Summary
Ici, nous présentons un protocole pour détecter l’espèce totale d’oxygène réactif cellulaire (ROS) à l’aide de 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA). Cette méthode permet de visualiser la localisation cellulaire de ROS dans les cellules adhérentes avec un microscope à fluorescence et de quantifier l’intensité de ROS avec un lecteur de plaque de fluorescence. Ce protocole est simple, efficace et rentable.
Abstract
Le stress oxydatif est un événement important dans des conditions physiologiques et pathologiques. Dans cette étude, nous démontrons comment quantifier le stress oxydatif en mesurant l’espèce réactive totale d’oxygène (ROS) en utilisant 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA) coloration dans les lignées cellulaires cancéreuses colorectales à titre d’exemple. Ce protocole décrit des étapes détaillées comprenant la préparation de la solution DCFH-DA, l’incubation des cellules avec la solution DCFH-DA, et la mesure de l’intensité normalisée. La coloration DCFH-DA est un moyen simple et rentable de détecter le ROS dans les cellules. Il peut être utilisé pour mesurer la génération de ROS après un traitement chimique ou des modifications génétiques. Par conséquent, il est utile pour déterminer le stress oxydatif cellulaire sur le stress de l’environnement, fournissant des indices pour les études mécanistes.
Introduction
Trois espèces réactives principales d’oxygène (ROS) produites par le métabolisme cellulaire qui sont de signification physiologique sont l’anion de superoxyde, le radical d’hydroxyle, et le peroxyde d’hydrogène1. À de faibles concentrations, ils participent à des processus cellulaires physiologiques, mais à des concentrations élevées, ils ont des effets néfastes sur les voies de signalisation cellulaire1. Notre corps a développé des systèmes antioxydants, qui sont efficaces contre le ROS excessif. Cependant, le stress oxydatif peut se produire lorsque ROS submerger la capacité détoxifiante de notre corps, ce qui contribue à de nombreuses conditions pathologiques, y compris l’inflammation, le cancer, et la maladie neurodégénérative2,3,4. Le but de cette méthode est de déterminer le ROS cellulaire total dans les cellules adhérentes à l’aide de la coloration 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA). La raison en est que l’oxydation du DCFH-DA à 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) a été largement utilisée pour la détection totale de ROS, y compris les radicaux hydroxyles (•OH) et le dioxyde d’azote (•NO2). Mécaniquement, DCFH-DA est repris par les cellules où l’estérase cellulaire se fend des groupes d’acétyl, ce qui entraîne le DCFH. L’oxydation du DCFH par ROS convertit la molécule en DCF, qui émet une fluorescence verte à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 530 nm. Par rapport à la détection de la fluorescence avec la cytométrie de flux et d’autres méthodes alternatives5, les avantages de cette méthode à l’aide d’un microscope à fluorescence et un lecteur de plaque sont qu’il produit des images fluorescentes clairement visibles, et est facile à exécuter, efficace et rentable. Cette méthode a été largement utilisée pour détecter ros cellulaire pour l’étude de diverses conditions6,7,8. Ce protocole est utilisé pour détecter le ROS total dans les cellules adhérentes. L’utilisation de cette méthode pour détecter le ROS dans les cellules de suspension peut avoir besoin de quelques modifications.
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Protocol
1. Ensemencement cellulaire
- Semences 2 x 105 cellules cancéreuses colorectales HCT116 par puits dans une plaque de 24 puits et maintenir les cellules dans le milieu aigle modifié (DMEM) modifié de Dulbecco pendant la nuit à 37 °C.
- Remplacer le milieu de culture par ou sans sulfate ferreux (FS) ou 10 μM de doxorubicine (DOX) contenant un milieu et un incuber pendant 24 h.
2. Préparation de la solution DCFH-DA
- Dissoudre 4,85 mg de DCFH-DA dans 1 mL de sulfoxyde de diméthyle (DMSO) pour faire une solution de stock de 10 mM.
- Diluer la solution de stock avec DMEM préchauffé en solution de travail de 10 μM juste avant de l’ajouter aux puits.
- Vortex la solution de travail pour 10 s.
3. DCFH-DA coloration
- Retirer le médicament contenant un milieu et laver une fois avec DMEM.
- Ajouter 500 μL de la solution de travail DCFH-DA dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 30 min.
- Supprimez la solution de travail DCFH-DA. Laver une fois avec DMEM et 2x avec 1x saline tamponnée de phosphate (PBS).
- Ajouter 500 μL de 1x PBS à chaque puits.
4. Acquisition d’imagerie et mesure de l’intensité
- Prenez des images fluorescentes représentatives pour chaque puits à l’aide du canal de protéine fluorescente verte (GFP) sur un microscope à fluorescence.
- Après avoir pris des images, retirez PBS et ajoutez 200 μL de tampon d’essai de radioimmunoprécipitation (RIPA) à chaque puits.
- Incuber sur la glace pendant 5 min, puis recueillir le lysate cellulaire dans des tubes de 1,5 mL.
- Centrifugeuse à 21 130 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Transférer 100 μL du supernatant sur une plaque de puits noire de 96 et mesurer l’intensité de fluorescence à l’aide d’une fluorescence un lecteur de microplaques à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 530 nm.
- Transférer 1 μL du supernatant sur une plaque claire de 96 puits contenant 100 μL de solution d’analyse protéique 1x pour mesurer la concentration de protéines à l’aide de l’essai de Bradford9.
- Normaliser les intensités de fluorescence avec des concentrations de protéines.
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Representative Results
Les cellules cancéreuses colorectales HCT116 ont été traitées avec 100 μM FS ou 10 μM DOX pour induire un stress oxydatif7. Comme le montre la figure 1, la fluorescence verte a été considérablement augmentée par FS et DOX comme prévu. Pour quantifier le changement relatif d’intensité, les cellules ont été lysées après prise d’images et normalisées avec des concentrations de protéines. L’intensité quantifiée de fluorescence a été significativement augmentée par FS ou DOX dans les cellules HCT116.
Figure 1 : Le traitement du fer augmente le ROS dans les cellules cancéreuses colorectales. Images fluorescentes représentatives prises par un microscope de fluorescence et quantification d’intensité par un lecteur de microplaques de fluorescence pour 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA) coloration dans les cellules HCT116 après non traité contrôle (Ctrl), (A) 100 μM de sulfate ferreux (FS) ou (B) 10 μM doxorubicine (DOX) traitement pour 24 h. Barre d’échelle = 400 μm. * = p < 0,05; P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole expérimental décrit ici est facilement reproductible pour mesurer le total cellulaire ROS. Les étapes critiques incluent la fabrication de la solution DCFH-DA fraîche et l’évitement de l’exposition à la lumière, la minimisation des perturbations de l’état cellulaire et le lavage complet de PBS juste avant de prendre des images. Pour la préparation de la solution de travail DCFH-DA, la solution de stock doit être ajoutée dans DMEM préchauffé juste avant d’ajouter dans la plaque de puits 24. La raison en est que les anciennes solutions qui génèrent une fluorescence de fond élevé ou une exposition à la lumière conduira à la photobleaching. La plupart des études utilisent 1x PBS ou 1x Hanks solution de sel équilibré (HBSS) pour diluer DCFH-DA et l’utiliser comme tampon de réaction10. Cependant, lors de l’utilisation de HCT116 et RKO, la dilution de la solution de stock DCFH-DA avec PBS et le sérum bovin foetal libre DMEM généré signal de fond élevé, même dans les cellules non traitées. Cela peut être dû à une perturbation de l’état cellulaire. En outre, la solution de travail DCFH-DA doit être ajoutée lentement le long du mur du puits. La perturbation de l’état cellulaire produira un signal de fluorescence élevé par rapport à la zone voisine non perturbée. Il est également essentiel de laver au moins deux fois avec PBS avant de prendre des images pour réduire l’autofluorescence du phénol contenant du DMEM. Phénol-free DMEM peut être un meilleur choix, mais nous montrons ici que le lavage PBS était suffisant pour minimiser l’auto-fluorescence. Comme le montre la figure 1, même dans les groupes témoins non traités, deux lots d’expériences différents pourraient donner lieu à des images représentatives différentes. Pour contrôler les variations expérimentales, nous recommandons de traiter les cellules avec une solution de travail diluée DCFH-DA (comme dans le protocole) au lieu d’ajouter une solution de stock directement sur les cellules. En outre, les images doivent être prises dans des champs avec des densités cellulaires similaires et le même temps d’exposition. Enfin, il est important d’effectuer des expériences sur tous les groupes de comparaison en même temps.
En raison de l’importance du ROS, une détection spécifique du ROS, en plus de la détection totale du ROS, a également été développée. Par exemple, la production cellulaire de superoxyde peut être détectée par dihydroethidium, qui, après oxydation, entraîne une hydroxylation à 2 positions pour former le 2-hydroxyethidium. Comme 2-hydroxyethidium intercale dans l’ADN cellulaire, la fluorescence rouge avec l’excitation et les longueurs d’onde d’émission de 535 nm et 635 nm, respectivement, peut être observée. Le superoxyde mitochondrial peut être visualisé avec le réactif MitoSOX, un dérivé cationique du dihydroethidium qui pénètre dans les cellules vivantes et cible spécifiquement les mitochondries. Le produit d’oxydation de Mitosox qui génère la fluorescence rouge peut intercaler dans l’ADN mitochondrial. La sonde de peroxyde fluorescente de naphthylimide chimiosélective a été développée pour la détection de H2O2 11. En outre, la détection des radicaux d’hydroxyle utilisant la spectrophotométrie de fluorescence a également été rapportée12.
En résumé, nous avons décrit ici un protocole simple et optimisé pour détecter le ros total cellulaire en utilisant la coloration rentable DCFH-DA.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par les National Institutes of Health (K01DK114390), une bourse de recherche de l’American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), un projet pilote de recherche Subvention du Programme de signature en santé environnementale de l’Université du Nouveau-Mexique et superfond (P42 ES025589), d’un prix de projet pilote de ressources partagées et d’un prix de soutien au projet pilote de programme de recherche du centre de cancérologie complet de l’UNM (P30CA118100) , et un nouveau prix d’investigateur du Fonds dédié à la recherche en santé à l’École de médecine de l’Université du Nouveau-Mexique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
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