Summary
細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。
Abstract
レジオネラ・ニューモフィルのドット/Icm分泌系は、細菌極で局所化し、タンパク質およびDNA基質を標的細胞に送達する複雑なIV分泌系(T4SS)ナノマシンであり、一般的に直接細胞間接触を必要とするプロセスである。我々は最近、凍結電子断層撮影(cryo-ET)によってドット/Icm装置の構造を解明し、細胞質複合体に接続する細胞エンベロープスパンチャネルを形成することを示した。生きた細胞とcryo-ETにおける蛍光顕微鏡法を用いて、試料のネイティブ構造を保存する2つの相補的アプローチを適用することで、タンパク質の可視化と、他のDot/Icmサブユニットに対する各機械成分の生産時期と同化をその時点で可能にします。極位置の要件を調べ、T4SS機械生物発生に関連する動的特徴を特徴付けるために、染色体上のネイティブ位置でスーパーフォルダグリーン蛍光タンパク質をドット/Icm ATPase遺伝子にコードする遺伝子を融合しました。以下の方法は、生体細胞の定量的蛍光顕微鏡とcryo-ETを統合し、これらのタンパク質の細胞内の極地の局在、ダイナミクス、および構造を定量化します。レジオネラ・ニューモフィラT4SSを研究するためにこれらのアプローチを適用することは、ドット/Icmシステムの機能を特徴付けるために有用であり、T4SSまたは他のタイプの細菌分泌複合体を利用する多種多様な細菌病原体を研究するために適応することができる。
Introduction
レジオネラ菌(L.肺炎球菌)は、レジオネラ症の病因である淡水貯留層に生息し、水生自由水泳原生動物の中で細菌が感染して複製することによって増殖する。L. 気球菌は、飲料水源からのエアロゾル化細菌の吸入が発生すると、ヒトで病気の発生を引き起こす。感染した細胞では、宿主経路の転覆により、L.肺炎球菌は、それが存在する液胞のエンドサイト成熟を遅らせ、細菌複製をサポートする細胞コンパートメントの生生生成を促進することができる。このプロセスは、Dot/Icmとして知られている特殊な細菌タイプIVB分泌システム(T4BSS)と、感染中に宿主サイトゾルに転化される300以上の「エフェクター」タンパク質のレパートリーによって駆動され、細胞機能1、2、3、4、5の操作を容易にする。機能的なDot/Icm装置を欠いている変異体は、宿主サイトゾルにエフェクターを送達できず、細胞内複製に欠陥があり、疾患6,7の動物モデルにおいてアビリエントである。
多くの細菌種は、感染プロセスに必要な非常に複雑で動的なマルチコンポーネントマシンを開発してきました。Dot/Icmシステムのような他のT4BSSも、コクシエラ・ブルネティやリケッチエラ・グリリなどの細菌病原体の細胞内複製に不可欠である。T4BSSは、DNAの伝達を媒介し、エフェクタータンパク質の限られたレパートリーを提供できる原型型IVA系と進化的に関連していますが、Dot/Icmシステムは機械成分のほぼ2倍を有し、多種多様なエフェクターを提供します。おそらく、コンポーネント数のこの拡大は、Dot / Icm装置が新しいエフェクタを容易に8,9に収容し、統合することを可能にしました。
我々は最近、クライオ電子断層撮影(cryo-ET)を使用して、その場でドット/Icm装置の構造を解き、細胞質複合体に接続する細胞エンベロープスパンチャネルを形成することを示した。さらなる分析は、細胞体ATPase DotOとの相互作用を通じて、細胞内のTPCとの関連がL.ニューモフィラ細胞極のドット/Icm系と関連することを明らかにした。DotBは、ほとんどの細菌細胞に細胞間運動を示すことを発見し、このATPaseが動的な細胞構造集団に存在するが、極性ドット/Icm複合体にも関連していることを示している。さらに、DotOは、内膜複合体に関連するDotOダイマーの六方体集合体を形成し、この細胞質複合体の基部にDotBヘキサマーが結合する。DotB-DotOエネルギー複合体のアセンブリは、T4SS(図1)10を介して基板の転座を指示する細胞質チャネルを作成する。
これらの最近の進歩にもかかわらず、Dot/Icmシステムがどのように機能し、各タンパク質がどのように組み立てて活性装置8を形成するかについてはほとんど知られていない。Dot/Icm T4SSの制御回路を明らかにすることは、宿主と病原体の相互作用の分子メカニズムを理解する上で重要です。そこで、スーパーフォルダGFP(sfGFP)でタグ付けされた必須L.肺炎球菌ドット/Icmシステムコンポーネントを検出し、特徴付けるために、生細胞顕微鏡とcryo-ETを使用する方法について説明します。定量的蛍光顕微鏡を用いて、DotBの極地局在化は野生型のバックグラウンドで、またはタイプIV系が削除されたときに定義される。タイムラプス顕微鏡は、ドット/Icm細胞体ATPases間の局在およびダイナミクスの違いを定量化するために使用されます。
ライブイメージングやクライオETなどの2つの相補的アプローチを組み合わせることで、他のインビトロシステムと比較して利点があります。両方の方法は無傷の細胞で行われ、T4BSSの自然環境を維持し、サンプル調製中のネイティブ構造の破壊を最小限に抑えます。タンパク質の過剰発現は分泌装置の染色法を損なう可能性があるため、sfGFP融合は、各融合が単一コピーでコードされ、発現が内因性プロモーターによって駆動されるように、レジオネラ染色体へのアレジオン交換を介して返される。染色体でコード化された融合の可視化により、定義された時点で発現しているタンパク質の正確なレベルを定量化することができます。Cryo-ETには、分泌システムの構造を決定するための多くの利点があります。最も顕著な利点は、cryo-ETサンプルが細菌細胞アーキテクチャの文脈で天然複合体を保存する凍結された無傷の細胞で構成されているということです。その結果、cryo-ETは、膜複合体を抽出し、コア装置から末梢タンパク質を取り除くか、または全体的な構造を変更することができる生化学的精製アプローチよりも好ましい場合があります。さらに、関心のあるタンパク質にsfGFPなどのかさばるタンパク質をタグ付けすると、cryo-ETによって検出可能な質量が追加され、Dot/Icm装置の異なるサブコンプレックスをcryo-ETによって得られた構造にマッピングするのに役立ちます。
このアプローチは、細菌細胞膜に組み立てる多分子複合体に関する構造情報を明らかにするための強力なツールです。これらの手法を用いて解明された構造の解釈は、T4BSS コンポーネントの機能、機能に必要なコンポーネントの数、コンポーネントの相互作用、およびこれらの機能を理解するのに役立ちます。サブアセンブリが実行されます。
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Protocol
注:L.肺炎球菌の成長、操作、およびイメージングを含むすべての手順は、局所的なガイドラインに従って生物学的安全レベル2の実験室で行われるべきです。
1. アレル交換と二重選択戦略を用いたL.気球菌染色体へのsfGFPの挿入(図2、図3)
- 遺伝子置換ベクターpSR47S11にクローンを作成し、次の配列:目的の部位の1,000bp上流、次いでsfGFP配列、次いで1,000bp下流の対象部位(図2)。sfGFP配列は、4〜8個のアミノ酸を含むリンカーで終わるN末端またはC末端にフレーム内に配置する必要があります。得られたベクターを大腸菌DH5αλpirに変換します。その後、L.ストリークL.肺炎球菌(レシピエント)は、100μg/mLストレプトマイシンを含む100μg/mLストレプトマイシンを含む寒天12に対する単一コロニーの37°C(図3)に対して行う。
- CYE-寒天連鎖菌のストリークL.肺炎球菌は、37°C(重パッチ)10で2日間成長する。25μg/mLクロラムフェニコールを含むLB寒天上にpRK600ヘルパープラスミド(ヘルパー)13で変換されたストリーク大腸菌DH5α。50 μg/mL カナマイシンを含む LB 寒天上の大腸菌DH5αλpir(ドナー)をストリークする。
- トライペアレンタル交配を行う:選択せずにCYE寒天プレートに3つの株のパッチを重ね、37°Cで4〜8時間インキュベートすることによって、ヘルパーのコロニー、ドナーのコロニー、およびレシピエントをインキュベートする。否定的なコントロールとして、ヘルパー+レシピエント株ミックスとドナー+レシピエント株ミックスを同じ期間にインキュベートします。
- 交配反応をddH2O.プレート20 μLの500 μLおよび100 μg/mLストレプトマイシンおよび10 μg/mLカナマイシンを含むCYE寒天反応の500 μLで再中断し、37°Cで5日間成長させる。得られたクローンの4個を100μg/mLストレプトマイシンを含むCYE寒天にストリークし、37°Cで5日間増殖する。
- 5%スクロースと100 μg/mLストレプトマイシンを含むCYE寒天上の16クローンをストリークし、37°Cで5日間増殖します。次いで、100μg/mLストレプトマイシンを含むCYE寒天上のこれらのクローンの32を、100μg/mLストレプトマイシンおよび10μg/mLカナマイシンを含むCYE寒天上で、37°Cで5日間増殖する。
2. L.肺炎球菌染色体にsfGFPを統合したクローンの分離
- CYE-寒天連鎖マイシンプレート上のカナマイシンに感受性であったストリーククローンとコロニーPCRによる染色体へのsfGFPの挿入を確認した。sfGFP遺伝子と目的の染色体領域と相補的なプライマーを使用して、挿入接合部を増幅する。
- 10 μM プライマー溶液の各0.5 μLとコロニー1個を最終体積12.5 μLに混合し、95°Cで10分間変性します。氷の上で10分間冷却し、12.5 μLの2倍 PCR マスターミックス溶液を加え、PCR 分析を実行します。
- CYE-寒天-ストレプトマイシンプレート上の分離されたコロニーの重いパッチを37°Cで2日間成長させます。抗GFP抗体による免疫ブロット法によるsfGFP融合の発現レベルと安定性を調べる。
3. 蛍光タグ付きドット/Icm成分を用いたL.肺炎球菌の生細胞イメージング
- アガロースパッドの調製
- 水中に1%低融解アガロース溶液の約30mLを作ります。ガラスフラスコにマイクロ波を約90s、時折渦巻き、アガロースが完全に溶解するまで。
- 22 x 22 x 0.15 mm3ガラス スライドを 25 x 75 x 1.1 mm3ガラス スライドの端に 2 枚配置し、1 枚をもう一方のスライドの上に配置します。もう一方の端にさらに22 x 22 x 0.15 mm3ガラススライドを積み重ねなさい。
- 2つの上のガラススライドの間の中央スライドに溶融アガロースの約1mLのピペット、溶融アガロースの上に別の25 x 75 x 1.1 mm3スライドを置きます。気泡の形成を避けるようにしてください。スライドを4°Cで15分間冷まします。
- メスやカミソリの刃を使って、パッドを小さな正方形にそっと切り、〜5 x 5 mm2。両面接着剤17 x 28 x 0.25 mm3フレームを25 x 75 x 1.1 mm3ガラススライドに固定し、スライド上にパッドを複数配置します。
- 画像取得
注:次の手順は、スライドブック6.0の制御下にあり、ソリッドステートイルミエータ、CCDモノクロカメラ、および100x対物レンズ(1.4個の開口)を備えた顕微鏡について説明します。必要に応じて、プロトコル設定に従ってカスタマイズできる適切なハードウェア構成およびソフトウェア構成を備えた代替の顕微鏡装置を使用します。- L.肺炎球菌の重いパッチをddH2Oの1 mL、渦およびピペット2~3 μLの希釈液をパッドに溶解します。50 x 24 x 0.15 mm3のカバースリップを接着剤フレームの上にそっと置きます。
- キャプチャウィンドウで、NDを180に調整します。ビニングを 2×2 に調整し、488 nm チャネルを使用してサンプルを 500 ~ 1,000 ミリ秒の間で公開します。
4. 極地の局在化とドット/Icm成分のダイナミクスの定量化
注:次の手順は、2 x 2 ビニングで取得したピクセルあたり 0.129 μm のイメージ用に設計されています。
- sfGFP融合タンパク質の極性の定量 (図 5)
- 細菌がはっきりと見えるように画像のコントラストを調整します。領域ツールを使用して、極から始めて細胞質に伸びる0.25 x 1.3 μm 2の長方形を配置します。四角形は、細菌の境界内に正確に残る必要があります。
- 少なくとも 200 個の細菌をマークし、[マスクする領域] ボタンを使用して、対象地域にマスクを作成します。[マスク統計とマスクスコープ] で、[オブジェクト] を選択します。次に、[特徴と強度] で、[平均強度と分散] をマークします。
- データをエクスポートし、各細菌の極性スコアを平均強度に対する分散の比率として計算します。
- ハイスループットアプリケーションの場合は、位相と488 nmチャネルで画像を取得するために、位相目標と適切なコンデンサ設定を使用します。細菌が完全に分離されている視野を選択してください。
- 画像の位相チャネルのコントラストを、細菌がはっきりと見えるレベルに調整します。デュアルチャンネルイメージを開き、セグメントマスク作成ウィンドウを起動し、チャンネルをフェーズに変更します。
- 適切なしきい値を調整し、[オブジェクトの定義]ボタンを使用して小さなオブジェクトを削除します。[マスクをリファイン]で、[エッジ オブジェクトを除去]を選択し、後で隣接するバクテリアのマスクを分離します。
- ステップ 4.1.2 ~ 4.1.3 で説明したように、各セルの 488 チャネルの信号の極性スコアを計算します。
- sfGFP融合タンパク質のダイナミクスの定量化 (図 6)
注: セクション 3 の指示に従って、画像取得のサンプルを準備します。ダイナミクスは時間の経過に伴う強度の変化として定義され、次の手順は短いイメージング期間(すなわち、数分)のために設計されています。より長いイメージング期間が望ましい場合は、適切なサプリメントをパッドに加えます。- [イメージキャプチャ]ウィンドウで、[Timelapse]をマークし、[間隔]ボックスに間隔の時間を入力し、[時間ポイントの数]ボックスに2を入力します。目的の蛍光タンパク質を発現するL.肺炎球菌の2つの連続した画像を取得します。
- セルがはっきりと見えるまで、画像のコントラストを調整します。図 6Aと以下の説明に従って、3 つの異なるマスクを配置します。領域ツールを使用して、少なくとも400個のセルの中央に0.25 x 0.25 μmの正方形を配置します。
- [マスクする領域] ボタンを使用して、対象となる四角形のマスク (マスク 1) を作成します。新しい空のマスク(マスク 2)を作成し、ピクセルツールまたはポリゴンツールを使用して、少なくとも25個のランダムセルのセル領域全体をマークし、蛍光漂白の計算に使用します。新しい空のマスク(マスク 3)を作成し、大きなブラシツールを使用してセル間の領域をマークします。
- [マスク統計とマスク範囲] で、[マスク1] の [オブジェクト]を選択し、マスク 2 を選択します。次に、[フィーチャと強度] で [平均強度] を選択し、2 つのマスクのデータをエクスポートします。マスク 3 の場合、マスク全体の平均強度をエクスポートします。
- マスク 1 の各オブジェクトの蛍光強度の変化を次の式を使用して計算します。
ここでマスク1は、セル中心に0.25μm×0.25μmの正方形を、マスク2はセル全体を覆い、マスク3はセル間の背景、t1は最初のタイムポイントの平均強度、t2は2番目の時間ポイントの平均強度である。
クライオ-ETによるsfGFP質量密度の検出
- サンプルの準備、データ収集、および再構築
- CYE-寒天ストレプトマイシンプレート上の蛍光タグ付きDot/Icmタンパク質を37°Cで48時間発現するL.肺炎球菌の重いパッチを成長させます。ddH2Oの細胞をOD600〜0.7に再懸濁する。5 μLのコロイド状金粒子(BSAトレーサー、10 nm)を細胞懸濁液の20 μLに加えます。
- ピペット5μLの細胞混合物を、新たにグロー排出された穴あきカーボングリッド(Cu 200メッシュ上のR2/1)に、前述のように重力駆動プランジャー装置を用いて濾紙でブロットを1分間放置し、液体エタンで凍結させる。
- フィールドエミッションガン、エネルギーフィルター、ボルタ相プレート、直接検出装置を搭載した300kV透過型電子顕微鏡で凍結水和標本を画像化します。26,000x と 42,000x の倍率で単軸傾斜系列を収集し、その結果、それぞれ 5.4 Å/ピクセルまたは 3.4 Å/ピクセルの標本レベルでピクセル サイズが得られます。
- 断層図パッケージSerialEMを使用して、-0 μmの焦点がずれた画像スタックを収集し、3°ステップインクリメントと累積用量で-60°~+60°の間の傾斜角の範囲で、~60 e-/Å2,16を収集します。MotionCor217を使用して、各スタック内の線量分画ムービーイメージを整列させます。TOMOAUTO14を使用してドリフト補正スタックを組み立てます。
- ドリフト補正スタックを IMOD マーカー依存の位置合わせ18で整列します。セグメンテーションおよびダイレクト画像解析用のSIRT法19とWBP法20を用いて、トモグラムを再構築する。
- sfGFP融合サンプルのサブトモグラム解析
- サブモグラム解析14、21、22の場合は、断層図パッケージ I3 (0.9.9.3) を使用します。
注: 線形は反復的に進行し、各反復は参照と分類マスクが生成され、サブトモグラムが整列および分類され、クラス平均が互いに整列される 3 つの部分で構成されます。 - 最初の位置合わせには、4 x 4 x 4 ビン分割サブトモグラムを使用します。クラス平均に属する粒子を結合し、sfGFPに対応する電子密度を示します。sfGFP 融合で粒子を選別した後、2 x 2 x 2 ビン分割サブモグラムを使用して、対象領域(Dot/Icm 細胞質 ATPase 複合体など)の焦点を合わせ、高解像度の構造を得る。
- サブモグラム解析14、21、22の場合は、断層図パッケージ I3 (0.9.9.3) を使用します。
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Representative Results
2段階で二重選択との相同組換えがsfGFPの定義された挿入を構築するために使用された。第1のステップでは、大腸菌ヘルパー株MT616からのpRK600共役プラスミド(IncPプラスミド)を2つの相同領域に横たわるsfGFP遺伝子を含む自殺ベクターpSR47Sを用いてドナー大腸菌株に動員したトライペアレンタル交配を行った。次に、pRK600からの共役系は、pSR47S誘導体をL.肺炎球菌に動員するのを補助した(Lp01、図2A)。単一のクロスオーバーイベントによってpSR47Sを正常に統合したクローンは、抗生物質耐性遺伝子KanRのために選択され、第2のクロスオーバーを可能にするために伝播された。2回目のクロスオーバー中にsacB遺伝子を失ったクローンは、副選択剤スクロース上の細胞をめっきして選択した(図2、図3)。抗GFP抗体(α-GFP)を用いた免疫ブロット解析を行い、sfGFPが切断されたかどうかを判定し、野生型または完全ドット/icm欠失変異体における融合タンパク質の安定性および発現量を評価した。また、顕微鏡検査に進む前に、sfGFP遺伝子を染色体に正しく組み込んだPCR(図3)で確認した。いったん安定性と融合の統合が確認されると、生細胞蛍光顕微鏡を行い、蛍光シグナルクローンの特異性を親sfGFP陰性株と比較した。また、明視野または位相顕微鏡を用いたデュアルイメージングを用いて、特定の蛍光シグナルを有する細胞の割合を調べた(図4)。
DotB-sfGFPを産生した細胞のほんの一部だけが、融合タンパク質の極地局在化を示した(図5A)。DotB蛍光信号の分布を特徴付けるために、それらの細胞における縦軸に沿ったDotB-sfGFPの強度を定量化した。極のDotB強度は、サイトゾルよりも約2倍高かった(図5B)。蛍光タグ付き融合タンパク質の局在化が生物学的関連性を有するかどうかを判断することは重要であるため、DotB-sfGFP極局が完全に組み立てられたT4BSSに依存しているかどうかを尋ねた。したがって、細胞の中間付近で測定された蛍光と比較して極で測定された平均蛍光の比を示すDotB-sfGFPの極性スコアは、野生型およびT4BSS変異体の個々の細胞について決定した(図5C–E)。実際、Dot/Icmシステム全体の削除はDotB-sfGFPの極位置を損ない、極性パンクタがDotBとT4SSとの関連付け、およびこのATPaseの採用のためのドット/Icmマシンの重要性を表していることを確認した。ほとんどのL.肺炎球菌細胞では、DotB-sfGFPも細胞構造運動を示し、動的な細胞構造集団に存在するが、極ドット/Icm複合体と関連付け可能であることを示している。DotOとDotB ATPesの動的運動の違いを定量化するために、2つの連続した画像を取得し、蛍光強度の変化を決定し、sfGFPと比較した(図6A)。sfGFPおよびDotO-sfGFPは動的パターンをほとんどまたは全く示さなかったが、サイトゾルのDotB-sfGFP強度変化はシフトし、有意に高かった。これらの観察は、DotB ATPaseが動的な細胞種集団に存在し、後期アセンブリ反応において、空間的に動的なDotB ATPaseを極に局在したドット/Icm T4SSに採用したことを示している(図6B)。
Dot/Icmマシンに対するDotBの空間位置を定義するために、DotB-sfGFPを発現するL.肺炎球菌株で無傷のT4BSS装置を視覚化するためにハイスループットcryo-ETを使用した。まず、DotB-sfGFPを発現するL.気球菌細胞の再構成を行い、細胞エンベロープに埋め込まれた典型的な複数の円錐形複合体を明らかにした(図7A、B)。我々は、DotBがATPase DotO10のユニークなアセンブリの下に空間的に位置することを、Dot/Icm変異体、蛍光顕微鏡、およびcryo-ETの様々なエピスタティック実験を使用して以前に実証した。DotB-sfGFPを発現する株のサブトモグラム平均化は、無傷のT4BSSマシンに関するDotBの全体的な位置決めを決定した。この分析は、sfGFPの追加質量と相関する余分な密度を明らかにした(図7C)。最後に、Dot/Icm T4SS全体の3次元表面レンダリングは、sfGFPがDotBヘキサマーの下に位置し、細胞質ATPase複合体の基部にディスクとして組み立てられることを示す(図8)10。
図1:L.肺炎球菌ドット/Icm T4SSの3次元表面レンダリングOM=外膜、IM=内膜、PG=ペプチドグリカン。画像は、Chetrit D. ら10.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:L.肺炎球菌染色体にsfGFPを挿入するために使用される相同組換えおよびアレル交換の概略的概要。(A)共役プラスミドpRK600(IncPプラスミド)を収容する大腸菌MT616ヘルパー株と、自殺ベクターpSR47Sで形質転換されるドナー大腸菌株、およびL.肺炎球菌をレシピエントとして行うトライペアレンタル交配。(B)C末端sfGFP融合タンパク質を生成するためにL.肺炎球体にsfGFPを挿入するために必要なステップを描いた模式モデル。アレク酸交換変異体の選択は、カナマイシンとカウンタ選択マーカー sacBを用いて2つのステップで達成した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:アラリック交換アッセイのワークフローL. 肺炎球菌は、適切な選択と成長時間にストリークされた(詳細についてはプロトコルセクションを参照)。その後、sfGFP遺伝子と共に挿入部位に隣接する染色体領域に相補的なプライマーを用いたコロニーPCRで染色体へのsfGFPの挿入が確認された。融合タンパク質の安定性を抗GFP抗体を用いた免疫ブロット解析により検討した。左下パネル:レーン1=タグなしLp01、Lane2=ドットBオペロンから表現されたsfGFP、レーン3=ドット/sfGFPは完全なドット/icm欠失変異体で表現され、レーン4=DotB-sfGFPは野生型の背景で表現した。WB = ウェスタンブロット。各ステップで分析されたクローンの数は括弧で示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:蛍光タグ付きDot/Icmサブユニットを発現するL.肺炎球菌の生細胞イメージング。(A)2日間の重いパッチからのL.L.肺炎球菌をddH2Oで再懸濁し、1%低融解アガロースパッドの上に置いた。(B)DotB-sfGFPを染色体的にコードする株の蛍光シグナルの特異性を、親GFP陰性Lp01株と比較した。スケールバー= 3 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ドット/Icmシステムサブユニットの極地の局在化の定量化。(A) Lp01で表現されたDotB-sfGFPのリアルタイム可視化は極地の局在を示した。DotB-sfGFPは、ドット/icm遺伝子クラスター全体が削除された株で表現すると拡散パターンを表示した(":"T4SS)。dotBオペロンから発現した未注入sfGFPは、拡散性細胞膜パターンを示し、対照として役立った。スケールバー= 3 μm(B)極性または拡散パターンを有する細胞の縦軸に沿ったDotB-sfGFP蛍光強度の定量化。試料サイズは、極性細胞および非極性細胞に対してn=20個の細胞であった。*p = 0.02, **p ≤ 0.0001.有意性は、両手の学生のt検定によって計算され、ポールの強度と比較された。(C)極性を定量化するために使用されるマスクの概略モデル。(D) 極性を定量化するために使用されるマスクを使用して図 5Aに示すように、DotB-sfGFP。(E) 極における DotB-sfGFP の存在量は、野生型の背景で表現されるとき、またはドット/icm遺伝子クラスター全体が削除された場合、周波数曲線として表示される。サンプルサイズは、各株に対してn=200個の細胞であった。* p < 0.0001.有意性は、二尾のマン・ホイットニー検定によって計算され、dotBオペロンから発現したsfGFPと比較された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ドット/Icm蛍光融合のダイナミクスの定量化(A)動的または静的なsfGFP融合タンパク質の蛍光強度の変化を定量化するために使用されるマスクを描写した模式モデル。T1,2は第1および第2の時間点とm1,2,3の時間がマスク1、マスク2、マスク3である。(B) ドットB-sfGFP、DotO-sfGFP、およびドットオーペロンから表現されるsfGFPのダイナミクスは、周波数曲線として表示されます。サンプルサイズは、各株に対してn=400細胞であった。*p = 3.4 × 10-12, ***p = 1.0 × 10-147.有意性は、sfGFPと比較して両手の学生のt検定によって計算された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:サブトモグラム平均化は、DotB-sfGFPのsfGFP密度を決定するために使用される。(A) DotB-sfGFPを発現するL.ニューモフィラ細胞から26,000倍の倍率で取得した断層切片で、細胞エンベロープに埋め込まれた複数のドット/Icmマシンを示す。(B) Aに示す同じL. 肺炎球体ポールの倍率 42,000 倍で取得した断層切片。OM = 外膜、 IM = 内膜。(C)DotB-sfGFPを発現する株からの再構成は、DotBおよびsfGFP(黄色の矢印)に対応する密度を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8: ドット/Icm サイトソリック複合体の 3 次元サーフェス レンダリング":"dotB (A) 野生型 (B) 、および dotB-gfp (C) L. 気球菌株からの Dot-Icm T4SS 全体の 3 次元表面レンダリング。(D) サイトソリック複合体の構造は、DotB (紫) と sfGFP (緑) の位置を示す。DotB(PDB:6GEB23)のX線構造をDotBマップにドッキングしました。IM = 内膜。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
細菌分泌系の機能を解明することは、宿主と病原体の相互作用を完全に理解する鍵です。分泌系は、エフェクタータンパク質を宿主細胞に注入できる複雑な機械であり、場合によっては細菌複製をサポートする細胞内ニッチの確立を促進する。上記の方法は、呼吸器病原体レジオネラ肺炎球菌のDot/Icm分泌システムを研究するための重要な新しいツールを提供し、病原性に不可欠なエフェクター転座のメカニズムの手がかりを生み出す。このアプローチは、生きた細菌細胞イメージングと構造研究を採用して、その活性を分子レベルで解剖することによって、他の分泌システムに適用することができる。これは、タイムラプスビデオ顕微鏡を用いて蛍光タグ付き分泌系コンポーネントの時空間ダイナミクスを研究することによって達成することができる。
我々は、遺伝子がタグ付けまたは改変対立遺伝子に置き換えられたクリーンで無印の突然変異を構築し、分子レベルでの病原性の理解と、薬物療法24、25の産生につながる可能性のある構造機能関係の定義のための基本的なアプローチである。個々のドットおよびIcmタンパク質を排除するために遺伝子組み換えされたL.肺炎球菌の株は、cryo-ETによってドット/Icm系の構造を決定するために使用することができる。プロトコルの重要なステップは、N末語とC末語のタグ付きタンパク質の機能を比較することです。したがって、核融合をコードする株は、真核生物宿主細胞における複製について試験し、細菌細胞におけるタグ付きタンパク質の局在化が完全に組み立てられた分泌機に依存しているかどうかを判断するために顕微鏡で可視化し、上流および下流遺伝子から発現するタンパク質の安定性を評価する必要がある。
このプロトコルは、シグナル伝達、自己組み立て、活動的な人身売買、遺伝子調節などの複雑な生物学的プロセスを研究するために広く使用されている生細胞顕微鏡実験を利用しています。細胞内の単一粒子のダイナミクス、軌道、および相互作用を理解することは、細胞生物学26における基本的なアプローチを表す。しかし、高速な分子運動や低いシグナル対雑音比のために単一粒子を追跡することは必ずしも可能ではない場合があるため、蛍光強度の変化を評価することは、ダイナミクスパターンの違いを定量化する簡単なアプローチとして役立つ可能性があります。さらに、分析に必要な時間ポイントは2つしかないため、この方法論は蛍光灯へのサンプルの暴露を最小限に抑え、sfGFP蛍光強度の大きな漂白を防ぎます。アガロースパッドには栄養素の供給源が含まれていないため、CYE寒天プレートから細胞を採取した直後にライブイメージングを行う必要があることに注意することが重要です。イメージング時間が長い場合は、L.肺炎球菌の生存と成長をサポートするサプリメントをパッドに追加する必要があります。蛍光タグ付きタンパク質の極性を決定することも、ハイスループットアプリケーションのために変更することができます。これらが必要な場合は、二相チャンネル画像(すなわち、位相および蛍光チャネル)を取得するために、位相目標と適切な凝縮器のセットアップを使用する必要があります。細菌が完全に分離されているフィールドを選択することが重要です。フェーズチャネルを使用して細胞全体をマスクし、上記のように強度の比率を定量化します。
クライオ電子顕微鏡(クライオEM)とクライオETは、ナノ粒子の堅牢な視覚化を提供します。これらの技術は、凍結水和状態での試料のイメージングを伴い、細胞環境27に存在するナノ粒子を本質的に可視化することを可能にする。分解能は試料の厚さによって制限されるため、cryo-ETによって得られる構造は、クライオEMで得られるものよりも低い解像度を有する。それにもかかわらず、各画像のトモグラムタイプIVの機械機は複数のコピーで存在するので、サブトモグラム平均のためのサンプルサイズを大きくすることによって解像度を増加させることができる。cryo-ETの主な利点の1つは、無傷の細菌細胞の複雑なアセンブリの視覚化は、自然環境からの抽出時に劇的な変化を受けることができる構造をよりよく保存できることです。
結論として、生体システムの機能を理解するための第一歩として、動的プロセスと分子の局在化の研究が行なわれている。ここで説明する方法の強さと焦点は、IVB型機械または他の多タンパク質アセンブリの機能を支配する動的プロセスを明らかにする可能性を提供する、生きた細菌におけるDot/Icm成分の直接可視化である。さらに、ライコシングライブイメージングをクライオ-ETに結合させることは、レジオネラ肺炎球菌分泌系の構造の拡大に関連して、ドット/Icmマシンの主要成分の特性評価を可能にする戦略であり、装置の組み立てと直流の構造変化の理解を可能にする。生きている細胞におけるタンパク質の挙動を研究するために使用される蛍光タンパク質タグの1つの制限は、タグ付きタンパク質の機能および特性に影響を与える可能性のある比較的大きなサイズである。その後、安定性と機能性の評価が必要です。この方法のもう 1 つの制限は、サンプルの厚さから生じる分解能が限られているため、現在原子構造が得られない点です。モデリングと適合は、密度を分析する効果的な方法となり、サブユニットのローカリゼーションや立体構造の変化の評価が可能になります。今後の調査とこのアプローチのさらなる完成は、異なるサブアセンブリが機能的なタイプIV装置をどのように構成するかをより深く理解することにつながる。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
D.C.とC.R.R.はNIH(R37AI041699およびR21AI130671)によってサポートされました。D.P.、B.H.、J.Lは国立衛生研究所(R01AI087946およびR01GM107629)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
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