Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות סה כ חמצן הסלולר מינים (ROS) באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA). שיטה זו יכולה להמחיש לוקליזציה של רוס הסלולר בתאי חסיד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית ועוצמה ROS מכמת עם קורא צלחת הקרינה. פרוטוקול זה הוא פשוט, יעיל וחסכוני.
Abstract
לחץ חמצוני הוא אירוע חשוב תחת התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים. במחקר זה, אנו מדגימים כיצד לכמת את המתח חמצוני על ידי מדידת מינים הכולל חמצן תגובתי (רוס) באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA) כתמים בתוך סרטן המעי הגס שורות התאים כדוגמה. פרוטוקול זה מתאר שלבים מפורטים כולל הכנה של פתרון DCFH-DA, דגירה של תאים עם פתרון DCFH-DA, ומדידה של עוצמה מנורמלת. DCFH-DA כתמים היא דרך פשוטה וחסכונית לזהות ROS בתאים. זה יכול לשמש כדי למדוד את הדור ROS לאחר טיפול כימי או שינויים גנטיים. לכן, הוא שימושי לקביעת לחץ חמצוני תאי על לחץ הסביבה, מתן רמזים למחקרים מכניסטיים.
Introduction
שלושה מינים החמצן תגובתי העיקריים (ROS) המיוצר על ידי חילוף החומרים הסלולריים כי הם של משמעות פיזיולוגית הם סופראוקסיד anion, רדיקלי הידרוקסיל, ותחמוצת מימן1. בריכוזים נמוכים, הם משתתפים בתהליכי תאים פיזיולוגיים, אבל בריכוזים גבוהים יש להם השפעות שליליות על תא איתות מסלולים1. הגוף שלנו פיתח מערכות נוגדי חמצון, אשר יעילים נגד ROS מוגזמת. עם זאת, לחץ חמצוני יכול להתרחש כאשר רוס להציף את היכולת הרעלים של הגוף שלנו, אשר תורמת לתנאים פתולוגיים רבים, כולל דלקת, סרטן, ומחלות ניווניות2,3,4. מטרת שיטה זו היא לקבוע הסלולר הכולל בתאי חסיד באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA) כתמים. הרציונל הוא כי חמצון של DCFH-DA כדי 2 ' -7 ' dichlorofluorescein (DCF) כבר נעשה שימוש נרחב לאיתור ROS סה כולל רדיקלים הידרוקסיל (• או) חנקן דו חמצני (• לא2). מכונאי, DCFH-DA הוא נלקח על ידי תאים שבהם הסלולר מוחק העלים מקבוצות מרחלקסיל, וכתוצאה מכך DCFH. חמצון של DCFH על ידי ROS ממיר את המולקולה DCF, אשר פולט ירוק פלואורסצנטית באורך הגל של 485 ננומטר ו-אורך הגל של 530 ננומטר. לעומת גילוי של ניאון עם הזרימה cy, ושיטות חלופיות אחרות5, היתרונות של שיטה זו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית וקורא צלחת הם שהוא מייצר בבירור תמונות פלורסנט לעין, והוא קל לבצע, יעיל וחסכוני. שיטה זו היתה בשימוש נרחב כדי לזהות ROS סלולריים לחקר מצבים שונים6,7,8. פרוטוקול זה משמש לזיהוי הכולל של ROS בתאי חסיד. שימוש בשיטה זו כדי לזהות ROS בתאים ההשעיה עשוי להזדקק לשינויים מסוימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. זריעת תאים
- זרע 2 x 105 HCT116 תאים סרטניים המעי הגס לכל טוב בצלחת 24-באר ולשמור על התאים בינונית שונה של הנשר של דולבקה (dmem) לילה ב 37 ° c.
- החלף את בינונית התרבות עם או בלי 100 μM ברזל גופרתי (FS) או 10 μM דוקסורוביצין (חמצון) המכיל בינונית ו-מודטה עבור 24 שעות.
2. הכנת התמיסה של DCFH-DA
- התמוססות 4.85 מ"ג של DCFH-DA ב 1 מ ל של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי לבצע פתרון במניה 10 מ"מ.
- לדלל את הפתרון במניה עם DMEM מחומם מראש לתוך 10 μM פתרון עובד ממש לפני הוספתו לבארות.
- מערבולת הפתרון עובד עבור 10 s.
3. DCFH-DA כתמים
- הסר את התרופה המכילה בינונית ושטוף פעם אחת עם DMEM.
- הוסף 500 μL של פתרון העבודה DCFH-DA לתוך כל טוב ומארג ב 37 ° צ' עבור 30 דקות.
- הסר את פתרון העבודה של DCFH-DA. שטוף פעם אחת עם DMEM ו-2x עם תמיסת מלח באגירה של 1x (PBS).
- הוסף 500 μL של 1x PBS לכל באר.
4. רכישת הדמיה ומדידת עוצמה
- קח את התמונות הפלורסנט הנציגה עבור כל טוב באמצעות חלבון פלורסנט ירוק (GFP) ערוץ על מיקרוסקופ זריחה.
- לאחר נטילת תמונות, הסירו את PBS והוסיפו 200 μL של מאגר radioimmunoprecipitation (ריפה) לכל באר.
- דגירה על קרח 5 דקות, לאחר מכן לאסוף תא ליפוסט לתוך 1.5 מ"ל צינורות.
- צנטריפוגה ב 21,130 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
- העברת 100 μL של supernatant כדי שחור 96 צלחת באר ולמדוד את עוצמת הזריחה באמצעות זריחה קורא מיקרופלייט באורך גל עירור של 485 nm ו-אורך הגל של הפליטה של 530 nm.
- העבר 1 μL של supernatant 96 ברור צלחת הבאר המכילה 100 μL של פתרון שיטת חלבון 1x כדי למדוד את ריכוז החלבון באמצעות שיטת ברדפורד9.
- הנרמל את עוצמות הקרינה הפלואורסצנטית עם ריכוזי חלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HCT116 תאים סרטניים המעי הגס טופלו עם 100 μM FS או 10 החמצון μM כדי לגרום לחץ חמצוני7. כפי שמוצג באיור 1, הזריחה הירוקה הוגדלה באופן דרמטי על-ידי סה כ והחמצון כצפוי. כדי לכמת את השינוי באינטנסיביות היחסית, התאים היו לאחר לקיחת תמונות מנורמל עם ריכוזי חלבון. עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית גדלה באופן משמעותי על ידי FS או חמצון בתאי HCT116.
איור 1: טיפול ברזל מגביר את רוס בתאים סרטניים המעי הגס. תמונות פלורסנט מייצגת שצולמו על ידי מיקרוסקופ ובאינטנסיביות בעוצמה של קורא מיקרופלייט פלואורסצנטי עבור 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA) מכתים בתאים HCT116 לאחר שליטה מטופלת (Ctrl), (a) 100 μm ברזל סולפט (FS) או (ב) 10 ΜM דוקסורוביצין (חמצון) טיפול 24 h. סרגל סרגל = 400 μm. * = p < 0.05; = p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הניסיוני המתואר כאן הוא בקלות לעבור למדוד הכולל של הסלולר ROS. השלבים הקריטיים כוללים הפיכת פתרון DCFH-DA טרי והימנעות מחשיפה לאור, מזעור הפרעה למצב התא וכביסה נרחבת של PBS לפני נטילת תמונות. להכנת פתרון עבודה DCFH-DA, פתרון המניה צריך להיות מתווסף D, מחומם מראש לפני הוספת לתוך 24 צלחת הבאר. הסיבה היא כי הפתרונות הישנים היוצרים ברקע גבוה זריחה או חשיפה אור יוביל הלבנה. רוב המחקרים להשתמש 1 x PBS או 1x הנקס מאוזנת פתרון מלח (HBSS) כדי לדלל DCFH-DA ולהשתמש בו כמו מאגר התגובה10. עם זאת, בעת שימוש HCT116 ו-RKO, דילול של פתרון מניות DCFH-DA עם PBS ו העוברי בסרום בחינם D, שנוצר האות ברקע גבוה גם בתא לא מטופל. ייתכן שהסיבה לכך היא הפרעה במצב התאים. בנוסף, את הפתרון העובד DCFH-DA יש להוסיף באיטיות לאורך הקיר היטב. הפרעה של מצב התא יפיק אות זריחה גבוהה לעומת האזור הסמוך ללא הפרעה. זה גם קריטי לשטוף לפחות פעמיים עם PBS לפני נטילת תמונות כדי להפחית את הקרינה הפלואורסצנטית אוטומטי של הפנול המכילים DMEM. DMEM דיה ללא פנול יכול להיות בחירה טובה יותר אבל אנחנו מראים כאן כי השטיפה PBS היה מספיק כדי למזער את הקרינה האוטומטית. כפי שמוצג באיור 1, גם בקבוצות שליטה לא מטופלות שתי אצוות שונות של ניסויים עלולים לגרום לתמונות מייצגות שונות. כדי לשלוט בווריאציות נסיוניות, אנו ממליצים לטפל בתאים עם פתרון עבודה DCFH-DA מדולל (כמו בפרוטוקול) במקום להוסיף פתרון מניות ישירות על התאים. כמו כן, יש לקחת תמונות בשדות עם צפיפויות תאים דומות וזמן חשיפה זהה. לבסוף, חשוב לבצע ניסויים בכל קבוצות ההשוואה בו.
בשל המשמעות של ROS, זיהוי מסוים של ROS, בנוסף לזיהוי הכולל של ROS, גם פותחה. לדוגמה, הייצור הסלולר של סופראוקסיד יכול להיות מזוהה על ידי דיהידרוטסטוסטרון, אשר על ידי חמצון תוצאות הידרוקסילציה על 2-מיקום לטופס 2-הידרובידיום. כמו 2-הידרובידיום משולבת ב-DNA הסלולר, זריחה אדומה עם עירור אורכי גל פליטה של 535 ננומטר ו 635 nm, בהתאמה, ניתן לצפות. סופראוקסיד מיטוכונדריאלי יכול להיות מדמיין עם המיגיב של מיטסוקס, נגזרת של דהידרואתידיום הנכנסת לתאים חיים ובמיוחד מטרות מיטוכונמיטואום. התוצר החימצון של Mitosox אשר מייצר פלואורסצנטית אדום יכול הintercalates ל-DNA מיטוכונדריאלי. בדיקה של תחמוצת הפלואורסצנטית שפותחה עבור H2O2 זיהוי11. בנוסף, זיהוי של רדיקלים הידרוקסיל באמצעות ספקטרופוטומטר פלואורסצנטית דווח גם12.
לסיכום, כאן תיארנו פרוטוקול פשוטה וממוטבת לזיהוי מוחלט של ROS הסלולר באמצעות כתמים העלות האפקטיבית DCFH-DA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות (K01DK114390), מלומד מחקר מענקים מתוך האגודה האמריקנית לסרטן (RSG-18-050-01-NEC), פיילוט מחקר הפרויקט גרנט מאוניברסיטת ניו מקסיקו בריאות הסביבה חתימה תוכנית הסופרקרן (P42 ES025589), משאבים משותפים פיילוט הפרויקט ותוכנית המחקר תמיכה פיילוט הפרוייקט של UNM מקיף סרטן המרכז (P30CA118100) , ואת פרס החוקר החדש מקרנות מחקר בריאות ייעודי באוניברסיטת ניו מקסיקו בית הספר לרפואה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
- Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
