitet. Hurtig enzymatisk fordøjelse med kollagenase og DNase gør det muligt at udtrække en enkelt cellesuspension fra tumorer. Levedygtigheden og celleoverfladen markører af immunceller ekstraheret fra tumoren bevares; Derfor er det hensigtsmæssigt for flere downstream-applikationer, herunder flow-assisteret celle sortering af immunceller til kultur eller RNA ekstraktion, flow flowcytometri analyse af immuncelle populationer. Her beskriver vi ex vivo -stimulering af T-cellepopulationer for intracellulær cytokinkvantificering (IFNγ og TNFα) og degranulations aktivitet (CD107a) som et mål for samlet cytotoksicitet. Hele-tumor fordøjelser blev stimuleret med phorbols myristate acetat og ionomycin for 5 h, i nærværelse af anti-CD107a antistof for at upregulate cytokin produktion og degranulering. Tilsætning af brefeldin A og monensin til den sidste 4 h blev udført for at blokere ekstracellulær transport og maksimere cytokindetektion. Der blev derefter udført ekstra-og intra-cellulær farvning af celler for flowcytometri-analyse, hvor andelen af IFNγ+, tnfα+ og CD107a+ CD4+ og CD8+ T-celler blev kvantificeret.
Denne metode giver en start base til at udføre omfattende analyse af tumor mikromiljø.
Introduction
Denne metode detaljer, fra start til, den kirurgiske procedure for at generere ortotopiske bugspytkirtel tumorer ved hjælp af en minimal mængde af cellulære materiale og den efterfølgende hurtig dissociation af etablerede tumorer for omfattende flow flowcytometri analyse af immunceller populationer, herunder ex vivo analyse af T celle funktion.
Pancreatisk duktalt adenokarcinom (pdac) er en aggressiv karcinom med kun 8% af patienterne overlever 5 år1. Da mindre end 20% af patienterne er berettiget til kirurgisk resektion2, er friske patientprøver ikke umiddelbart tilgængelige for forskning, og derfor indeholder in vivo -modeller væsentlige værktøjer til at undersøge denne sygdom. Der er flere murine modeller af PDAC: orthotopic, subkutane, transgene, intravenøs og patient-afledte xenograft (PDX), udførligt beskrevet her3. Den ortotopiske model, der er beskrevet her, tillader injektion af syngeneiske PDAC-celler i bugspytkirtlen af immunkompetente mus. Dette kan udføres i store kohorter af vilde-type eller mutant mus, og dermed giver en omkostningseffektiv og konsekvent model for sammenligning af terapeutiske agenser. Vigtigere, den ortotopisk model giver den cognate mikromiljø for tumorcellevækst og metastastørrelserne i vores hænder og andre4 til klinisk relevante steder (f. eks, leveren), hvilket gør det mere klinisk relevant end de subkutane eller kemisk inducerede modeller. Orthotopic tumorer vise nøglefunktioner i PDAC, såsom en stærk desmoplastisk reaktion med en overflod af fibroblaster og ekstracellulære matrix deposition5. Transgene modeller af PDAC er guldstandarden for murine model og den mest almindeligt anvendte er KPC model, som udtrykker mutant KrasG12D/+ og Trp53R172H/+ under den bugspytkirtel-specifikke PDX-1-CRE Promoter6. Yderligere KPC og andre in vivo pdac modeller gennemgås her7. KPC-mus udvikler spontant pancreastumorer med en sygdomsprogression, der trofast replikater funktioner i humant PDAC6. Men som for alle transgene modeller, avlsprogrammet er dyrt, tumorprogression er variabel og derfor ofte kræver store kohorter af mus. PDX modeller bruger patient-afledte tumorceller eller stykker, som derefter dyrkes enten ortootopisk eller oftere subkutant i immunkompromitterede mus. Xenograft-modeller giver nyttige værktøjer til screening af terapeutiske forbindelser og tegner til patientens heterogenitet. Men, de giver ikke en komplet immun mikromiljø, og dermed begrænse deres applikationer8,9.
Når etableret, ortotopisk tumorer typisk tage omkring 1 måned eller mere for at vokse (afhængigt af den anvendte cellelinje) og danne store tumorer, der kan let afbildet af ultralyd eller MRI til at spore progression og bestemme behandlingens virkning4,5,10. Men, en gang i eksponentiel vækst, den sidste fase af tumorvækst kan være hurtig, så de fleste behandlingsregimer er påbegyndt relativt tidligt (f. eks 14 dage)11,12. Immunsystemet spiller en afgørende rolle i tumor udvikling, herunder i pdac, som er karakteriseret ved en immunsuppressiv tumor infiltrere med relativ Brandt af T-celler og hyppig tilstedeværelse af myeloide celler13. En høj forekomst af T-celler i pdac giver en bedre prognose14,15. Men, som enkelt agenter, immun check point hæmmere at lindre T celle immunsuppression, såsom anti-CTLA-416 og anti-PD-L117, har ikke vist klinisk fordel hos pdac patienter, sandsynligvis fordi den samlede T celle reaktivitet er meget lav. Men, agenter, der Prime T celle respons, såsom anti-CD40, kan overvinde anti-PD-L1/ctla-4 modstand18,19 og vaccination med GM-CSF-udskilning allogen pdac vaccine (gvax) kan øge immunogeniciteten af pdac tumorer20, hvilket indikerer, at øge T celle svar danner vigtige terapeutiske Avenue.
Kritisk til en antitumoral T celle respons er anerkendelsen af tumor-afledte antigener via T-celle receptor (TCR) og den efterfølgende produktion af cytotoksiske cytokiner og granulat. Mens T-celle antigen-anerkendelse kan bestemmes ved TCR sekvensering, denne tilgang er dyrt og tidskrævende. Kvantificering af tumor infiltrerende T-celle undersæt giver imidlertid en god indikation af en anti-tumoralsk respons. Yderligere undersøgelse af T-cellens aktivitet ex vivo med hensyn til degranulering, cytokinproduktion og andre cytotoksiske faktorer giver en dybere funktionel analyse. Disse assays kan udføres på friske tumorprøver og mange parametre af T celle funktion kan måles hurtigt ved flow cytometry.
CD8+ og CD4+ T- celler producerer cytokiner såsom Ifnγ og tnfα for at forstærke immunresponset21. IFNɣ inducerer mhci docetaxels Opregulering på målceller, inducerer differentiering og rekruttering af immunceller og aids celledød. Ifnγ produktion af CD8+ T celler er velkarakteriseret at være en del af en antitumoral respons og korrelerer med tumorregression22,23. TNFα er en anden proinflammatorisk cytokin, der produceres af både CD8+ og CD4+ T- celler. Det forbedrer TCR-afhængige aktivering og spredning af T-celler, medvirken den anti-tumoral respons. Ved TCR-engagement kan cytotoksiske CD8+ T- celler gennemgå degranulering, hvor præ-dannede sekretoriske lysosomer, der indeholder cytotoksiske molekyler, frigives til den immunologiske synapse for at forårsage nedbrydning af målcellerne21. Disse molekyler omfatter Perforin, et protein, der binder sig til målcellens membran, danner porer, der derefter forstyrrer membran integriteten og tillader diffusion21 eller endocytose24 af andre cytotoksiske molekyler, såsom granzyme B, direkte ind i cytoplasmaet i målcellen. Granzyme B er en proteasehæmmere, der indvirker nedbrydningen af flere proteiner i målcellen, hvilket fører til celledød21. Frigivelsen af sådanne molekyler kræver exocytose af endosomer til cellens overflade, hvor endosomal markør CD107a (også kendt som lampe-1) er transitivt indarbejdet i cellemembranen25.
Måling af cytokinsekretion med T-celler kræver, at de isoleres ved hjælp af enten flow assisteret celle sortering eller perle baserede separations analyser, som ikke let kan udføres på et stort antal prøver samtidigt. Imidlertid kræver måling af intracellulære cytokiner ikke nogen præ-isolations trin og kan let udføres på flere prøver på én gang, hvilket muliggør en tilgang med højere gennemløb. Da cytokiner hurtigt udskilles af T-celler, kan de intracellulære niveauer være målbart, og derfor kræver T-cellen stimulering for at øge basal cytokinproduktionen. For at vurdere antigen drevet cytokinproduktion skal det antigen, der anerkendes af TCR, frembydes for T-cellen af en primet APC in vitro. I tilfælde, hvor antigen specificiteten ikke er kendt, er der behov for en bred stimulerings metode. TCR stimulation kan efterlignes ved hjælp af anti-CD3/28 perler, der giver både TCR aktivering og costimulation, som inducerer cytokin produktion og spredning. Et mere omkostningseffektivt alternativ er imidlertid brugen af PMA og ionomycin, som tilsammen aktiverer signalerings veje, der fører til syntese og frigivelse af intracellulære cytokiner. Specifikt, PMA aktiverer protein kinase C (PKC) og ionomycin rejser intracellulære ca2 + ioner, hvilket fører til øget celle signalering. For at bevare intracellulært indhold af cytokiner, denne stimulation kan effektivt kombineres med protein-transport hæmmere brefeldin A og monensin, som blokerer proteiner i Golgi og dermed forhindre ekstracellulære frigivelse. Brugen af PMA/ionomycin er en veletableret metode til stimulering af T-celler, og der er en stærk sammenhæng mellem ekstracellulære-frigivne og intracellulære cytokiner26. Stimulering af T-celler med PMA og ionomycin øger også lysosomhandelen til cellemembranen og dermed bliver CD107a transitivt integreret på cellens overflade, inden den genbruges i cellen. Ved at medtage et anti-CD107a antistof under stimuleringen er det muligt at bruge det som markør for degranulations aktivitet25.
Denne metode hurtigt fordøjer tumorer til at give en enkelt cellesuspension. På dette tidspunkt kan individuelle populationer direkte farves for strømnings cytometri eller renses ved downstream-metoder: flow-assisteret celle sortering eller magnetisk-perle adskillelse. Fremstilling af en enkelt cellesuspension til flow cytometri analyse giver en høj gennemløb analyse af flere immunceller populationer og deres fænotypiske markører, giver en nøjagtig kvantificering af immuncelle nummer og fænotype.
Endelig, den fordøjelse protokol beskrevet her forhindrer celle-overflade markører tab og opretholder immuncelle levedygtighed, så immunceller til at gennemgå yderligere celle rensning trin og kultur efter behov. Men, denne metode er ikke blevet testet for at udlede epiteliale celler fra denne fordøjelse.
Protocol
Ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen blev genereret som tidligere beskrevet10 i overensstemmelse med det britiske kontor for dyre-og videnskabelige procedurer Act 1986 og det europæiske direktiv 2010/63/EU. Alle mus blev overvåget perioperativt for tegn på smerte eller lidelse, herunder men ikke begrænset til vægttab (> 15% i 72 h eller 20% i en given periode), piloerektion, forsnævring af øjne, forhøjet gangtid, krumrygget udseende, samt af tegn på sårinfektion, herunder blødning, rødme og ulceration. Tumor vækst blev overvåget ved palpation, og yderligere kliniske tegn såsom besværet vejrtrækning, gulsot og kolde ekstremiteter blev også overvåget for at vurdere, om tegn på endepunkt var nået. Alle procedurer bør udføres under sterile forhold. Alle reagenser, der anvendes før flow cytometri, skal tilberedes under sterile forhold.
1. fremstilling af tumorceller til injektion
- Tag en alikvot kælder membran fra-20 °C og Placer på is ved 4 °C natten over.
Bemærk: kælder membran koncentrationen kan variere fra batch til batch; Derfor skal parti specifikke kælder membran batcher testes in vivo for at sikre reproducerbarhed. En ny batch af kælderen membran er optøet på is ved 4 °C natten derefter aliciteret i brugerdefinerede Aliquots, på is, og derefter yderligere opbevares i-20 °C, indtil det kræves. Dette minimerer pipettering og fryse optøning ved brug af kælder membran.- Placer steril PBS ved 4 °C natten over for at slappe af.
- Placer sterile 200 μL og 1000 μL pipettespidser ved-20 °C natten over for at slappe af.
- Brug tumorceller, der er Mycoplasma fri, dyrkes for mindst 2-10 passager efter optøning og i log-fase af vækst før høst. Denne protokol bruger den kvindelige murine C57BL/6 KPC-afledte cellelinje: TB32048 leveres som en generøs gave af laboratoriet af David Tuveson.
- Når tumorceller er nødvendige for høst, fjerne medium fra kolben og vaske celler to gange i PBS (præ-varmet til 37 °C).
- Tilsæt 2x trypsin (forvarmet til 37 °C) til kolben i 10 min ved 37 °C (til en T175 kolbe, tilsæt 5 mL).
- Efter 10 min. tilsættes en tilsvarende mængde komplet medium (10% FBS, 1x penicillin, 1x streptomycin i DMEM) til kolben og dissocierer celler ved forsigtigt at tappe på kolben og gensuspendere brønden i mediet.
- Cellerne overføres til et rør og centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g og rumtemperatur (RT).
- Fjern supernatanten, og resuspender cellerne i hele mediet til celle optælling.
- Centrifuger cellerne igen i 5 minutter ved 300 x g og rt, og Fjern supernatanten.
- Resuspension af celler i præ-kølet PBS for at opnå en koncentration på 1x106 celler/ml.
Bemærk: denne bestand koncentration er parat til at opnå en endelig injektion koncentration af 1000 celler i 5 μl. Vi fandt injektion af et lavere antal celler i en lav injektion volumen minimeret celle lækage og derfor øget reproducerbarhed dog kan tumorvækst være celle-linje afhængig derfor brugere bør optimere hver cellelinje.
- Sideløbende med dette, placere en præ-aliciteret kælder membran aliquot, på is, i hætten.
- Forholdet mellem den endelige opløsning af kælder membran, PBS og tumorceller i PBS klar til injektion er 5:3:2. Derfor tilsættes en 500 μL alikvot kælder membran 300 μL forkølet PBS med en forkølet 1000 μL pipettespids.
- Tilføj PBS direkte til kælderen membran alikvot for at minimere pipettering.
- Hold P1000 indstillet til 300 μL og resuspender PBS og kælder membranen, og sørg for at holde røret på isen for at bevare kælder membranen i flydende tilstand.
- Når du er færdig med at skubbe hele kælder membranen ud af P1000-spidsen, skal du lade spidsen i røret være, så enhver kælder membran/PBS kommer ned i pipettespidsen.
- Efter 5-10 min, skub mere kælder membran fra P1000 spidsen tilbage i røret og lad røret sidde på isen.
- Tag 200 μL resuspenderede tumorceller i PBS og tilsæt direkte til kælder membranen ved hjælp af en forkølet 200 μL pipettespids.
- Tag en frisk, forkølet P1000-pipettespids, sæt pipetten på 300 μL, og resuspender 30-40 gange. En større pipettespids, der er indstillet på en lav lydstyrke, er at foretrække, da kælder membranen kan rejse op i spidsen og røre ved pipettespids filteret under resuspension.
- Tumorcellerne er klar til injektion. Hold tumor celle/kælder membran på is under kirurgi.
2. ortotopisk injektion af tumorceller
- Acclimate musene i dyret facilitet i 7 dage.
- Ca. 2 timer før operationen barberer man venstre side af maven og ryggen, og derefter administreres præoperativt analgetikum subkutant under halsen (buprenorphin ved 50-100 μg/kg).
- Forbered kirurgisk felt, med en varmemåtte til at lægge musen på og gardiner til omgivende udstyr og over musen. Steriliser alle kirurgiske værktøjer; Forbered nok sæt af værktøjer til hver mus.
- Placer musen i en 5% isofluran med O2 kammer indtil bevidstløs.
- Overfør musen, liggende på ryggen, på en varmemåtten og vedligeholde anæstesi ved hjælp af en maske, normalt ved en lavere 2-3% isofluran.
- Bekræft dyb anæstesi; som identificeret ved tab af pedal-abstinens refleks, når bagpote er klemt og overvåge vejrtrækning forbliver konstant.
- Dække kroppen i Drape, med kun den barberede del eksponeret. Sørg for, at musen er sikkert i anæstesi masken.
- Ved hjælp af en steril bomuld knop, tilsæt jod opløsning i en cirkulær bevægelse over det barberede område: startende fra midten og kredsning ud til kanten. Gentag processen igen med frisk bomuld opløbet og jod.
- Brug skalpel til at lave et 1 cm snit direkte over bugspytkirtlen/milten placering (øverste venstre kvadrant). Steril saks kan også bruges til at gøre snittet, hvis det foretrækkes.
- Træk huden fra hinanden ved hjælp af pincet. Med nye pincet skal du finde den peritoneale væg og bruge en saks til at lave yderligere 1 cm snit gennem peritonealdialyse væggen.
- Uddrag bugspytkirtlen, som kan komme med milten, fra kroppen ved hjælp af det andet par tang.
- Vend forsigtigt hætteglasset med tumorceller/kælder membran flere gange for at blande.
- Forbered glassprøjten med 5 μL indeholdende 1.000 tumorceller i kælderen membran og Placer på varmemåtten i et par sekunder for at gøre det muligt at varme.
Bemærk: den korte opvarmning af sprøjten vil gøre det muligt for kælder membranen at begynde at størkne, for at gøre det lettere at injicere uden lækage. Men dette skal holdes kort, hvis venstre for længe kælderen membran vil størkne helt og vil ikke blive injiceret. Brug af en glassprøjte gør det muligt at injicere et lavt volumen præcist. - Hold bugspytkirtlen i halen for at forlænge den og indsætte nålen direkte ind i midten af bugspytkirtlen, parallelt med bugspytkirtlen selv med en indsats for at undgå synlige blodkar.
Bemærk: midten af bugspytkirtlen har et stort område, og det er nemmest at injicere. Men, hovedet eller halen af bugspytkirtlen kan også specifikt injiceres, hvis det foretrækkes. - Injicer langsomt 5 μL af kælder membranen i bugspytkirtlen og hold nålen stabil i bugspytkirtlen i mindst 30 s efter injektion for at give kælder membranen mulighed for at størkne og forhindre lækage. Kælderen membran bør være synlig som en lille klar boble vil have dannet; Det er dog muligvis ikke synligt.
Bemærk: større mængder af tumorceller/kælder membran kan injiceres; det nøjagtige volumen skal dog testes for at sikre, at der ikke opstår lækage. - Fjern nålen fra bugspytkirtlen og vente med at bekræfte ingen blødning er forekommet. Indsæt forsigtigt bugspytkirtlen tilbage i bughulen, passe på ikke at røre kælderen membran boble.
- Træk peritonealvæggen sammen og Udfør en enkelt sutur eller to afbrudte suturer, hvis det er nødvendigt.
- Træk de to sider af indsnit i huden sammen, og Udfør flere afbrudte suturer efter behov, eller Indsæt to kirurgiske clips.
- Administration af en anden subkutan injektion af buprenorphin i Scruff.
- Overfør musen til et opvarmet 37 °C bur i mindst 30 min efter operationen for at opretholde kropstemperaturen, før du overfører tilbage til et nyt bur.
- Forbered en mash kost til rådighed i buret, for at sikre rehydrering og kropsvægt.
- Gengiv postoperativ analgesi som anbefalet, og se nøje efter tegn på såråbning, smerte eller infektion og vægttab. Hvis du bruger kirurgiske clips, kan disse fjernes 7-10 dage senere ved hjælp af en Clip Remover.
- Efter omkring 14 dage arvæv vil have helet tilstrækkeligt til at begynde at palpere maven. Overvåg tumorstørrelse tæt via palpering indtil mus nå endepunkt.
- Ved endepunkt er musen nedslået via cervikal dislokation efterfulgt af decapitation. Huden og bughulen åbnes ved hjælp af en saks og bugspytkirtlen tumor fjernet ved hjælp af pincet til at holde tumoren, og saks til at fjerne omgivende væv.
3. fordøjelse af pancreastumorer
- Placer den dissekeret bugspytkirtel tumor, metastatisk site tumorer, eller sundt pancreas væv i iskold PBS, og opbevar på is.
- Brug pincet til at overføre tumoren på en Petri skål.
- Der tilsættes 5,0 mL fordøjelses medium (2 mg/mL collagenase, 0,025 mg/mL DNase RPMI) til et 50 mL rør; opbevares på is for at forhindre enzymaktivitet i at påbegyndes.
Bemærk: denne protokol bruger collagenase type V, som har en aktivitet på ≥ 1 enheder/mg FALGPA og > 125 kollagen nedbrydnings enheder (CDU)/mg solid. Collagenase og DNase aliquoter kan opbevares ved-20 °c og optøet på is før brug. Når begge er fuldstændig opløseliserede i steril RPMI, kan de ledes gennem et 0,2 μm filter for at fjerne kontaminanter. Collagenase skal være helt opløst biliseret før filtrering for at undgå tab af materiale. - Tag en lille alikvot af denne løsning til at dække tumoren på Petri skålen.
- Brug steril skalpel og tang til at skære tumoren i små stykker, groft mindre end 3 mm i længden.
- Skrabe tumorstykkerne ind i røret og vend forsigtigt røret, indtil alle brikkerne er nedsænket i fordøjelses mediet. Opbevares på is, hvis andre tumorprøver skal tilberedes i et parti.
- Overfør på en ryste anordning i 20 min ved 37 °C. Sørg for, at alle stykker af tumor er nedsænket og ikke fast til kanten af røret. Hvis rystelser ikke er muligt, så vortex prøven hver 5 min til at hjælpe fordøjelsen.
4. klargøring af enkelt cellesuspension fra fordøjet tumor
- Umiddelbart efter fordøjelsestrinnet placeres røret på is til langsom enzymaktivitet.
- Tilsæt EDTA for at opnå en endelig koncentration på 20 mM og kortvarigt vortex prøve at blande. Dette vil yderligere langsom enzymaktivitet.
- Åbn røret og skyl enhver tumor Digest ud af låget på røret med frisk RPMI medium.
- Forbered en 70 μm si (μm størrelse af sien kan ændres som ønsket) på en 50 ml åbent rør, på is.
- Forvåd filteret med medium.
- Resuspendere de Ford øjede celler og vaske siderne af røret ved hjælp af en 25 mL stripette, eller større. Den bredere åbning af stripette er vigtigt at tillade den tykke fordøje at passere let.
- Overføre alle de Digest, ved hjælp af 25 mL stripette, på Strainer.
- Mash tumoren oven på filteret ved hjælp af en 1 mL sprøjte stempel. Mash kun direkte op og ned for at minimere forskydnings stress til celler.
- Kontinuerligt vaske celler gennem si med rpmi. Sørg for at vaske med nok kraft til at skubbe cellerne igennem.
- Hvis der stadig er materiale til mash, men RPMI stopper rødmen igennem, vil sien blive mættet. Overfør derfor prøven til et nyt filter, og Fortsæt.
Bemærk: til sidst vil kun ekstracellulære matrixkomponenter forblive i filteret, alle enkeltceller skulle have passeret igennem.
- Centrifugeglasset centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g og 4 °c.
- Resuspender forsigtigt celle pellet i komplet RPMI og passere direkte gennem et andet filter for at fjerne eventuelle ekstracellulære matrix eller store celle klumper, der ikke kan være tilstrækkeligt resuspenderet.
- På dette tidspunkt, hvis der ikke er behov for stimulation, straks plette de isolerede celler til flow flowcytometri analyse ved at springe til trin 6,1. Alternativt kan de resuspenderes i fryse middel (10% DMSO i FBS) og opbevares ved-80 °C efterfulgt af langtidsopbevaring i flydende nitrogen.
Bemærk: fryse trinnet kan tillade rensning af immunceller på et senere tidspunkt; imidlertid kan kvantificeringen af immuncelle undersæt kræve optimering for at bekræfte, at cellenumre og fænotype ikke påvirkes af fryse/tø-processen. Ex vivo T celle stimulation er bedst udføres på friske tumorprøver. På dette tidspunkt kan prøven renses yderligere ved vulst baseret død celle fjernelse eller immuncelle berigelse assays, hvis det kræves.
5. klargøring af celler til ex vivo -stimulation
- Tæl cellerne for at opnå en koncentration på 2 x 106/100 μl i komplet medium (rpmi 10% FBS, 1x penicillin og 1x streptomycin).
Bemærk: det høje antal af samlede celler belagt sikrer, at der vil være tilstrækkelige T-celler i denne prøve til at analysere. Antallet kan dog skaleres op eller ned afhængigt af prøve tilgængeligheden og den sjældne natur af T-celle-delgrupper af interesse.- Plade 100 μL af cellerne i en U-bottomed 96-brønd plade.
- Der tilsættes 100 μL komplet medium indeholdende en 2x præparat af PMA/ionomycin (for at opnå en slutkoncentration på henholdsvis 0,081 μM og 1,34 μM som anbefalet af producenten).
Bemærk: Hvis du måler degranulering/exocytose, skal du også her se en fluorescently konjugeret anti-muse CD107a i medierne. En kontrolprøve, der ikke indeholder CD107a, skal også udføres. - Placer i 37 °C inkubator med 5% CO2 i 1 time.
- Der tilsættes 20 μL af en 10x præparat af brefeldin A og monensin (for at opnå en slutkoncentration på henholdsvis 1,06 μM og 2,0 μM (som anbefalet af producenten) i komplette medier.
Bemærk: Brefeldin A og monensin er protein transport inhibitorer og blokerer således ekstracellulær frigivelse af cytokiner osv., hvilket gør det muligt at påvise dem ved flow cytometri. Hvis du måler cytokinfrigivelse i supernatanten ved ELISA eller lignende metoder – så kan dette trin springes over. - Pladen placeres i en 37 °C-inkubator med 5% CO2 i yderligere 4 timer.
6. ekstracellulær og intracellulær farvning til strømnings cytometri
- Fjern pladen og resuspension hver brønd for at overføre alt materiale til en V-bundet plade, placeret på is.
Bemærk: Epiteliale celler, makrofager og andre vedlige celler kan ikke fuldt ud hentes ved at resuspendere. Men da downstream-analysen kun er på T-celler, er dette ikke et problem.- 6.1.1 centrifuge pladen centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g og 4 °c (Brug disse betingelser for efterfølgende trin, medmindre andet er angivet).
- Fjern supernatanten ved at fslikke pladen på hovedet i en skarp bevægelse.
- Resuspension i 50 μL af en fixable levedygtighed farvestof, tilberedt i iskold PBS. Indstil pipetten til en lavere lydstyrke ved opsuspension for at undgå at lave bobler.
- Inkuber i 20 minutter ved 4 °C, i mørke.
- Vask trin: Tilsæt 100 μL af FACS buffer, centrifuger og Fjern supernatanten.
- Resuspension hver brønd med 50 μL anti-CD16/CD32-(2,5 μg/mL) i FACS buffer (0,5% BSA, 2,0 mM EDTA i PBS) for at blokere ikke-specifik binding af detektionsantistoffer til FC-receptorer.
- Inkuber i 15 min ved 4 °C, i mørke.
- Tilføj direkte til hver brønd en 2x mastermix af fluorochrome-konjugeret anti-Mouse CD45, CD3, CD4 og CD8 (yderligere ekstracellulære markører kan tilføjes som ønsket) i FACS buffer.
- Inkuber i 30 min ved 4 °C, i mørke.
- Vask trin: Tilsæt 100 μL af FACS buffer, centrifuger og Fjern supernatanten.
- Tilsæt 100 μL 1x intracellulær (IC) fikserings buffer og Inkuber i 30 min ved RT, i mørke.
- Forbered centrifugen ved RT.
- Tilsæt 100 μL FACS buffer, centrifuge i 5 min ved 300 x g og RT og Fjern supernatanten. Gentag med 1x permeabilization buffer og centrifuge i 5 min ved 300 x g; Fjern derefter supernatanten.
- Tilsæt 50 μL 1x mastermix af fluorochrome-konjugeret anti-mus IFNγ, TNFα, og andre intracellulære markører udarbejdet i 1x permeabilization buffer.
- Inkuber i 1 time ved RT, i mørket.
- Tilsæt 100 μL permeabiliserings buffer til vask. Centrifugér derefter i 5 minutter ved 300 x g og RT og Fjern supernatanten.
- Tilsæt 100 μL af FACS buffer til vask, centrifuge i 5 min ved 300 x g og RT og Fjern supernatanten.
- Efter denne sidste centrifugering, resuspension celler i en volumen kompatibel for flow cytometer. Det kan variere afhængigt af størrelsen af FACS rør.
- Denne mængde overføres til de relevante FACS-rør til erhvervelse.
- Dæksel fra lys og opbevares i køleskabet og erhverve prøverne inden for 24 h.
Representative Results
Efter injektion af 1000 TB32048 celler i bugspytkirtlen, ortotopiske tumorer tage ca 30 dage at udvikle (figur 1A, B). Kælder membran lækage under operationen kan forårsage store tumorer til at danne direkte på peritonealdialyse væggen, som er tydeligt synlige gennem huden (figur 1C). Vi ville fjerne disse mus fra studiet. Men med gode kirurgiske færdigheder er forekomsten af lækage minimeret. Ortotopiske tumorer høstet ved endepunkt kan vokse til en betydelig størrelse i C57BL/6 vild-type mus (figur 1D). Høstede ortotopiske tumorer kræver fordøjelse i collagenase/DNase i 20 min for at opnå en enkelt cellesuspension (figur 2). På dette tidspunkt, tumor-afledte celler kan være belagt i en U-bottomed plade på 2 x 106 celler/godt. Antallet af belagte celler kan ændres afhængigt af forekomsten af T-celler i prøven; celle nummeret kan sænkes, hvis T-cellerne har en høj densitet. Kontrol milt eller lymfeknude prøver kan også være belagt på dette punkt for stimulation. Hver brønd stimuleres med PMA og ionomycin i 5 timer, og efter 1 h inkubation tilsættes brefeldin A og monensin for at blokere ekstracellulær frigivelse af cytokiner (figur 2). Efter inkubationen farves der prøver til ekstracellulære epitoper og intracellulære cytokiner til analyse ved flowcytometri (figur 2).
Prøver af milt og tumorer fra mus, der bærer ortotopiske tumorer, blev analyseret ved flow cytometri. Den gating strategi, der anvendes i flow flowcytometri analyse for milten og ortotopisk tumorer udelukker snavs ved hjælp af FSC-a, SSC-a, form af FSC-a/FSC-H og SSC-a/SSC-W, derefter døde eller apoptotiske celler som positiv for fixable levedygtighed farvestof (figur 3A). Immunceller er derefter gated på som CD45+, og T-celler yderligere gated på som CD3+ hvorfra CD4+ og CD8+ undergrupper er defineret (figur 3A). En fluorescens minus en (FMO) udføres for at bestemme baggrunds fluorescens for gating og en brefeldin A/monensin kun kontrol udføres for at bestemme basal produktion af cytokiner (figur 3B-D).
For IFNγ resulterede inkubation med brefeldin A/monensin ikke i stigning i IFNγ over FMO-kontrol i både milt-og tumorprøver. Men, tilsætning af PMA og ionomycin øget% af intracellulære IFNɣ detekterbare i både milt og tumor-afledte CD4+ og CD8+ T celler.
Spleniske CD4+ og CD8+ T- celler, der anvendes som en positiv kontrol, har en relativt højere ifnγ-produktion end tumor infiltrerende T-celle undersæt med et gennemsnit på 6,60 ± 1,5% og 12,97 ± 3,4% sammenlignet med 4,81 ± 1,0% og 4,13 ± 1,3%, hvilket indikerer immunsuppression i tumoren (figur 3B og 4a). Ved hjælp af den samme strategi for TNFα visualiserede vi, at en høj procentdel af spleniske CD4+ t- celler er positive for intracellulære tnfα (65,93 ± 2,3%) sammenlignet med tumor INFILTRERENDE CD4+ t-celler (22,45 ± 5,4%). Splenic-og tumor infiltrerende CD8+ T- celler producerer tilsvarende niveauer af tnfα (henholdsvis 25,15 ± 3,7% og 19,91 ± 5,1%) (figur 3C, figur 4B).
Endelig, CD107a er en endosomal markør, der udtrykkes transitivt på cellens overflade under exocytose af cytotoksiske granulat og cytokiner, som sådan, det bruges som en surrogatmarkør for cytotoksicitet. Fordelen ved farvning for CD107a under stimulation er, at alle transitivt celle-overflade udtrykt CD107a vil blive fanget af fluorescerende-antistof. De basale niveauer af CD107a er vist i brefeldin A/monensin kun behandlede celler. For milt CD8+ T-celler øger stimuleringen med PMA/ionomycin niveauet af CD107a detekteret, med den stærkeste docetaxels Opregulering i CD8+ celler, som var 23,95 ± 3,5% CD107a+, sammenlignet med 5,8 ± 1,9% i tumor infiltrerende CD8+ celler, hvilket indikerer, at splenisk CD8+ havde en større grad af degranulering. På den anden side udtrykte splenisk og tumor infiltrerende CD4+ sammenlignelige niveauer på CD107a 9,37 ± 1,5% og 11,50 ± 1,8% (figur 3D og 4c).
Samlet set disse resultater fremhæve, at ortotopisk tumorer kan genereres fra injektion af et meget lavt antal (1.000) af tumorceller i bugspytkirtlen. Disse tumorer kan hurtigt fordøjes til isolering af T-celler for ex vivo stimulation. Påvisning af intracellulære cytokiner er mulig og fremhæver basal niveauet af immunsuppression af infiltrerende T-celler, sammenlignet med T-celler i sekundære lymfoide organer.
Figur 1: generation af ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen. A) tidsplan for in vivo -forsøg. B) det makroskopiske udseende af ortotopiske tumorer i bughulen (venstre) og efter excision (højre), hvor tumoren er blevet skåret i halve. (C) dokumentation for kælder membran lækage under operationen kan forårsage tumorer til at udvikle, som er synlige gennem huden (øvre foto) og form på peritonealdialyse væggen (lavere foto). D) ortotopiske tumor vægte høstet fra mus, som havde nået endepunktet (n = 22). Hvert datapunkt repræsenterer en individuel mus, søjlediagram viser gennemsnit ± SEM. Dataene i dette tal er blevet ændret fra tidligere udgivet arbejde10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk behandling af ortotopiske tumorer for ex vivo T-celle stimulation. Efter høst, bugspytkirtel tumorer hurtigt fordøjes i collagenase (2 mg/mL) og DNase (0,025 mg/mL) for 20 min ved 37 °C. Herefter resuspenderes cellerne ved 2 x 106/ml i komplette rpmi-medier og belagt i en U-bundet plade. En stimulerings cocktail af PMA og ionomycin tilsættes i 5 timer, hvorefter anti-Mouse CD107a antistof også kan tilsættes til kulturen. Efter 1 h inkubation tilsættes de intracellulære transport blokkere, brefeldin A og monensin. Efter ex vivo -stimulation overføres cellerne til et v-bundet plade til farvning med det fixable levedygtighed farvestof (i PBS) i 20 min. 4 °c. Cellerne vaskes i FACS buffer og inkuberet i anti-CD16/32 (FcR blok) i 15 min (i FACS buffer) og derefter inkuberet med ekstracellulære fluorescerende konjugerede antistoffer i yderligere 30 min (i FACS buffer). Cellerne vaskes igen i FACS buffer og resuspenderes i intracellulær fikserings buffer i 20 min. Efter dette, celler vaskes en gang i FACS buffer og en gang i 1x permeabilization buffer. Cellerne resuspenderes i 1 time ved RT i intracellulære fluorescerende konjugerede antistoffer i 1 time (i 1x permeabiliseringbuffer). Cellerne vaskes én gang i 1x permeabiliseringspakket og en gang i FACS-buffer, før de opblandes i FACS-buffer til erhvervelse på flowcytometer inden for 24 timer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: flowcytometri-analyse af ex vivo -stimulerede milt-og tumor afledte T-celler. (A) flow cytometri gating strategi anvendes for milt (positive Control) og ortotopisk tumorer prøver. Celler diskrimineres fra snavs ved hjælp af FSC-a/SSC-A og enkeltceller er yderligere isoleret ved hjælp af FSC-A/FSC-H og SSC-A/SSC-W. Døde eller apoptotiske celler er udelukket ved hjælp af fixable levedygtighed Dye-FVD506 og immunceller er gated på af CD45+. Efter denne CD3+ T celler og CD4+ og CD8+ undergrupper er defineret. Data blev indhentet på en BD Fortessa. B) den gating- strategi, der anvendes til at kvantificere ifnγ + CD4+ -og CD8+ T-celler. En fluorescerende minus en (FMO) kontrol anvendes på fuldt stimulerede prøver (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) til at bestemme baggrunden fluorescens. En brefeldin A/monensin kun kontrol (kun B + M) anvendes til at bestemme basal cytokin produktion. Den fuldt stimulerede prøve anvendes derefter til at beregne% IFNγ+ T- cellerne. C) den gating-strategi, der anvendes til at kvantificere TNFα+ CD4+ -og CD8+ T-celler. Der anvendes en FMO-kontrol på fuldt stimulerede prøver (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) til at bestemme baggrunds fluorescensen. En brefeldin A/monensin kun kontrol (kun B + M) anvendes til at bestemme basal cytokin produktion. Den fuldt stimulerede prøve anvendes derefter til at beregne% TNFα+ T- cellerne. D) den gating-strategi, der anvendes til at definere CD107a+ CD4+ og CD8+ T- celler. Der anvendes en FMO-kontrol på fuldt stimulerede prøver (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) til at bestemme baggrunds fluorescensen. En brefeldin A/monensin kun kontrol (kun B + M) anvendes til at bestemme basal degranulering. Den fuldt stimulerede prøve bruges derefter til at beregne% CD107a+ T- cellerne. Alle flow cytometri data blev analyseret på FlowJo version 10.6.1. Dataene i dette tal er blevet ændret fra tidligere udgivet arbejde10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: kvantificering af ex vivo milt-og tumor afledt T-celle aktivitet. Andelen af CD4+ og CD8+ T- celler positiv for (A) ifnγ+ (B) tnfα+ og (C) CD107a+ blev kvantificeret i milten (n = 4) og tumor (n = 7) af ortotopiske-tumor bærende mus. Hvert datapunkt repræsenterer en individuel mus og fejllinjer viser gennemsnit ± SEM. Statistisk signifikans blev testet ved hjælp af en uparret t-test, hvor * = p < 0,05 og * * * = p < 0,001. Alle data blev analyseret ved hjælp af Prism 8. Dataene i dette tal er blevet ændret fra tidligere udgivet arbejde10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
In vivo modeller af kræft i bugspytkirtlen giver uvurderlige værktøjer til at forstå sygdomsprogression og vurdere nye Therapeutics mål3. Den ortotopiske model i særdeleshed er en omkostningseffektiv og reproducerbar model, der kan anvendes i store kohorter af mus samtidigt4,27. Den ortotopiske model giver også den cognate mikromiljø og intakt immunsystem for tumorvækst, hvilket gør det mere passende end den subkutane og PDX-modeller. Men vi har konstateret, at nogle elementer af immun infiltration kan variere mellem ortotopisk model og KPC mus, guld-standard murine model10. En af grundene til dette kunne være den accelererede tumorvækst set i ortotopisk model. Yderligere forskelle i tætheden af immuncelle undersæt er blevet beskrevet mellem ortotopiske og subkutane modeller3,28. Selv om den transgene KPC-model er dyrere og variabel6, bør de vigtigste resultater derfor verificeres i en lille kohorte af KPC-mus, hvor det er muligt.
Forberedelsen af tumorceller til ortotopisk kirurgi er et kritisk skridt i protokollen. Celler bør altid være i loggen fase af vækst og Mycoplasma-og infektion-fri. Ortotopisk kirurgi bør udskydes, hvis der er nogen bekymringer over tumorcellevækst. Brugen af kælder membran forbedrer tumor incidensrate over intravenøse celler uden det29 og reducerer celle lækage og dermed peritonealdialyse spredning27. Men, når suspenderet i kælderen membran, tumorceller bør hurtigt injiceres (inden for 2 timer) for at undgå enhver celle tab. Antallet af tumorceller, der kræves for at generere tumorer, vil sandsynligvis være celle afhængige, og en række cellenumre skal testes (f. eks. fra 100 – 100.000), som også kan bestemme tidspunktet for at nå endepunktet. Det er sandsynligt, at der vil være en fejlmargin, når du forbereder 1.000 celler per mus til injektion; Derfor, hvis flere dage af kirurgi er påkrævet, behandling af grupper bør spredes ligeligt på tværs af dage til at kontrollere for batch-effekter. De fleste kirurgiske trin kan ændres afhængigt af præferencer; dog skal man være forsigtig med ikke at forstyrre kælder membranen, når man udskifter bugspytkirtlen i bughulen eller lukker peritonealdialyse væggen. Kælder membran lækage kan forårsage tumorcellevækst på peritonealdialyse væggen, som danner hurtigt og kan resultere i at skulle ofre dyret tidligere.
Ideelt, bugspytkirtel tumorer bør hurtigt fordøjet efter høst og forberedt til ex vivo stimulation straks. Men, dette kan ikke være muligt, hvis der er et stort parti af tumorer at høste, i dette tilfælde tumorer bør holdes på is og fordøjet i partier. Typen, koncentrationen og længden af udsættelse for fordøjelsesenzymer har alle vist sig at påvirke et stort antal overflade molekyler på immunceller30,31,32. Fordøjelsestiden er også bevidst kort til at begrænse celledød33. Ford øjede celler kan fryses ned i fryse medium til langtidsopbevaring; Men, nogle celletab vil forekomme, når optøning. Fordøjelsesprocessen kan være mindre end optimal, hvis tumor stykker ikke er tilstrækkeligt tern før kollagenase inkubation og dette vil være indlysende som hårde tumor stykker vil forblive i filteret efter fordøjelsen. Kollagenase koncentrationen kan sænkes, hvis du arbejder med sund bugspytkirtel eller tidligt stadie tumorer; rapporter om udvinding sunde pancreas duktalt celler bruger betydeligt lavere koncentrationer34. En høj grad af epitelial celledød kan forventes under fordøjelsen; Men, immunceller bør tolerere processen godt. Alternative metoder findes for at isolere levedygtige epiteliale celler for organoid vækst35 eller for at bevare væv arkitektur36.
Modifikationer til stimulerings protokollen kan gøres let, afhængigt af den ønskede udlæsning og immuncelle analyseret (f. eks. makrofager eller B-celler). Brugen af panstimulations reagenser PMA/ionomycin diskriminerer ikke for TCR-antigen specificitet, hvilket gør det nyttigt, når antigenet ikke er kendt. Imidlertid er produktionen af IFNɣ tæt forbundet med TCR engagement37 og både IFNɣ og TNFα produktion er kritiske i pdac antitumoral svar38. Stimulering af PMA/ionomycin afspejler den maksimale kapacitet af T-celler til fremstilling af cytokiner, som måske eller måske ikke produceres af T-cellerne i Tumorens mikromiljø. Endogene produktion kan måles uden behov for stimulation; niveauerne kan dog være langt lavere eller ikke målbart. Der er alternative metoder til at stimulere T-celler: anti-CD3/28-belagte perler, som heller ikke kræver antigen eller andre immuncelle populationer. Fordelen ved denne metode er at gøre det muligt at kvantificere cytokinproduktion ved specifikke T-celle undersæt uden behov for separations metoder. Andre markører for cytotoksicitet (granzyme B og Perforin A), aktivitet (IL-2) eller immunsuppression (IL-10) kan også tilsættes21. Der findes imidlertid ikke flow cytometri af høj kvalitet til påvisning af alle cytokiner og interesse faktorer. Derfor, hvis der er andre applikationer såsom ELISA kræves stimulation kan udføres uden optagelse af brefeldin A/monensin, tillader cytokin frigivelse i supernatanten. Men, af note, dette vil tillade total Cell cytokin frigivelse og det vil ikke være muligt at bestemme, hvilke cellepopulationer bidrog.
Ifnγ produktion er et dominerende træk ved en antitumoralsk T-celle respons, der ofte anvendes som erstatning for TCR-antigen genkendelse37,38. Andre in vivo metoder, der mere præcist definerer antigen-specifikke reaktioner udnytte tumorceller udtrykker en kendt antigen, såsom ovalbumin eller SV40. Det universelle antigen kan derefter anvendes ex vivo til at teste T-celle genkendelse eller i kombination med en TCR-begrænset værts mus. Alternativt, hvor antigenet er ukendt, kan kvantificering af T-celle klonal ekspansion udføres ved bulk-TCR-sekvensering eller for nylig enkelt celle-TCR-sekvensering39,40. For fuldt ud at forstå tilstanden af intratumoral T-celle respons, bør markører, der indikerer udmattelse eller hæmmende receptorer, også måles, herunder: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Samt markører for Effector T-celler (CD44Hi, CD62Lo) og proliferativ aktivitet, Ki67+ eller csfe fortynding41,42,43,44. Samlet set, den ortotopisk model giver en nyttig platform til hurtigt at teste terapeutiske strategier, især der kan modulere den antitumoral T-celle respons, der kan derefter valideres på en mindre kohorte af transgene, KPC, mus.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Animal Technician service og Dr. Alzbeta Talarovicova (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannien) for deres assistance under ortotopisk kirurgi. Vi vil også gerne takke Dr. Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, Storbritannien) for hendes vejledning i kirurgisk teknik, Dr. Cristina Ghirelli (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannien) for hendes råd om tumor fordøjelse og Dr. Fabienne McClanahan (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannien) for hendes råd om ex vivo T celle stimulation protokoller. Vi vil også gerne takke det medicinske Forskningsråd (MRC), kræft i bugspytkirtlen forskning Fund (PCFR) og kræft i æggestokkene, der finansierede denne forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures | Ethicon | W9500T | |
| 70 μm pore-size cell strainer | Fisher Scientific | 11597522 | |
| 9 mm Clay Adams clips | VetTech Solutions | IN015A | |
| anti-CD107a PE (clone 1D4B) | Biolegend | 121612 | 1:100 to culture media |
| anti-CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Use at final dilution 1:200 |
| anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) | Biolegend | 46-0032 | Use at final dilution 1:50 |
| anti-CD4 FITC (clone GK1.5) | eBioscience | 11-0041 | Use at final dilution 1:100 |
| anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) | Biolegend | 103140 | Use at final dilution 1:200 |
| anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) | Biolegend | 100738 | Use at final dilution 1:100 |
| anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) | Biolegend | 505826 | Use at final dilution 1:50 |
| anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) | Biolegend | 506314 | Use at final dilution 1:50 |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | BD Biosciences | 354248 | Aliquot on ice and store in -20 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) | eBioscience | 00-4970-03 | 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM |
| Clay Adams Autoclip Applier | VetTech Solutions | IN015B | |
| Clay Adams Autoclip remover | VetTech Solutions | IN015B | |
| Collagenase Type V from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9263 | 2 mg/mL in media |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
| DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine | PAA | E15-810 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl | Sigma-Aldrich | D4513 | Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL |
| Fixable Viability Dye 506 (FVD506) | eBioscience | 65-0866 | Use at 1:200 in PBS |
| Foetal calf-serum (FCS) | GE Healthcare | A15-104 | 10% in RPMI |
| Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip | Fisher Scientific | 10100332 | |
| Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer | eBioscience | 88-8824-00 | Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O |
| Penicillin/streptomycin | PAA | 15140122 | 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
| Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) | eBioscience | 00-4980-03 | 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM |
| RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Surgical Scalpel Blade No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
| Trypsin-EDTA Solution 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration |
| U-bottomed 96 microwell plate | VWR | 734-2080 | |
| Universal Cotton Tipped Applicators - 6 inch x 100 | Medisave | UN982 | |
| V-bottomed 96 microwell plate | VWR | 735-0184 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Conroy, T., et al. Current standards and new innovative approaches for treatment of pancreatic cancer. European Journal of Cancer. 57, 10-22 (2016).
- Lee, J. W., Komar, C. A., Bengsch, F., Graham, K., Beatty, G. L. Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer: The KPC model (LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre), its variants, and their application in immuno-oncology drug discovery. Current Protocols in Pharmacology. 2016, (2016).
- Tseng, W. W., et al. Development of an Orthotopic Model of Invasive Pancreatic Cancer in an Immunocompetent Murine Host. Clinical Cancer Research. 16 (14), 3684-3695 (2010).
- Majumder, K., et al. A Novel Immunocompetent Mouse Model of Pancreatic Cancer with Robust Stroma: a Valuable Tool for Preclinical Evaluation of New Therapies. Journal of Gastrointestinal Surgery. 20 (1), 53-65 (2016).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. Integrated Patient-Derived Models Delineate Individualized Therapeutic Vulnerabilities of Pancreatic Cancer. Cell Reports. , (2016).
- Nicolle, R., et al. Pancreatic Adenocarcinoma Therapeutic Targets Revealed by Tumor-Stroma Cross-Talk Analyses in Patient-Derived Xenografts. Cell Reports. , (2017).
- Spear, S., et al. Discrepancies in the Tumor Microenvironment of Spontaneous and Orthotopic Murine Models of Pancreatic Cancer Uncover a New Immunostimulatory Phenotype for B Cells. Frontiers in Immunology. 10, 542 (2019).
- Zhu, Y., et al. CSF1/CSF1R blockade reprograms tumor-infiltrating macrophages and improves response to T-cell checkpoint immunotherapy in pancreatic cancer models. Cancer Research. , (2014).
- Lee, J. J., Huang, J., England, C. G., McNally, L. R., Frieboes, H. B. Predictive Modeling of In vivo Response to Gemcitabine in Pancreatic Cancer. PLoS Computational Biology. , (2013).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the Immune Reaction to Pancreatic Cancer from Inception to Invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Fukunaga, A., et al. CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes together with CD4+ tumor-infiltrating lymphocytes and dendritic cells improve the prognosis of patients with pancreatic adenocarcinoma. Pancreas. 28 (1), 26-31 (2004).
- Tewari, N., et al. The presence of tumor-associated lymphocytes confers a good prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma: an immunohistochemical study of tissue microarrays. BMC Cancer. 13 (1), 436 (2013).
- Royal, R. E., et al. Phase 2 Trial of Single Agent Ipilimumab (Anti-CTLA-4) for Locally Advanced or Metastatic Pancreatic Adenocarcinoma. Journal of Immunotherapy. 33 (8), 828-833 (2010).
- Brahmer, J. R., et al. Safety and Activity of Anti–PD-L1 Antibody in Patients with Advanced Cancer. New England Journal of Medicine. 366 (26), 2455-2465 (2012).
- Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
- Beatty, G. L., et al. CD40 Agonists Alter Tumor Stroma and Show Efficacy Against Pancreatic Carcinoma in Mice and Humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
- Lutz, E. R., et al. Immunotherapy converts nonimmunogenic pancreatic tumors into immunogenic foci of immune regulation. Cancer Immunology Research. 2 (7), 616-631 (2014).
- Barry, M., Bleackley, R. C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. Nature Reviews. Immunology. 2 (6), 401-409 (2002).
- Mojic, M., Takeda, K., Hayakawa, Y. The dark side of IFN-γ: Its role in promoting cancer immunoevasion. International Journal of Molecular Sciences. , (2018).
- Castro, F., Cardoso, A. P., Gonçalves, R. M., Serre, K., Oliveira, M. J. Interferon-gamma at the crossroads of tumor immune surveillance or evasion. Frontiers in Immunology. , (2018).
- Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nature Immunology. , (2011).
- Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).
- Schuerwegh, A. J., De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Stevens, W. J. Comparison of intracellular cytokine production with extracellular cytokine levels using two flow cytometric techniques. Cytometry. 55 (1), 52-58 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the panc02 and 6606PDA cell lines. European Surgical Research. , (2011).
- An, X., et al. Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Jiang, Y. J., et al. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: Cells suspended and injected in Matrigel. World Journal of Gastroenterology. , (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2017).
- Liu, Q., et al. Effects of enzymatic digestion, cell culture and preservation conditions on surface CD62L expression of primary murine CD3+CD4+T cells. Biomedical Research (India). 29 (10), 2153-2159 (2018).
- Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO Journal. , (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. , (2015).
- Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. , (2019).
- Moran, A. E., Polesso, F., Weinberg, A. D. Immunotherapy Expands and Maintains the Function of High-Affinity Tumor-Infiltrating CD8 T Cells In Situ. The Journal of Immunology. , (2016).
- Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. , (2015).
- Singh, M., et al. High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes. Nature Communications. 10 (1), 3120 (2019).
- Jiang, N., Schonnesen, A. A., Ma, K. Y. Opinion Ushering in Integrated T Cell Repertoire Profiling in Cancer. Trends in Cancer. 5, 85-94 (2019).
- Schietinger, A., et al. Tumor-Specific T Cell Dysfunction Is a Dynamic Antigen-Driven Differentiation Program Initiated Early during Tumorigenesis. Immunity. 45 (2), 389-401 (2016).
- Raghav, S. K., et al. Exhaustion of tumor-specific CD8+ T cells in metastases from melanoma patients. Journal of Clinical Investigation. , (2011).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific in filtrating human tumors. The Journal of Clinical Investigation. , (2014).
- Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8 + T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. , (2019).
