Här presenterar vi ett protokoll för att upptäcka totala cellulära reaktiva syrearter (ROS) med 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Denna metod kan visualisera cellulära ROS lokalisering i vidhäftande celler med en fluorescens mikroskop och kvantifiera ROS intensitet med en fluorescens platta läsare. Detta protokoll är enkelt, effektivt och kostnadseffektivt.
Oxidativ stress är en viktig händelse under både fysiologiska och patologiska förhållanden. I denna studie visar vi hur man kvantifierar oxidativ stress genom att mäta totala reaktiva syrearter (ROS) med 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) färgning i kolorektal cancer cellinjer som ett exempel. Detta protokoll beskriver detaljerade steg inklusive beredning av DCFH-DA lösning, inkubation av celler med DCFH-DA lösning och mätning av normaliserad intensitet. DCFH-DA färgning är ett enkelt och kostnadseffektivt sätt att upptäcka ROS i celler. Det kan användas för att mäta ROS-generering efter kemisk behandling eller genetiska modifieringar. Därför är det användbart för att bestämma cellulär oxidativ stress på miljöstr stress, vilket ger ledtrådar till mekanistiska studier.
Tre stora reaktiva syrearter (ROS) som produceras av cellulär metabolism som är av fysiologisk betydelse är superoxid anjon, hydroxylradikal, och väteperoxid1. Vid låga koncentrationer deltar de i fysiologiska cellprocesser, men vid höga koncentrationer har de negativa effekter på cellsignaleringsvägarna1. Vår kropp har utvecklat antioxidant system, som är effektiva mot överdriven ROS. Emellertid, oxidativ stress kan uppstå när ROS överväldiga avgiftande förmåga vår kropp, vilket bidrar till många patologiska tillstånd, inklusive inflammation, cancer, och neurodegenerativa sjukdomar2,3,4. Syftet med denna metod är att bestämma totala cellulära ROS i vidhäftande celler med 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) färgning. Motiveringen är att oxidation av DCFH-DA till 2′-7’dichlorofluorescein (DCF) har använts i stor utsträckning för total ROS-detektion inklusive hydroxylradikaler (•OH) och kvävedioxid (•NO2). Mekanistiskt tas DCFH-DA upp av celler där cellesteras klyver av acetylgrupperna, vilket resulterar i DCFH. Oxidation av DCFH av ROS omvandlar molekylen till DCF, som avger grön fluorescens vid en excitationvåglängd på 485 nm och en utsläppsvåglängd på 530 nm. Jämfört med detektion av fluorescens med flödescytometri och andra alternativa metoder5är fördelarna med denna metod med hjälp av ett fluorescensmikroskop och en plattläsare att den producerar väl synliga fluorescerande bilder och är lätt att utföra, effektiva och kostnadseffektiva. Denna metod har använts i stor utsträckning för att upptäcka cellulära ROS för att studera olika villkor6,7,8. Detta protokoll används för att upptäcka total AVKASTNING i vidhäftande celler. Använda denna metod för att upptäcka ROS i suspensionsceller kan behöva vissa ändringar.
Det experimentella protokoll som beskrivs här är lätt reproducerbara att mäta cellulära totala ROS. De kritiska stegen är att göra DCFH-DA lösning fräsch och undvika ljusexponering, minimera cellstatusstörningar och omfattande PBS-tvättning precis innan du tar bilder. För beredning av DCFH-DA arbetslösning bör stamlösningen läggas till förvärmd DMEM precis innan den läggs till i 24-brunnsplattan. Anledningen är att gamla lösningar som genererar hög bakgrund fluorescens eller ljusexponering kommer at…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health (K01DK114390), ett forskningsstipendium från American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), ett pilotprojekt för forskning från American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), ett pilotprojekt för forskning Bidrag från University of New Mexico Environmental Health Signature Program och Superfund (P42 ES025589), en Shared Resources Pilot Project Award och ett forskningsprogram Support Pilot Project Award från UNM omfattande cancer center (P30CA118100) , och en ny utredare utmärkelse från de särskilda hälsoforskningsfonder vid University of New Mexico School of Medicine.
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |