Summary
Hier presenteren we een protocol om de totale cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (DCFH-DA). Deze methode kan cellulaire ROS lokalisatie visualiseren in aanhangende cellen met een fluorescentiemicroscoop en ros intensiteit kwantificeren met een fluorescentieplaatlezer. Dit protocol is eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief.
Abstract
Oxidatieve stress is een belangrijke gebeurtenis onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. In deze studie laten we zien hoe oxidatieve stress te kwantificeren door het meten van de totale reactieve zuurstof soorten (ROS) met behulp van 2',7',7's ofgfohydrofluoresceïne diacetaat (DCFH-DA) kleuring in colorectale kanker cellijnen als voorbeeld. Dit protocol beschrijft gedetailleerde stappen, waaronder de voorbereiding van dcfh-DA-oplossing, incubatie van cellen met DCFH-DA-oplossing en meting van genormaliseerde intensiteit. DCFH-DA kleuring is een eenvoudige en kosteneffectieve manier om ROS in cellen te detecteren. Het kan worden gebruikt om ROS generatie te meten na chemische behandeling of genetische modificaties. Daarom is het nuttig voor het bepalen van cellulaire oxidatieve stress op milieustress, het verstrekken van aanwijzingen voor mechanistische studies.
Introduction
Drie belangrijke reactieve zuurstofsoorten (ROS) die door cellulair metabolisme worden geproduceerd die van fysiologische betekenis zijn superoxideanion, hydroxylradical, en waterstofperoxide1. Bij lage concentraties nemen ze deel aan fysiologische celprocessen, maar bij hoge concentraties hebben ze nadelige effecten op celsignaleringstrajecten1. Ons lichaam heeft antioxidantsystemen ontwikkeld, die effectief zijn tegen overmatige ROS. Oxidatieve stress kan echter optreden wanneer ROS het ontgiftende vermogen van ons lichaam overweldigt, wat bijdraagt aan vele pathologische aandoeningen, waaronder ontsteking, kanker en neurodegeneratieve ziekte2,3,4. Het doel van deze methode is het bepalen van de totale cellulaire ROS in aanhangende cellen met behulp van 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (DCFH-DA) kleuring. De reden is dat oxidatie van DCFH-DA tot 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) op grote schaal is gebruikt voor totale ROS-detectie, waaronder hydroxylradicalen (•OH) en stikstofdioxide (•NR2). Mechanistisch, DCFH-DA wordt opgenomen door cellen waar cellulaire esterase kloven uit de acetyl groepen, wat resulteert in DCFH. Oxidatie van DCFH door ROS zet het molecuul om in DCF, dat groene fluorescentie uitzendt bij een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 530 nm. Vergeleken met detectie van fluorescentie met stroomcytometrie en andere alternatieve methoden5,voordelen van deze methode met behulp van een fluorescentie microscoop en een plaatlezer zijn dat het duidelijk zichtbare fluorescerende beelden produceert, en is gemakkelijk uit te voeren, efficiënt en kosteneffectief. Deze methode is op grote schaal gebruikt om cellulaire ROS te detecteren voor het bestuderen van verschillende aandoeningen6,7,8. Dit protocol wordt gebruikt voor het detecteren van de totale ROS in aanhangende cellen. Het gebruik van deze methode om ROS in suspensiecellen te detecteren, kan enkele wijzigingen nodig hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celzaaien
- Zaad 2 x 105 HCT116 colorectale kankercellen per put in een 24-put plaat en onderhouden de cellen in dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) 's nachts op 37 °C.
- Vervang het kweekmedium door of zonder 100 μM ferrosulfaat (FS) of 10 μM doxorubicine (DOX) met medium en incubaat gedurende 24 uur.
2. Voorbereiding van de DCFH-DA-oplossing
- Los 4,85 mg DCFH-DA op in 1 mL dimethylsulfoxide (DMSO) om een voorraadoplossing van 10 mM te maken.
- Verdun de voorraadoplossing met voorverwarmde DMEM tot 10 μM werkoplossing vlak voordat deze aan de putten wordt toegevoegd.
- Vortex de werkoplossing voor 10 s.
3. DCFH-DA-kleuring
- Verwijder het medicijn met medium en was één keer met DMEM.
- Voeg 500 μL van de DCFH-DA werkoplossing toe aan elke put en broed gedurende 30 minuten in op 37 °C.
- Verwijder de DCFH-DA werkoplossing. Was één keer met DMEM en 2x met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 500 μL 1x PBS toe aan elke put.
4. Imaging acquisitie en intensiteit meting
- Neem representatieve fluorescerende beelden voor elke put met behulp van de groene fluorescerende eiwit (GFP) kanaal op een fluorescentie microscoop.
- Na het maken van foto's verwijdert u PBS en voegt u 200 μL radioimmunoprecipitatie (RIPA) buffer toe aan elke put.
- Incubeer 5 min op ijs en verzamel vervolgens cellyslaat in buizen van 1,5 mL.
- Centrifuge bij 21.130 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Breng 100 μL van het supernatant over op een zwarte 96 putplaat en meet de fluorescentieintensiteit met behulp van een fluorescentie een microplatelezer bij een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 530 nm.
- Breng 1 μL van het supernatant over naar een duidelijke 96 putplaat met 100 μL 1x eiwittestoplossing om de eiwitconcentratie te meten met behulp van de Bradford-test9.
- Normaliseer fluorescentieintensiteiten met eiwitconcentraties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HCT116 colorectale kankercellen werden behandeld met 100 μM FS of 10 μM DOX om oxidatieve stress te veroorzaken7. Zoals blijkt uit figuur 1,werd de groene fluorescentie zoals verwacht drastisch verhoogd met zowel FS als DOX. Om de relatieve intensiteitsverandering te kwantificeren, werden de cellen na het nemen van beelden gelysed en genormaliseerd met eiwitconcentraties. De gekwantificeerde fluorescentieintensiteit werd aanzienlijk verhoogd door FS of DOX in HCT116 cellen.
Figuur 1: IJzerbehandeling verhoogt ROS in colorectale kankercellen. Representatieve fluorescerende beelden genomen door een fluorescentiemicroscoop en intensiteit kwantificering door een fluorescentiemicroplatelezer voor 2',7',dichlorodihydrofluorescein diacetaat (DCFH-DA) kleuring in HCT116 cellen na onbehandeld besturingselement (Ctrl), (A) 100 μM ferrosulfaat (FS) of (B) 10 μM doxorubicine (DOX) behandeling voor 24 h. Schaalbalk = 400 μm. * = p < 0,05; = p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het experimentele protocol dat hier wordt beschreven is gemakkelijk reproduceerbaar om cellulaire totale ROS te meten. De kritieke stappen omvatten het maken van DCFH-DA-oplossing fris en het vermijden van blootstelling aan licht, het minimaliseren van de cel status verstoring en uitgebreide PBS wassen vlak voor het nemen van beelden. Voor de bereiding van dcfh-DA werkoplossing moet de voorraadoplossing worden toegevoegd in voorverwarmde DMEM vlak voordat deze in de 24 putplaat wordt toegevoegd. De reden is dat oude oplossingen die hoge achtergrond fluorescentie of blootstelling aan licht te genereren zal leiden tot fotobleaching. De meeste studies gebruiken 1x PBS of 1x Hanks' balanced salt solution (HBSS) om DCFH-DA te verdunnen en te gebruiken als reactiebuffer10. Bij het gebruik van HCT116 en RKO genereerde de verdunning van de DCFH-DA-voorraadoplossing met PBS en foetale runderserumvrije DMEM echter een hoog achtergrondsignaal, zelfs in onbehandelde cellen. Dit kan te wijten zijn aan verstoring van de celstatus. Daarnaast moet de DCFH-DA werkoplossing langzaam langs de putwand worden toegevoegd. Verstoring van de celstatus zal leiden tot een hoog fluorescentiesignaal in vergelijking met het ongestoorde nabijgelegen gebied. Het is ook van cruciaal belang om ten minste twee keer te wassen met PBS voordat u foto's neemt om de automatische fluorescentie van het fenol met DMEM te verminderen. Fenol-vrije DMEM kan een betere keuze zijn, maar we laten hier zien dat PBS wassen voldoende was om auto-fluorescentie te minimaliseren. Zoals blijkt uit figuur 1, zelfs in onbehandelde controlegroepen twee verschillende partijen van experimenten kunnen resulteren in verschillende representatieve beelden. Om experimentele variaties te controleren, raden we aan cellen te behandelen met verdunde DCFH-DA-werkoplossing (zoals in het protocol) in plaats van voorraadoplossing direct aan de cellen toe te voegen. Ook moeten beelden worden genomen in velden met vergelijkbare celdichtheden en dezelfde belichtingstijd. Tot slot is het belangrijk om experimenten uit te voeren op alle vergelijkingsgroepen op hetzelfde moment.
Vanwege het belang van ROS is naast de totale ROS-detectie ook specifieke ROS-detectie ontwikkeld. Cellulaire productie van superoxide kan bijvoorbeeld worden gedetecteerd door dihydroethidium, wat bij oxidatie resulteert in hydroxylation in de 2-positie om 2-hydroxyethidium te vormen. Als 2-hydroxyethidium intercalates in cellulair DNA, rode fluorescentie met excitatie en emissie golflengten van 535 nm en 635 nm, respectievelijk, kan worden waargenomen. Mitochondriaal superoxide kan worden gevisualiseerd met het MitoSOX-reagens, een kationisch derivaat van dihydroethiodium dat levende cellen binnenkomt en zich specifiek richt op mitochondriën. Het oxidatieproduct van Mitosox dat rode fluorescentie genereert, kan intercaleren in mitochondriaal DNA. Chemoselectieve fluorescerende naphthylimide peroxide sonde werd ontwikkeld voor H2O2 detectie11. Bovendien, detectie van hydroxyl radicalen met behulp van fluorescentie spectrofotometrie werd ook gemeld12.
Samengevat, hier beschreven we een eenvoudig en geoptimaliseerd protocol voor het detecteren van cellulaire totale ROS met behulp van kosteneffectieve DCFH-DA kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (K01DK114390), een Research Scholar Grant van de American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), een Research Pilot Project Grant van de University of New Mexico Environmental Health Signature Program and Superfund (P42 ES025589), een Shared Resources Pilot Project Award en een Research Program Support Pilot Project Award van UNM uitgebreid kankercentrum (P30CA118100) , en een nieuwe onderzoeker award van de Dedicated Health Research Funds aan de Universiteit van New Mexico School of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
- Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
