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Immunology and Infection

Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm

Published: March 10, 2020 doi: 10.3791/60693
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,2, 1
1Department of Microbial Pathogenesis, Boyer Center for Molecular Medicine, Yale University School of Medicine, 2Microbial Sciences Institute, Yale University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

La imagen de células bacterianas es un enfoque de biología de sistemas emergentes centrado en la definición de procesos estáticos y dinámicos que dictan la función de grandes máquinas macromoleculares. Aquí, la integración de imágenes cuantitativas de células vivas y tomografía crioelectrónica se utiliza para estudiar la arquitectura y las funciones del sistema de secreción de legionela pneumophila tipo IV.

Abstract

El sistema de secreción de Punto/Cm de Legionella pneumophila es una nanomáquina compleja del sistema de secreción tipo IV (T4SS) que se localiza en el polo bacteriano y media la entrega de proteínas y sustratos de ADN a las células diana, un proceso que generalmente requiere contacto directo de célula a célula. Recientemente hemos resuelto la estructura del aparato Dot/Icm mediante tomografía crioelectrónica (crio-ET) y hemos demostrado que forma un canal de expansión celular que se conecta a un complejo citoplasmático. La aplicación de dos enfoques complementarios que preservan la estructura nativa de la muestra, la microscopía fluorescente en células vivas y crio-ET, permite la visualización in situ de proteínas y la asimilación de la estequiometría y el momento de producción de cada componente de la máquina en relación con otras subunidades Dot/Icm. Para investigar los requisitos para el posicionamiento polar y caracterizar las características dinámicas asociadas con la biogénesis de la máquina T4SS, hemos fusionado un gen que codifica la proteína fluorescente verde de la supercarpeta a los genes DOT/Icm ATPase en sus posiciones nativas en el cromosoma. El siguiente método integra la microscopía cuantitativa de fluorescencia de células vivas y crio-ET para cuantificar la localización polar, la dinámica y la estructura de estas proteínas en células bacterianas intactas. La aplicación de estos enfoques para el estudio de la Legionella pneumophila T4SS es útil para caracterizar la función del sistema Punto/Icm y se puede adaptar para estudiar una amplia variedad de patógenos bacterianos que utilizan el T4SS u otros tipos de complejos de secreción bacteriana.

Introduction

Legionella pneumophila (L. pneumophila), el agente etiológico de la enfermedad de los legionarios, habita en los reservorios de agua dulce, donde las bacterias se propagan infectando y replicando dentro de los protozoos acuáticos de natación libre. L. pneumophila causa brotes de enfermedades en los seres humanos cuando se produce la inhalación de bacterias aerosolizadas de fuentes de agua potable. En las células infectadas, la subversión de las vías huésped permite a L. pneumophila retrasar la maduración endocítica de la vacuola en la que reside y promover la biogénesis de un compartimento celular que apoya la replicación bacteriana. Este proceso es impulsado por un sistema especializado de secreción IVB de tipo bacteriano (T4BSS) conocido como Dot/Icm y su repertorio de más de 300 proteínas "efectoras" que se trasladan al citosol huésped durante la infección para facilitar la manipulación de las funciones celulares1,2,3,4,5. Los mutantes que carecen de un aparato funcional Dedo/Cm no entregan efectores en el citosol del huésped, son defectuosos para la replicación intracelular y son avirulentes en modelos animales de enfermedad6,7.

Muchas especies bacterianas han desarrollado máquinas multicomponente extremadamente complejas y dinámicas que son necesarias para los procesos de infección. Otros T4BSS como el sistema Dot/Icm también son esenciales para la replicación intracelular de patógenos bacterianos como Coxiella burnetii y Rickettsiella grylli. Aunque el T4BSS está relacionado evolutivamente con los sistemas prototípicos de tipo IVA, que median la transferencia de ADN y pueden ofrecer un repertorio limitado de proteínas de efectores, el sistema Dot/Icm tiene casi el doble de componentes de la máquina y ofrece una amplia variedad de efectores. Presumiblemente, esta expansión en el número de componentes ha permitido que el aparato Dot/Icm acomode e integre nuevos efectores fácilmente8,9.

Recientemente usamos la tomografía crioelectrónica (crio-ET) para resolver la estructura del aparato Dot/Icm in situ y mostramos que forma un canal de expansión celular que se conecta a un complejo citoplasmático. Análisis posterior reveló que el citosólico ATPase DotB se asocia con el sistema Dot/Icm en el polo celular L. pneumophila a través de interacciones con el citosólico ATPase DotO. Hemos descubierto que DotB muestra un movimiento citosólico en la mayoría de las células bacterianas, lo que indica que este ATPase está presente en una población citosólica dinámica, pero también se asocia con los complejos de puntos polares/icm. Además, DotO forma un conjunto hexamerico de dimers DotO asociados con el complejo de membrana interna, y un hexamer DotB se une a la base de este complejo citoplasmático. El conjunto de la energía DotB-DotO crea un canal citoplasmático que dirige la translocación de sustratos a través del T4SS(Figura 1)10.

A pesar de estos avances recientes, poco se sabe sobre cómo funciona el sistema Dot/Icm y cómo cada proteína se ensambla para formar un aparato activo8. Descubrir los circuitos reguladores del Dot/Icm T4SS es fundamental para entender los mecanismos moleculares de las interacciones huésped-patógeno. Por lo tanto, analizamos cómo utilizar la microscopía de células vivas y crio-ET para detectar y caracterizar los componentes esenciales del sistema L. pneumophila Dot/Icm que están etiquetados con la supercarpeta GFP (sfGFP). Mediante la microscopía cuantitativa de fluorescencia, la localización polar de DotB se definirá en un fondo de tipo salvaje o cuando se elimine el sistema de tipo IV. La microscopía de lapso de tiempo se utilizará para cuantificar las diferencias en la localización y la dinámica entre las ATPases citosólicas Dot/Icm.

La aplicación combinada de dos enfoques complementarios como la imagen en vivo y el crio-ET proporciona una ventaja en comparación con otros sistemas in vitro. Ambos métodos se realizan en celdas intactas y preservan el entorno natural del T4BSS, minimizando así la interrupción de la estructura nativa durante la preparación de la muestra. Debido a que la sobreexpresión de proteínas puede afectar a la estequiometría del aparato de secreción, las fusiones sfGFP se devuelven a través del intercambio alélico al cromosoma Legionella para que cada fusión esté codificada en una sola copia y la expresión sea impulsada por el promotor endógeno. La visualización de fusiones codificadas cromosómicamente permite cuantificar el nivel exacto de proteína expresada en un momento dado definido. Cryo-ET también tiene muchas ventajas para determinar la estructura de los sistemas de secreción. La ventaja más notable es que las muestras crio-ET se componen de células intactas congeladas que preservan complejos nativos en el contexto de la arquitectura celular bacteriana. En consecuencia, el crio-ET puede ser preferible a los enfoques de purificación bioquímica, que extraen complejos de membrana y pueden extraer proteínas periféricas del aparato central o modificar la estructura general. Además, el etiquetado de una proteína de interés con una proteína voluminosa como el sfGFP añade una masa que es detectable por crio-ET y puede ayudar a mapear los diferentes subcomplejos del aparato Punto/Cm en la estructura obtenida por crio-ET.

Este enfoque es una poderosa herramienta para descubrir información estructural sobre complejos multimoleculares que se ensamblan en la membrana celular bacteriana. La interpretación de las estructuras dilucidadas utilizando estas técnicas ayudará al campo a entender cómo funcionan los componentes t4BSS, por qué se requieren tantos componentes para la función, cómo interactúan los componentes dentro del complejo más grande y qué funciones estos subensamblajes de ejecución.

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Protocol

NOTA: Todos los procedimientos relacionados con el crecimiento, manipulación e imágenes de L. pneumophila deben realizarse en un laboratorio de nivel de seguridad biológica 2 de conformidad con las directrices locales.

1. Inserción de sfGFP en el cromosoma L. pneumophila utilizando el intercambio alélico y la estrategia de doble selección(Figura 2, Figura 3)

  1. Clonar en el vector de reemplazo genético pSR47S11 la siguiente secuencia: la 1.000 bp aguas arriba del sitio de interés, luego la secuencia sfGFP, luego la 1.000 bp aguas abajo del sitio de interés(Figura 2). La secuencia sfGFP debe colocarse en el marco de los extremos De N-terminus o C-terminus con un vinculador que contenga de cuatro a ocho aminoácidos. Transforme el vector resultante en E. coli DH5-pir. Más tarde, la raya L. pneumophila (el receptor) para colonias individuales en el agar extracto de carbón-levadura (CYE)12 que contiene 100 g/ml de estreptomicina y crecer durante 5 días a 37 oC(Figura 3).
  2. Racha L. pneumophila en CYE-agar-estreptomicina y crecer durante 2 días a 37 oC (parche pesado)10. La racha E. coli DH5, transformada con plásmido auxiliar pRK600 (ayudante)13 en el agar LB que contiene 25 g/ml de cloramphenicol. Raya el E. coli DH5-pir (donante) en el agar LB que contiene 50 g/ml de kanamicina.
  3. Realizar apareamiento triparental: incubar una colonia del ayudante, una colonia del donante y el receptor superponiendo parches de las tres cepas en una placa de agar CYE sin selección e incubando durante 4-8 h a 37oC. A medida que los controles negativos incuban una mezcla de cepa auxiliar+receptor y una mezcla de cepa donante+receptor durante los mismos períodos de tiempo.
  4. Resuspenda las reacciones de apareamiento en 500 sL de ddH2O. Placa 20 l y 50 l de las reacciones en el agar CYE que contenga 100 g/ml de estreptomicina y 10 g/ml de kanamicina y crezca durante 5 días a 37 oC. Raya cuatro de los clones resultantes en el agar CYE que contiene 100 g/ml de estreptomicina y crece durante 5 días a 37 oC.
  5. Racha 16 clones en agar CYE que contiene 5% de sacarosa y 100 g/ml de estreptomicina y crece durante 5 días a 37 oC. Luego, la raya 32 de estos clones en el agar CYE que contiene 100 g/ml de estreptomicina y en el agar CYE que contiene 100 g/ml de estreptomicina y 10 g/ml de kanamicina y crece durante 5 días a 37 oC.

2. Aislamiento de clones que integraron sfGFP en el cromosoma L. pneumophila

  1. Clones de rayas que eran sensibles a la kanamicina en placas CYE-agar-estreptomicina y confirman la inserción de sfGFP en el cromosoma con PCR de colonia. Utilice imprimadores complementarios al gen sfGFP y a la región cromosómica de interés para amplificar la unión de inserción.
    1. Mezclar 0,5 ml de cada una de las soluciones de imprimación de 10 m y una colonia a un volumen final de 12,5 ml y desnaturalizar durante 10 min a 95 oC. Enfríe en hielo durante 10 min, agregue 12,5 l de solución de mezcla maestra de PCR 2 x y realice un análisis de PCR.
  2. Cultivar manchas pesadas de las colonias aisladas en placas CYE-agar-estreptomicina durante 2 días a 37 oC. Examine los niveles de expresión y la estabilidad de las fusiones sfGFP inmunoblotando con un anticuerpo anti-GFP.

3. Imagen de celda viva de L. pneumophila con componentes de punto/icm etiquetados fluorescentemente

  1. Preparación de almohadillas de agarosa
    1. Hacer unos 30 ml de una solución de agarosa 1% baja en agua. Microondas en un matraz de vidrio durante unos 90 s, girando ocasionalmente, hasta que la agarosa se disuelva por completo.
    2. Coloque dos portaobjetos de vidrio de 22 x 22 x 0,15 mm3 en el borde de un portaobjetos de vidrio de 25 x 75 x 1,1 mm3, uno encima del otro. Apilar dos diapositivas de vidrio más de 22 x 22 x 0,15 mm3 en el otro borde.
    3. Pipetear aproximadamente 1 ml de la agarosa fundida en el tobogán central entre los dos portaobjetos de vidrio superior, luego coloque otro tobogán de 25 x 75 x 1,1 mm3 en la parte superior de la agarosa fundida. Trate de evitar la formación de burbujas de aire. Enfríe los portaobjetos a 4 oC durante 15 min.
    4. Usando un bisturí o una cuchilla de afeitar, corte suavemente la almohadilla en cuadrados pequeños, 5 x 5 mm2. Fije un adhesivo de doble cara 17 x 28 x 0.25 mm3 marco en un portacristales de 25 x 75 x 1.1 mm3 y coloque varias almohadillas en la diapositiva.
  2. Adquisición de imágenes
    NOTA: Los siguientes pasos se describen para un microscopio que está bajo el control de SlideBook 6.0 y está equipado con iluminadores de estado sólido, cámara monocromática CCD y una lente objetivo de 100x (1.4 apertura numérica). Si es necesario, utilice dispositivos de microscopía alternativos con configuraciones de hardware y software adecuadas que se pueden personalizar de acuerdo con la configuración del protocolo.
    1. Disolver un parche pesado de L. pneumophila en 1 ml de ddH2O, vórtice e pipeteo 2–3 l de la dilución en las almohadillas. Coloque un cubreobjetos de 50 x 24 x 0,15 mm3 suavemente sobre el marco adhesivo.
    2. En la ventana de captura ajuste el ND a 180. Ajustar el binning a 2 x 2 y utilizar el canal de 488 nm para exponer la muestra entre 500–1.000 ms. Validar la especificidad de la señal de fluorescencia mediante imágenes sin etiquetar L. pneumophila con los mismos parámetros (Figura 4).

4. Cuantificación de la Localización Polar y Dinámica de Componentes De Punto/Icm

NOTA: Los siguientes pasos están diseñados para imágenes con 0,129 m por píxel que se adquirieron con 2 x 2 binning.

  1. Cuantificación de la polaridad para proteínas de fusión sfGFP (Figura 5)
    1. Ajuste el contraste de la imagen para que las bacterias sean claramente visibles. Utilice la herramienta de región para colocar un rectángulo de 0,25 x 1,3m2 comenzando en el polo y extendiéndose hasta el citoplasma. El rectángulo debe permanecer precisamente dentro de los bordes bacterianos.
    2. Marca al menos 200 bacterias y usa el botón Región para enmascarar para crear máscaras para las regiones de interés. En Estadísticas de máscara y Alcance de máscara, elija Objeto. A continuación, en Características e intensidad, marque Intensidad media y varianza.
    3. Exporte los datos y calcule las puntuaciones de polaridad de cada bacteria como la relación entre la varianza y la intensidad media.
    4. Para aplicaciones de alto rendimiento, utilice un objetivo de fase y una configuración de condensador adecuada para adquirir imágenes con los canales de fase y 488 nm. Asegúrese de elegir los campos de visión donde las bacterias están completamente separadas.
    5. Ajuste el contraste del canal de fase de la imagen a un nivel donde las bacterias sean claramente visibles. Abra la imagen de canal dual, inicie la ventana Crear máscara de segmento y cambie el canal a fase.
    6. Ajuste un umbral adecuado y elimine objetos pequeños con el botón Definir objetos. En Refine Mask,elija Remove Edges Objects y, posteriormente, máscaras separadas de bacterias adyacentes entre sí.
    7. Calcule las puntuaciones de polaridad de la señal en el canal 488 para cada celda como se describió anteriormente en los pasos 4.1.2–4.1.3.
  2. Cuantificación de la dinámica de las proteínas de fusión sfGFP (Figura 6)
    NOTA: Siga las instrucciones de la sección 3 para preparar una muestra para la adquisición de imágenes. La dinámica se define como cambios en la intensidad a lo largo del tiempo y los pasos siguientes están diseñados para períodos de imágenes cortos (es decir, varios minutos). Agregue a la almohadilla los suplementos apropiados si se desean períodos de diagnóstico por imágenes más largos.
    1. En la ventana Captura de imagen, marque Timelapse, escriba el tiempo de intervalos en el cuadro intervalo e introduzca 2 en el cuadro Puntos de tiempo. Adquirir dos imágenes sucesivas de L. pneumophila expresando la proteína fluorescente de interés.
    2. Ajuste el contraste de la imagen hasta que las celdas sean claramente visibles. Siga la Figura 6A y las descripciones a continuación para colocar tres máscaras diferentes. Utilice la herramienta de región para colocar un cuadrado de 0,25 x 0,25 m en el centro de al menos 400 celdas.
    3. Utilice el botón Región para enmascarar para crear una máscara (máscara 1) de los cuadrados de interés. Cree una nueva máscara vacía (máscara 2) y utilice la herramienta píxel o la herramienta poligonal para marcar toda el área de celda de al menos 25 celdas aleatorias, que se utilizarán para calcular el blanqueo de fluorescencia. Cree una nueva máscara vacía (máscara 3) y utilice la herramienta de pincel grande para marcar áreas entre las celdas, que se utilizarán para la resta de fondo.
    4. En Estadísticas de máscara y Alcance de máscara, elija Objeto para máscara 1 y máscara 2. A continuación, en Características e intensidad, elija Intensidad media y exporte los datos de las dos máscaras. Para la máscara 3, exporte la intensidad media de toda la máscara.
    5. Calcule el cambio en la intensidad de la fluorescencia para cada objeto en la máscara 1 utilizando las siguientes fórmulas:

Equation 1

Equation 2

donde la máscara 1 es un cuadrado de 0,25 m a 0,25 m colocado en el centro de la célula, la máscara 2 cubre toda la celda, la máscara 3 es el fondo entre las células, t1 es la intensidad media en el primer punto de tiempo, y t2 es la intensidad media en el segundo punto de tiempo.

5. Detección de densidad de masa sfGFP con Cryo-ET

  1. Preparación de muestras, recopilación de datos y reconstrucción
    1. Cultivar un parche pesado de L. pneumophila expresando una proteína Dot/Icm etiquetada fluorescentemente en placas CYE-agar-streptomicina durante 48 horas a 37 oC. Resuspenda las celdas en ddH2O a OD600 a 0,7. Añadir 5 l de partículas de oro coloidal (BSA Tracer, 10 nm) a 20 l de la suspensión celular.
    2. Pipetear 5 l de la mezcla de células en una rejilla de carbono perforada recién descargada por el brillo (R 2/1 en malla Cu 200) y dejar reposar durante 1 min. Blot con papel de filtro y congelar en etantano líquido utilizando un aparato de émbolo impulsado por gravedad como se describió anteriormente14,15.
    3. Imagen de las muestras hidratadas congeladas con un microscopio electrónico de transmisión de 300 kV equipado con una pistola de emisión de campo, un filtro de energía, una placa de fase Volta y un dispositivo de detección directa. Recoge series de inclinación de un solo eje con aumentos de 26.000x y 42.000x, que dan como resultado tamaños de píxeles a un nivel de muestra de 5,4 o píxeles o 3,4 o píxeles, respectivamente.
    4. Utilice el paquete tomográfico SerialEM para recoger pilas de imágenes a un desenfoque de 0 m, con una gama de ángulos de inclinación entre -60o y +60o con incremento de paso de 3o y dosis acumulada de 60e -/a2,16. Alinee las imágenes de película fraccionadas por dosis en cada pila utilizando MotionCor217. Ensamble pilas corregidas a la deriva utilizando TOMOAUTO14.
    5. Alinee las pilas corregidas por deriva mediante la alineación dependiente del marcador IMOD18. Reconstruir mamografías con el método SIRT19 para segmentaciones y análisis directo de imágenes y el método WBP20.
  2. Análisis de subtomogramas de muestras de fusiones sfGFP
    1. Utilice el paquete tomográfico I3 (0.9.9.3) para el análisis de subtomogramas14,21,22.
      NOTA: La alineación continúa de forma iterativa, con cada iteración que consta de tres partes en las que se generan referencias y máscaras de clasificación, los subtomogramas se alinean y clasifican, y los promedios de clase se alinean entre sí.
    2. Utilice 4 x 4 x 4 subtomogramas binned para una alineación inicial. Combinar partículas que pertenecen a promedios de clase y mostrar la densidad de electrones correspondiente a sfGFP. Después de clasificar partículas con fusiones sfGFP, utilice subtogramas de 2 x 2 x 2 binned para una alineación enfocada de una región de interés (como el complejo ATPase citoplasma Dedo/Icm) para obtener una estructura de alta resolución.

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Representative Results

La recombinación homóloga con doble selección en dos pasos se utilizó para construir la inserción definida de sfGFP. En el primer paso, se realizó el acoplamiento triparental, donde el plásmido conjugado pRK600 (un plásmido IncP) de la cepa auxiliar E. coli MT616 se movilizó a la cepa del donante E. coli con el vector suicida pSR47S que contiene el flanco sfGFP geneado por las dos regiones homólogas, el origen de la orita de transferencia y el gen de la subselección Bacillus subistitulación. A continuación, el sistema de conjugación de pRK600 asistió la movilización del derivado pSR47S en L. pneumophila (Lp01, Figura 2A). Los clones que integraron con éxito pSR47S mediante un único evento cruzado fueron seleccionados debido al gen de resistencia a los antibióticos KanR y se propagaron para permitir un segundo cruce. Los clones que perdieron el gen sacuñador durante el segundo cruce se seleccionaron enchapando las células de la sacarosa del agente contraselectivo(Figura 2, Figura 3). Se realizó un análisis de inmunoblot con un anticuerpo anti-GFP (-GFP) para determinar si el sfGFP se cleaved y para evaluar la estabilidad y el nivel de expresión de la proteína de fusión en un tipo silvestre o en un mutante completo de eliminación de puntos/icm. Además, antes de proceder a la microscopía, la integración correcta del gen sfGFP en el cromosoma fue confirmada por PCR(Figura 3). Una vez confirmada la estabilidad y la integración de las fusiones, se realizó la microscopía fluorescente de células vivas, y se comparó la especificidad del clon de señal fluorescente con una cepa negativa de sfGFP parental. Además, se utilizó la creación de imágenes duales mediante microscopía de campo brillante o fase para examinar la proporción de células que poseían una señal fluorescente específica(Figura 4).

Sólo una fracción de las células que produjeron DotB-sfGFP mostraba la localización polar de la proteína de fusión(Figura 5A). Para caracterizar la distribución de la señal de fluorescencia DotB, se cuantificó la intensidad de DotB-sfGFP a lo largo del eje longitudinal en esas células. La intensidad del DotB en los polos fue aproximadamente 2 veces mayor que en el citosol(Figura 5B). Debido a que es importante determinar si la localización de proteínas de fusión etiquetadas fluorescentemente tiene relevancia biológica, preguntamos si la localización polar DotB-sfGFP dependía de un T4BSS completamente ensamblado. Por lo tanto, se determinaron puntuaciones de polaridad de DotB-sfGFP que indican la relación de fluorescencia media medida en los polos en comparación con la fluorescencia medida cerca de la mitad de la célula para células individuales en un tipo salvaje y en un mutante T4BSS(Figura 5C–E). De hecho, las eliminaciones de todo el sistema Punto/Icm abrogaron el posicionamiento polar de DotB-sfGFP, confirmando que el puncta polar representa la asociación de DotB con el T4SS y la importancia de la máquina Dot/Icm para el reclutamiento de este ATPase. En la mayoría de las células de L. pneumophila, DotB-sfGFP también mostró movimiento citosólico, lo que indica que está presente en una población citosólica dinámica, pero también es capaz de asociarse con el complejo polar Dot/Icm. Para cuantificar las diferencias en el movimiento dinámico entre los DOTO y los DOTB ATPases, se adquirieron dos imágenes sucesivas y se determinaron cambios en la intensidad de la fluorescencia que se compararon con sfGFP(Figura 6A). Mientras que sfGFP y DotO-sfGFP mostraron patrones poco o ningún dinámico, los cambios de intensidad de DotB-sfGFP en el citosol se cambiaron y fueron significativamente más altos. Estas observaciones indican que el DotB ATPase estaba presente en una población citosólica dinámica y en una reacción de ensamblaje en etapa tardía, el DotB ATPase espacialmente dinámico fue reclutado para el Dot/Icm T4SS localizado polarmente(Figura 6B).

Para definir la ubicación espacial de DotB en relación con la máquina Punto/Icm, se utilizó crio-ET de alto rendimiento para visualizar el aparato T4BSS intacto en una cepa L. pneumophila que expresa DotB-sfGFP. En primer lugar, se realizó la reconstrucción de una célula de L. pneumophila que expresa DotB-sfGFP y reveló complejos típicos en forma de cono incrustados en el sobre de la célula(Figura 7A, B). Anteriormente demostramos el uso de experimentos epistáticos con una variedad de mutantes de puntos/cm, microscopía fluorescente y crio-ET que DotB se encuentra espacialmente debajo de un conjunto único de la ATPase DotO10. El promedio de subtomograma de la cepa que expresa DotB-sfGFP determinó el posicionamiento general de DotB en relación con la máquina T4BSS intacta. Este análisis reveló una densidad adicional que se correlaciona con la masa adicional de sfGFP(Figura 7C). Por último, las representaciones de superficie tridimensionales de todo el Dot/Icm T4SS indican que sfGFP se coloca debajo del hexamer DotB, que se ensambla como un disco en la base del complejo citoplasma ATPase(Figura 8)10.

Figure 1
Figura 1: Representaciones de superficie tridimensional de L. pneumophila Dot/Icm T4SS. OM - membrana externa, IM - membrana interna, PG - peptidoglycan. La imagen fue modificada de Chetrit D. et al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Visión general esquemática de la recombinación homóloga y el intercambio alélico utilizado para insertar sfGFP en el cromosoma L. pneumophila. (A) El apareamiento triparental realizado entre una cepa auxiliar de E. coli MT616 que alberga el plásmido conjugado pRK600 (un plásmido IncP), una cepa de donante E. coli que se transforma con el vector suicida pSR47S, y L. pneumophila como receptor. (B) Modelo esquemático que representa los pasos necesarios para insertar sfGFP en el cromosoma L. pneumophila con el fin de generar proteínas de fusión SfGFP c-terminal. La selección de mutantes de intercambio alélico se realizó en dos pasos, usando kanamicina y el marcador contador seleccionable sacB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: El flujo de trabajo de ensayo de intercambio alélico. L. pneumophila se extendió en las selecciones y los tiempos de crecimiento apropiados (ver la sección de protocolo para más detalles). Más tarde, se confirmó la inserción de sfGFP en el cromosoma con PCR de colonia utilizando imprimaciones complementarias al gen sfGFP y a la región cromosómica que flanquea el sitio de inserción. La estabilidad de la proteína de fusión se examinó mediante análisis de inmunoblot utilizando un anticuerpo anti-GFP. Paneles inferiores izquierdos: Carril 1 - Lp01sin etiquetar , Carril2 - sfGFP expresado a partir de dotB operon, Carril 3 - DotB-sfGFP expresado en un mutante completo de eliminación de puntos/icm, Carril 4 - DotB-sfGFP expresado en un fondo de tipo salvaje. WB - mancha occidental. El número de clones analizados en cada paso se indica entre paréntesis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagen de células vivas de L. pneumophila expresando subunidades Dot/Icm etiquetadas fluorescentmente. (A) L. pneumophila de un parche pesado de dos días fue resuspendido en ddH2O y colocado en la parte superior de almohadillas de agarosa de fusión baja 1%. (B) La especificidad de la señal de fluorescencia de una cepa que codifica cromosómicamente DotB-sfGFP se comparó con la cepa Lp01 negativa gFP parental. Barra de escala a 3 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Cuantificación de la localización polar de las subunidades del sistema Dot/Icm. (A) La visualización en tiempo real de DotB-sfGFP expresada en Lp01 mostró localización polar. DotB-sfGFP mostraba un patrón difuso cuando se expresaba en una cepa en la que se suprimieron todo el clúster de genes punto/icm (T4SS). El sfGFP sin fusionar expresado desde el operón dotB mostró un patrón citosólico difuso y sirvió como control. Barra de escala a 3 m. (B) Cuantificación de la intensidad de fluorescencia DotB-sfGFP a lo largo del eje longitudinal de las células con patrones polares o difusos. Los tamaños de las muestras eran de n a 20 células para células polares y no polares. *p a 0,02, **p a 0,0001. La importancia se calculó mediante la prueba t del estudiante de dos colas y se comparó con la intensidad en el polo. (C) Modelo esquemático de las máscaras utilizadas para cuantificar la polaridad. (D) DotB-sfGFP como se muestra en la Figura 5A con las máscaras utilizadas para cuantificar la polaridad. (E) La abundancia de DotB-sfGFP en los polos, cuando se expresa en un fondo de tipo salvaje o cuando se eliminó todo el clúster de genes punto/icm, se muestra como curvas de frecuencia. Los tamaños de las muestras fueron de n a 200 células para cada cepa. * p < 0.0001. La importancia se calculó mediante la prueba Mann Whitney de dos colas y se comparó con sfGFP expresada a partir del dotB operon. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Cuantificación de la dinámica de fusiones fluorescentes Punto/Cm. (A) Un modelo esquemático que representa las máscaras utilizadas para cuantificar los cambios en la intensidad de la fluorescencia para una proteína de fusión sfGFP dinámica o estática. T1,2 son el tiempo del primer y segundo punto de tiempo y m1,2,3 son máscara 1, máscara 2, y máscara 3. (B) La dinámica de DotB-sfGFP, DotO-sfGFP y sfGFP expresada desde el operon dotB se muestra niforizado como curvas de frecuencia. Los tamaños de las muestras fueron de n a 400 células para cada cepa. *p a 3,4 a 10-12, ***p a 1,0 a 10-147. La importancia se calculó mediante la prueba t de estudiante de dos colas en comparación con sfGFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: El promedio de subtomogramas se utiliza para determinar la densidad sfGFP de DotB-sfGFP. (A) Una rebanada tomográfica adquirida con aumento de 26.000x de una célula representativa de L. pneumophila que expresa DotB-sfGFP, mostrando múltiples máquinas Dot/Icm incrustadas en el sobre de la celda. (B) Una rebanada tomográfica adquirida con un aumento de 42.000x del mismo polo celular L. pneumophila mostrado en A. OM - membrana externa, IM - membrana interna. (C) Una reconstrucción de una cepa que expresa DotB-sfGFP muestra las densidades correspondientes a DotB y sfGFP (flechas amarillas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Representaciones de superficie tridimensionales del complejo citosólico Punto/Icm. Representaciones de superficie tridimensionales de toda la Cepas Dot-Icm T4SS des.a), tipo salvaje (B) y dotB-gfp (C) L. pneumophila. (D) La estructura del complejo citosólico muestra el posicionamiento de DotB (púrpura) y sfGFP (verde). La estructura de rayos X de DotB (PDB: 6GEB23)se acoplaba al mapa DotB. IM - membrana interna. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Elaclarar las funciones de los sistemas de secreción bacteriana es clave para una comprensión completa de las interacciones huésped-patógeno. Los sistemas de secreción son máquinas complejas que pueden inyectar proteínas efectoras en las células huésped, y en algunos casos promueven el establecimiento de un nicho subcelular que apoya la replicación bacteriana. El método anterior proporciona nuevas herramientas importantes para el estudio del sistema de secreción de puntos/mic del patógeno bacteriano respiratorio Legionella pneumophila, dando pistas de los mecanismos de translocación del efector que son esenciales para su patogenicidad. Este enfoque se puede aplicar a otros sistemas de secreción mediante el empleo de imágenes celulares bacterianas en vivo y estudios estructurales para diseccionar su actividad a nivel molecular. Esto se puede lograr mediante el estudio de la dinámica espaciotemporal de los componentes del sistema de secreción etiquetados fluorescentemente utilizando microscopía de vídeo de lapso de tiempo.

Construimos mutaciones limpias y sin marcar, donde un gen fue etiquetado o reemplazado por un alelo modificado, que es un enfoque fundamental para la comprensión de la patogenicidad a nivel molecular, así como para la definición de relaciones estructura-función que pueden conducir a la producción de terapias farmacológicas24,25. Las cepas de L. pneumophila que han sido modificadas genéticamente para eliminar las proteínas individuales Dot e Icm se pueden utilizar para determinar la estructura del sistema Dot/Icm por crio-ET. Un paso importante en el protocolo es comparar la funcionalidad de las proteínas etiquetadas N-terminus y C-terminus. Por lo tanto, las cepas que codifican las fusiones deben probarse para la replicación en células huésped eucariotas, visualizarse mediante microscopía para determinar si la localización de proteínas etiquetadas en la célula bacteriana depende de una máquina de secreción completamente montada y evaluada para la estabilidad de las proteínas expresadas a partir de genes ascendentes y descendentes.

Este protocolo utiliza experimentos de microscopía de células vivas, que se utilizan ampliamente para estudiar procesos biológicos complejos como la transducción de señales, el autoensamblaje, el tráfico activo y la regulación genética. Comprender la dinámica, trayectorias e interacciones de partículas individuales en las células representa un enfoque fundamental en la biología celular26. Sin embargo, dado que el seguimiento de partículas individuales puede no ser siempre posible debido al movimiento molecular rápido o a una baja relación señal-ruido, la evaluación de los cambios en la intensidad de la fluorescencia puede servir como un enfoque sencillo para cuantificar las diferencias en los patrones de dinámica. Además, dado que sólo se requieren dos puntos de tiempo para el análisis, esta metodología garantiza una exposición mínima de la muestra a la luz fluorescente y, por lo tanto, evita el blanqueo importante de la intensidad de fluorescencia sfGFP. Debido a que las almohadillas de agarosa no contienen ninguna fuente de nutrientes, es importante tener en cuenta que las imágenes en vivo deben realizarse inmediatamente después de tomar las células de las placas de agar CYE. Si se requieren períodos más largos de tiempo de imagen, entonces los suplementos que apoyan L. pneumophila supervivencia y crecimiento deben agregarse a las almohadillas. Determinar la polaridad de las proteínas etiquetadas fluorescentes también se puede modificar para aplicaciones de alto rendimiento. Si se necesitan, se debe utilizar un objetivo de fase y una configuración de condensador adecuada para adquirir imágenes de doble canal (es decir, canales de fase y fluorescentes). Es crucial elegir campos donde las bacterias están completamente separadas. Utilice el canal de fase para enmascarar células enteras y cuantificar la relación de intensidades como se describió anteriormente.

La microscopía crioelectrónica (crio-EM) y la crio-ET ofrecen una visualización robusta de las nanopartículas. Estas técnicas implican la toma de imágenes de la muestra en estado hidratado congelado, permitiendo la visualización de nanopartículas esencialmente tal como existen en su entorno celular27. Debido a que la resolución está limitada por el grosor de la muestra, las estructuras obtenidas por crio-ET tienen una resolución menor que las que se obtienen por crio-EM. Sin embargo, debido a que en cada tomograma de imagen máquinas tipo IV están presentes en múltiples copias, se puede obtener una mayor resolución aumentando el tamaño de la muestra para el promedio de subtomogramas. Una ventaja importante del crio-ET es que la visualización de ensamblajes complejos en células bacterianas intactas puede preservar mejor su estructura, lo que puede experimentar cambios drásticos al extraerlo de su entorno natural.

En conclusión, el estudio de los procesos dinámicos y la localización de moléculas son uno de los primeros pasos hacia la comprensión de la función de los sistemas biológicos. La fuerza y el enfoque del método descrito aquí es la visualización directa de los componentes De dolos/Icm en bacterias vivas, que proporciona la posibilidad de descubrir procesos dinámicos que rigen las funciones de máquinas de tipo IVB u otros conjuntos multiproteicos. Además, el acoplamiento de imágenes en vivo a crio-ET es una estrategia que permite la caracterización de componentes clave en la máquina Punto/Icm en relación con la mayor estructura del sistema de secreción de Legionella pneumophila, y la comprensión de cómo se ensamblan y dirigen los cambios de conformación en el aparato. Una limitación de las etiquetas de proteínas fluorescentes utilizadas para estudiar el comportamiento de las proteínas en las células vivas es su tamaño relativamente grande, lo que podría influir en la función y las propiedades de la proteína etiquetada. Posteriormente, se requiere una evaluación de la estabilidad y la funcionalidad. Otra limitación de este enfoque es que actualmente no se pueden obtener estructuras atómicas debido a la resolución limitada resultante del grosor de la muestra. El modelado y el ajuste pueden ser una forma eficaz de analizar las densidades, permitiendo así la localización de subunidades o la evaluación de los cambios de conformación. Las investigaciones futuras y la perfeccionamiento de este enfoque conducirán a una mejor comprensión de cómo los diferentes subensamblajes comprenden un aparato funcional tipo IV.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

D.C. y C.R.R. fueron apoyados por los NIH (R37AI041699 y R21AI130671). D.P., B.H. y J.L fueron apoyados por los Institutos Nacionales de Salud (R01AI087946 y R01GM107629).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 nm colloidal gold particles Aurion 25486
100x Plan Apo objective (1.4 NA) Nikon
ACES Sigma-Aldrich A9758
Activated charcoal Sigma-Aldrich C5510
Agaroze GPG/LMP, low melt American bioanalytical AB00981
Bacto dehydrated agar BD 214010
CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera Photometrics
Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µL Fisher Scientific AB-0578
Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh Quantifoil Q225-CR1
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 216828
K2 Summit camera for cryo-EM GATAN
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352
Microscope cover slides 22x22 mm Fisher Scientific 12-542B
Microscope cover slides 24x50 mm Fisher Scientific 12-545K
Microscope slides 25x75x1 mm Globe Scientific 1380
SlideBook 6.0 Intelligent Imaging Innovations
Spectra X light engine Lumencor
Taq 2X Master Mix New England BioLabs M0270
Titan Krios Thermo Fisher Scientific
Yeast Extract BD 212750

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References

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Inmunología e infección número 157 legionela pneumophila,enfermedad de los legionarios infección respiratoria patógenos bacterianos intracelulares sistema de secreción tipo IV sistema de secreción de puntos/icm imágenes de células vivas dinámica espaciotemporal microscopía cuantitativa de fluorescencia tomografía crioelectrónica estructuras celulares intercambio alélico
Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de <em>legionela pneumofilia/Icm</em>
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Chetrit, D., Park, D., Hu, B., Liu, J., Roy, C. R. Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System. J. Vis. Exp. (157), e60693, doi:10.3791/60693 (2020).

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