ANÁLISis de metilación de LINE-1 en células madre mesenquimales tratadas con vesículas extracelulares derivadas de osteosarcoma
Summary
Aquí se describe el uso de un método de amplificación de sonda específico para metilación para analizar los niveles de metilación de los elementos LINE-1 en células madre mesenquimales tratadas con vesículas extracelulares derivadas de osteosarcoma. También se demuestra la ultracentrifugación, un procedimiento popular para separar vesículas extracelulares del suero bovino fetal.
Abstract
La amplificación de sonda específica de metilación (MSPA) es una técnica simple y robusta que se puede utilizar para detectar diferencias relativas en los niveles de metilación de las muestras de ADN. Es ingenioso, requiere pequeñas cantidades de ADN y toma alrededor de 4-5 h de trabajo práctico. En la técnica presentada, las muestras de ADN se desnaturalizan primero y luego se hibridan a sondas que apuntan al ADN en sitios metilados o de referencia como control. El ADN hibridado se separa en reacciones paralelas, una sometida únicamente a la ligadura y la otra sometida a ligadura seguida de la digestión mediada por HhaI en secuencias GCGC no metiladas. Los fragmentos de ADN resultantes son amplificados por PCR y separados por electroforesis capilar. Los sitios de GCGC metilados no son digeridos por HhaI y producen señales máximas, mientras que los sitios GCGC no metilados se digieren y no se generan señales máximas. La comparación de los picos normalizados de control de las versiones digeridas y no digeridas de cada muestra proporciona la relación de dosificación de metilación de una muestra de ADN. Aquí, MSPA se utiliza para detectar los efectos de las vesículas extracelulares derivadas del osteosarcoma (EV) en el estado de metilación del elemento nuclear intercalado largo-1 (LINE-1) en células madre mesenquimales. Los LINE-1 son elementos repetitivos del ADN que normalmente sufren hipometilación en el cáncer y, en esta capacidad, pueden servir como biomarcadores. La ultracentrifugación también se utiliza como método rentable para separar las vesículas extracelulares de los fluidos biológicos (es decir, al preparar suero bovino fetal agotado por EV [FBS] y aislar los vehículos eléctricos de los medios condicionados por osteosarcoma [centrifugación diferencial]). Para el análisis de metilación, las sondas line-1 personalizadas están diseñadas para dirigirse a tres sitios de metilación en la secuencia de promotor es tinoya y siete sitios de control. Este protocolo demuestra el uso de MSPA para el análisis de metilación LINE-1 y describe la preparación de FBS agotado por EV por ultracentrifugación.
Introduction
La metilación del ADN es una modificación epigenética importante que se produce en las células humanas. La metilación del ADN se refiere a la vinculación de los grupos metilo con los residuos de citosina en los dinucleótidos de CpG. Estos dinucleótidos se encuentran generalmente en grupos (islas CpG) en la región de 5′ de genes1. En las células normales, la mayoría de estos dinucleótidos existen en un estado no metilado, lo que permite la transcripción del ADN. Por cierto, muchos cánceres se asocian con islas de CpG hipermetiladas y silenciamiento transcriptomo2,especialmente en genes supresores de tumores, que a su vez contribuyen a varias señas de identidad del cáncer3.
Por otro lado, los elementos nucleares intercalados largos-1 (LINE-1s o L1s) son elementos de ADN repetitivos y transposibles que normalmente tienen altos niveles de metilación en las islas CpG. La metilación de LINE-1 previene la translocación y ayuda a mantener la integridad del genoma. En varios tipos de cáncer, LINE-1 se hipotila, lo que resulta en activación y posterior inestabilidad cromosómica mediada por retroposición4. LINE-1 representa casi el 17% del genoma humano5, y su estado de metilación puede servir como un indicador de los niveles globales de metilación genómica6. Se considera que la hipometilación global de LINE-1 precede a la transición de las células a un fenotipo tumoral7; por lo tanto, es prometedor como un marcador potencial para el inicio temprano del cáncer.
Actualmente, existen varios métodos para el análisis de metilación, incluyendo pirosequencing, PCR específico de metilación, microarrays e inmunoprecipitación de cromatina1. El uso de la secuenciación de próxima generación también ha hecho posible incorporar enfoques para todo el genoma para la detección de la metilación del ADN. Muchos de estos métodos se basan en ADN tratado con bisulfito, en el que las citosinas no metiladas se convierten en uracilo y las citosinas metiladas permanecen sin cambios. Sin embargo, trabajar con ADN tratado con bisulfito tiene varios escollos, como conversiones incompletas de citosinas no metiladas en uracilo, amplificación sesgada de secuencias y errores de secuenciación8.
En la amplificación de sonda específica de metilación (MSPA), las sondas compuestas por dos oligonucleótidos se dirigen a secuencias de ADN que contienen un sitio de restricción (GCGC) para la enzima de restricción sensible a la metilación HhaI9. Después de que las sondas se hibridan al ADN, cada muestra se divide en dos conjuntos. Las sondas del primer conjunto sufren ligadura, mientras que las sondas del segundo conjunto sufren ligadura seguida de digestión mediada por HhaI en sitios de CGCG no metilados. Ambos conjuntos de muestras son amplificados por PCR, y los productos están separados por electroforesis capilar. Las sondas en sitios no metilados son digeridas por HhaI y no se amplifican durante la PCR, lo que resulta en señales máximas. Por el contrario, las sondas en sitios metilados están protegidas de la digestión y, por lo tanto, se amplifican durante la PCR, generando posteriormente señales máximas10.
MSPA tiene varias ventajas sobre los métodos alternativos. En primer lugar, requiere una cantidad baja de ADN (50-100 ng) y es adecuado para el análisis de ADN a partir de muestras incrustadas de parafina fija de formalina10. No requiere ADN tratado con bisulfito; de hecho, no es adecuado para el ADN que se modifica de esta manera. Muchas muestras se pueden analizar al mismo tiempo, y las sondas MSPA se pueden diseñar de manera que se dirijan a múltiples genes o secuencias simultáneamente. Además, las sondas son específicas y sensibles para el ADN metilado, ya que el sitio de restricción HhaI corresponde a una secuencia típica de las islas CpG10.
Este estudio investigó los efectos de las vesículas extracelulares derivadas del osteosarcoma (OS) en la metilación LINE-1 en células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (AT-MSCs; Figura 1). Los vehículos eléctricos son vesículas a nanoescala unidas a membranas secretadas por la mayoría de los tipos de células. Llevan proteínas, lípidos, ARNm, microARN y moléculas adicionales de las células madre11,12. Los vehículos eléctricos median la comunicación intercelular y desempeñan un papel importante en varias condiciones fisiopatológicas13,14. Un estudio reciente mostró que los vehículos eléctricos derivados del cáncer pueden transferir LINE-1 activo a las células receptoras15. Se ha informado anteriormente que los vehículos eléctricos de la línea celular HOS-143B pueden alterar el estado de metilación de LINE-1 en los MSC, además de otros efectos genéticos16.
Al cultivar células para el aislamiento de EV, es importante utilizar suero bovino fetal agotado por EV [FBS] en el medio de crecimiento, ya que los vehículos eléctricos derivados del FBS pueden interferir con los vehículos eléctricos de otras fuentes y obstaculizar los resultados17,18. La ultracentrifugación es uno de los métodos más comunes para agotar los vehículos eléctricos de FBS. Es un procedimiento relativamente simple y rentable en comparación con alternativas como la ultrafiltración y el FBS19comercial, agotado por EV. Aquí, el protocolo también demuestra cómo preparar FBS agotado por EV por ultracentrifugación.
Este artículo presenta un protocolo detallado para las técnicas antes mencionadas, desde el aislamiento de los vehículos eléctricos de una línea celular del sistema operativo hasta el análisis de metilación de LINE-1 en los MSC tratados con OS-EV(Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio ilustra cómo se puede utilizar la MSPA para detectar y cuantificar el estado de metilación de un elemento genético específico. LINE-1 fue el foco aquí, pero las sondas se pueden diseñar para apuntar a una gama de genes y secuencias. Además, hay una creciente lista de mezclas de sondas disponibles para diferentes aplicaciones. MSPA es una técnica simple y robusta para el análisis de metilación de ADN que no requiere conversión de bisulfito10. El procedimiento completo, desde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la financiación de proyectos de la Universidad de Helsinki (WBS490302, WBS73714112) Financiación estatal del Hospital Universitario de Helsinki para la investigación sanitaria a nivel universitario (Y1014SUL05, TYH2016130), la Fundación Médica Finlandesa-Noruega, y el Selma y Fondo Maja-Lisa Selander (Fundación Minerva). Agradecemos a Walter Pavicic por proporcionar el protocolo MSPA modificado y por el soporte técnico relacionado. Estamos agradecidos a Teemu Masalin (Universidad de Helsinki) por ayudarnos con la producción de vídeo.
Materials
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14×95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
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