Her presenterer vi en protokoll for å oppdage totale cellulære reaktive oksygenarter (ROS) ved hjelp av 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Denne metoden kan visualisere cellulær ROS lokalisering i tilhengerceller med et fluorescensmikroskop og kvantifisere ROS-intensitet med en fluorescensplateleser. Denne protokollen er enkel, effektiv og kostnadseffektiv.
Oksidativt stress er en viktig hendelse under både fysiologiske og patologiske forhold. I denne studien viser vi hvordan man kvantifisere oksidativt stress ved å måle totale reaktive oksygenarter (ROS) ved hjelp av 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) farging i kolorektal kreftcellelinjer som et eksempel. Denne protokollen beskriver detaljerte trinn, inkludert utarbeidelse av DCFH-DA-løsning, inkubasjon av celler med DCFH-DA-løsning og måling av normalisert intensitet. DCFH-DA farging er en enkel og kostnadseffektiv måte å oppdage ROS i celler. Den kan brukes til å måle ROS generasjon etter kjemisk behandling eller genetiske modifikasjoner. Derfor er det nyttig for å bestemme cellulær oksidativt stress på miljøstress, og gir ledetråder til mekanistiske studier.
Tre store reaktive oksygenarter (ROS) produsert av cellulær metabolisme som er av fysiologisk betydning er superoksidanion, hydroksylradikal og hydrogenperoksid1. Ved lave konsentrasjoner deltar de i fysiologiske celleprosesser, men ved høye konsentrasjoner har de bivirkninger på cellesignaler1. Kroppen vår har utviklet antioksidantsystemer, som er effektive mot overdreven ROS. Oksidativt stress kan imidlertid oppstå når ROS overvelder kroppens avgiftende evne, noe som bidrar til mange patologiske tilstander, inkludert betennelse, kreft og nevrodegenerativ sykdom2,3,4. Formålet med denne metoden er å bestemme total cellulær ROS i tilhengerceller ved hjelp av 2′,7′-diklordiohydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) farging. Begrunnelsen er at oksidasjon av DCFH-DA til 2′-7’diklorofluorescein (DCF) har blitt brukt mye for total ROS-deteksjon, inkludert hydroksylradikaler (•OH) og nitrogendioksid (•NO2). Mekanistisk, DCFH-DA er tatt opp av celler der cellulær esterase cleaves av acetyl grupper, noe som resulterer i DCFH. Oksidasjon av DCFH av ROS konverterer molekylet til DCF, som avgir grønn fluorescens ved en eksitasjon bølgelengde på 485 nm og en utslipp bølgelengde på 530 nm. Sammenlignet med påvisning av fluorescens med strømningscytometri og andre alternative metoder5, fordeler med denne metoden ved hjelp av et fluorescensmikroskop og en plateleser er at den produserer tydelig synlige fluorescerende bilder, og er enkle å utføre, effektive og kostnadseffektive. Denne metoden har blitt mye brukt til å oppdage cellulær ROS for å studere ulike forhold6,7,8. Denne protokollen brukes til å oppdage total ROS i tilhengerceller. Ved hjelp av denne metoden for å oppdage ROS i suspensjon celler kan trenge noen modifikasjoner.
Den eksperimentelle protokollen som er beskrevet her er lett reproduserbar for å måle cellulær total ROS. De kritiske trinnene inkluderer å gjøre DCFH-DA-løsningen frisk og unngå lyseksponering, minimere cellestatusforstyrrelser og omfattende PBS-vask rett før du tar bilder. For fremstilling av DCFH-DA arbeidsløsning, bør lagerløsningen legges til pre-oppvarmet DMEM rett før du legger inn i 24 brønnplaten. Årsaken er at gamle løsninger som genererer høy bakgrunnsfluorescens eller lyseksponering vil føre …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health (K01DK114390), en forskerstipend fra American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), et forskningspilotprosjekt Stipend fra University of New Mexico Environmental Health Signature Program og Superfund (P42 ES025589), en Shared Resources Pilot Project Award og en Research Program Support Pilot Project Award fra UNM omfattende kreftsenter (P30CA118100) , og en ny etterforsker pris fra dedikerte helseforskning midler ved University of New Mexico School of Medicine.
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |