Summary
التهرب من القاتل الطبيعي (NK) القضاء على الخلايا بوساطة الخلايا السرطانية مهم لبدء السرطان والتقدم. هنا، نقدم بروتوكولين غير قائمين على النشاط الإشعاعي لتقييم السمية الخلوية بوساطة NK تجاه خلايا الورم الكبدي. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم بروتوكول ثالث لتحليل ترحيل خلية NK.
Abstract
الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) هي مجموعة فرعية من مجموعة الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا في الجهاز المناعي الفطري وتشارك كخط دفاع أول عن طريق تطهير الخلايا المصابة بالممرضات والخبيثة والمجهدة. قدرة خلايا NK للقضاء على الخلايا السرطانية يجعلها أداة هامة في مكافحة السرطان. العديد من العلاجات الجديدة القائمة على المناعة قيد التحقيق لعلاج السرطان التي تعتمد إما على تعزيز نشاط الخلايا NK أو زيادة حساسية الخلايا السرطانية للقضاء على الخلايا NK بوساطة. ومع ذلك ، من أجل تطوير هذه النهج العلاجية بشكل فعال ، هناك حاجة أيضًا إلى تحليل فعال من حيث التكلفة في المختبر لرصد السمية الخلوية بوساطة الخلايا في NK والهجرة. هنا، نقدم اثنين من بروتوكولات المختبر التي يمكن أن ترصد بشكل موثوق واستنساخي تأثير السمية الخلوية الخلايا NK على الخلايا السرطانية (أو الخلايا المستهدفة الأخرى). هذه البروتوكولات غير قائمة على النشاط الإشعاعي، وبسيطة الإعداد، ويمكن توسيع نطاقها للفحص عالي الإنتاجية. كما نقدم بروتوكولًا قائمًا على قياس الخلايا للتدفق لمراقبة هجرة خلايا NK بشكل كمي ، والتي يمكن أيضًا توسيع نطاقها للفحص عالي الإنتاجية. بشكل جماعي ، يمكن استخدام هذه البروتوكولات الثلاثة لمراقبة الجوانب الرئيسية لنشاط الخلايا NK الضرورية لقدرة الخلايا على القضاء على الخلايا المستهدفة المختلة.
Introduction
قدرة جسم الإنسان على تحديد غير الذات والقضاء على الأجسام الغريبة هو المفتاح لبقاء الإنسان ضد مسببات الأمراض والأورام الخبيثة1. تلعب الاستجابة المناعية البشرية الدور الأهم في هذه العملية2و3و4. استنادا ً إلى الخصائص والوظائف الرئيسية، يمكن تصنيف الجهاز المناعي البشري على نطاق واسع إلى مجموعتين وظيفيتين رئيسيتين: الجهاز المناعي التكيفي والجهاز المناعي الفطري. نظام المناعة التكيفي هو عادة محددة لمسببات الأمراض معينة ولها الذاكرة المناعية، وبالتالي، هو طويل الأمد وتستجيب لإعادة العدوى في المستقبل من قبل نفس العامل الممرض5،6،7،8،9. وعلى النقيض من ذلك، فإن المناعة الفطرية أوسع بكثير في القضاء على أهدافها وغير محددة نسبيا. لذلك ، عادة ، تعمل الاستجابة المناعية الفطرية كخط أول للدفاع المناعي10. تنتمي الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) إلى الجهاز المناعي الفطري وتمثل 10-15٪ من إجمالي الخلايا اللمفاوية المتداولة11. خلايا NK القضاء على الخلايا المستهدفة عن طريق آليتين رئيسيتين. أولا، عند ملزمة للخلايا المستهدفة التي تعبر عن تنشيط ligands، خلايا NK الإفراج عن بروتين البروتين تعطيل الغشاء وحبيبات البروتياز سيرين من خلال exocytosis، والتي تحفز معا المبرمج في الخلايا المستهدفة12،13،14،15. بالإضافة إلى ذلك، تتفاعل خلايا NK التي تعبر عن FasL وعامل النخر المرتبط بالورم في الخلايا العضوية المسببة للإصابة بالخلايا (TRAIL) مع الخلايا المستهدفة التي تعبر عن مستقبلات الموت (Fas/CD95)، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج المعتمد على الكاسباس16. والأهم من ذلك، لا تتطلب خلايا NK التحفيز المسبق، مثل عرض المستضد، للقضاء على الخلايا المصابة بمسببات الأمراض أو الخلايا الخبيثة. وهكذا ، فإنها عادة ما تكون في حالة جاهزة للقتل17،18. من أجل منع تطور الورم والتقدم والقضاء على الخلايا السرطانية ، يجب أن تهاجر خلايا NK إلى موقع الورم ، ومرة واحدة في البيئة الدقيقة للورم ، وتحديد الخلايا المستهدفة ومهاجمة.
في الماضي ، تم رصد وظائف المؤثرات الخلايا NK بشكل رئيسي عن طريق إزالة الحبيبات ومقايسة السمية الخلوية19،20،21. NK خلية السمية الخلوية يمكن أيضا أن تقاس 51الكروم الإفراج عن اقهة22،23،24،25. غير أن هذا التناول له بعض المتطلبات المحددة، بما في ذلك الحاجة إلى عداد غاما، وهو قائم على النشاط الإشعاعي، الأمر الذي يتطلب التدريب على مناولة المواد المشعة والتخلص منها ويشكل مستوى من الخطر على المستخدم. ولذلك، تم تطوير العديد من المقالات الجديدة غير القائمة على النشاط الإشعاعي وتوظيفها لدراسة نشاط الخلية NK.
هنا ، ونحن نصف اثنين من هذه البروتوكولات ، والألوان lactic dehydrogenase (LDH) قياس على أساس NK بوساطة خلية اختبار السمية الخلوية وcalcein acetoxymethyl (AM) على أساس تلطيخ طريقة مجهرية لقياس NK خلية بوساطة الخلايا الخلايا القضاء على الخلايا. هذه المقايسات لا تتطلب استخدام النظائر المشعة، وهي مباشرة وحساسة، وتحدد بشكل مستنسخ العوامل التي تعدل وظيفة الخلية NK. بالإضافة إلى ذلك، لأنه لا يمكن تقييم وظيفة الخلية NK بشكل كامل دون رصد التغييرات في ترحيل الخلايا NK، نقدم أيضًا طريقة كمية تستند إلى قياس الخلايا لمراقبة ترحيل الخلايا NK.
Protocol
1. إعداد ثقافة المتوسطة لخلايا NK وخلايا الورم الكبدي
- استخدام الخلايا البشرية القاتلة الطبيعية (على سبيل المثال، NK92MI) وخط خلايا سرطان الكبد البشري (على سبيل المثال، SK-HEP-1).
- إعداد NK خلية ثقافة المتوسطة لNK92MI خلايا NK NK الإنسان عن طريق إضافة المكونات التالية إلى 500 مل من الحد الأدنى من ألفا المتوسطة الأساسية النسر دون ribonucleosides وdeoxyribonucleosides إلى التركيزات النهائية المشار إليها: 0.02 mM حمض الفوليك (100 ميكرولتر من 100 مل حمض الفوليك), 0.2 m m myoinositol (500 ميكرولتر من 200 م. م. 0.1 م م-ميركابتوإيثانول (3.5 ميكرولتر من 14.3 م من 14.3 م- ميركابتوإيثانول), 2 مم ل-جلوتامين (5 مل من 200 م لتر L-الجلوتامين), 1% بنسلين/ستريبتومسين (5 مل من 100x بنسلين/ستريبتوموسين), 12.5% البو مصل (FBS)، و 12.5٪ مصل الحصان. مزيج وتصفية تعقيم باستخدام وحدة الترشيح المعقمة 0.22 ميكرون، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
- إعداد ثقافة المتوسطة لخط خلايا الورم الكبدي SK-HEP-1 عن طريق إضافة 10٪ FBS و 1٪ البنسلين / ستريبتومسين إلى متوسطة النسر المعدلة عالية الجلوكوز Dulbecco (DMEM) التي تحتوي على 2 MM L-الجلوتامين.
2. قياس الألوان LDH قياس المستندة إلى NK خلية بوساطة تحليل السمية
- ازرع خلايا SK-HEP-1 إلى 70−80% التقاء في طبق بيتري لاستزراع الخلايا مقاس 100 مم في 5% ثاني أكسيد الكربونعند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2. توليد تعليق خلية واحدة عن طريق الغسيل أول خلايا مع 5 مل من 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS) تليها حضانة مع 1 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA في 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 حتى يتم إنشاء تعليق خلية واحدة.
ملاحظة: يمكن أن يكون النشاط الخلايا NK الناجمة عن الخلايا السرطانية وشدد بسبب التغيرات في التعبير عن الخلايا NK تنشيط ligand في الخلايا السرطانية. لذلك ، يجب استخدام الخلايا السرطانية السليمة وشبه المتشنجة للحصول على نتائج دقيقة. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن مستقبلات الخلايا NK وligands يمكن أن تكون حساسة لالتربسينة26،27. لذلك، يجب تحسين بروتوكول التربسينة بعناية وتجنب التبّه المفرط. - بعد التبضع، أضف 10 مل من متوسط الثقافة SK-HEP-1 والطرد المركزي عند 160 × ز لمدة 3 دقيقة في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم 15 مل. غسل بيليه الخلية مع 5 مل من 1x PBS وإعادة تعليق في 5 مل من وسط الثقافة.
- وبالتوازي مع ذلك، فإن أجهزة الطرد المركزي لخلايا NK92MI عند 160 × ز لمدة 3 دقيقة في أنبوب طرد مركزي معقم يبلغ 15 مل. غسل بيليه الخلية مع 5 مل من 1x PBS وإعادة تعليق في 5 مل من NK92MI خلية ثقافة المتوسطة.
ملاحظة: تزرع خلايا NK92MI في NK خلية ثقافة المتوسطة والحصول عليها بالمثل كما هو موضح في الخطوة 2.1. - عد خلايا SK-HEP-1 و NK92MI باستخدام مقياس الهيوسيدومتر أو أي عداد خلية آلية متوفرة.
- إضافة خلايا SK-HEP-1 (الخلايا المستهدفة) (1 × 104/100 ميكرولتر/بئر) وخلايا NK92MI (خلايا التأثير) (1 × 105/100 ميكرولتر/بئر) بنسبة 1:10 الهدف:effector والبذور في الآبار ثلاثية في لوحة بئر 96.
- احتضان لوحة بئر 96 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في جو من الهواء بنسبة 95٪ و 5٪ CO2 لمدة 3 ساعة. بعد الحضانة، لوحة الطرد المركزي في 450 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- دون إزعاج بيليه الخلية، وجمع 100 ميكرولتر من supernatant من كل بئر ونقل إلى بئر في لوحة جيدة 96 جديدة.
- إضافة 50 ميكرولتر من الركيزة LDH، مزيج جيد، واحتضان لوحة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- وقف رد الفعل عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من محلول التوقف (50٪ ثنائي ميثيل فورماميد و 20٪ كبريتات دوريسيل الصوديوم في درجة الحموضة 4.7). قياس امتصاص على الفور من لوحة في 490 نانومتر و 680 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
- طرح امتصاص في 680 نانومتر من امتصاص في 490 نانومتر. حساب النسبة المئوية (%) NK السمية الخلوية الخلية باستخدام الصيغة أدناه.
حيث LDH التجريبية (المؤثرات + الخلايا المستهدفة) هو امتصاص خلايا NK92MI وخلايا SK-HEP-1 ، LDH الخلايا التأثيرية هو امتصاص خلايا NK92MI وحدها ، LDH عفوية هو امتصاص خلايا SK-HEP-1 وحدها ، LDH أقصى هو امتصاص SK-HEP-1 الخلايا مع المخزن المؤقت للانليس.
ملاحظة: للحد من تداخل المصل، استخدم دائمًا عناصر التحكم التالية: الخلايا المستهدفة وحدها (SK-HEP-1)، خلايا التأثير وحدها (NK92MI)، الخلايا المستهدفة مع المخزن المؤقت للانطول كتحكم كامل في الخلايا، وسط الخلية المستهدفة، وسيط NK92MI، بالإضافة إلى وسط الخلية المستهدفة و NK92MI المتوسطة في نسبة 1:1.
3. Calcein AM طريقة مجهرية تعتمد على تلطيخ لقياس NK خلية بوساطة السمية الخلوية
- الخلايا الثقافة SK-HEP-1 إلى 70-80٪ التقاء. توليد تعليق خلية واحدة عن طريق الغسيل أول خلايا مع 5 مل من 1x PBS تليها حضانة مع 1 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA.
- خلايا الطرد المركزي SK-HEP-1 في أنبوب طرد مركزي معقم 1 مل في 160 × ز لمدة 3 دقيقة. إعادة تعليق بيليه في 3 مل من DMEM خالية من المصل.
- أضف 1.5 ميكرولتر من محلول calcein AM (10 مم) إلى خلايا SK-HEP-1 واحتضانلمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي calcein AM المسماة SK-HEP-1 الخلايا في 160 × ز لمدة 3 دقيقة في أنبوب طرد مركزي معقم 15 مل.
- غسل الخلايا مرتين مع 5 مل من 1x PBS لإزالة الزائدة calcein AM صبغة.
- وبالتوازي مع ذلك، فإن خلايا الطرد المركزي NK92MI عند 160 × ز لمدة 3 دقيقة في أنبوب طرد مركزي معقم يبلغ 15 مل. غسل بيليه الخلية مرة واحدة مع 5 مل من 1x PBS وإعادة تعليق في 5 مل من NK92MI وسط الخلية.
- عد calcein AM المسمى SK-HEP-1 الخلايا وخلايا NK92MI باستخدام مقياس الهيموكيتومتر أو عداد الخلية الآلي.
- إعادة تعليق خلايا SK-HEP-1 في وسط الثقافة عند 1 × 105 خلايا/مل وخلايا NK92MI عند 1 × 106 خلايا/مل في وسط خلية NK.
- لوحة calcein AM المسمى SK-HEP-1 الخلايا (الخلايا المستهدفة) (1 × 104/100 μL/well) مع خلايا NK92MI (خلايا التأثير) (1 × 105/100 μL/well) (1:10 الهدف: نسبة التأثير) لكل بئر في آبار ثلاثية في لوحة بئر 96.
- احتضان لوحة بئر 96 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في جو من الهواء بنسبة 95٪ و 5٪ CO2 لمدة 4 ساعة. بعد الحضانة، التقط صور الفلورية للخلايا المسماة calcein AM باستخدام مجهر الفلورسينس عند التكبير 10x. التقاط ما لا يقل عن 10 حقول مختلفة من كل تكرار لكل حالة علاج.
- حدد عشوائيا 10 صور لكل تكرار وحساب calcein AM إيجابية المسمى الخلايا المستهدفة المحتضنة مع أو بدون خلايا NK92MI. حساب % السمية السيتومية باستخدام الصيغة أدناه.
ملاحظة: كعناصر تحكم، استخدم الخلايا المستهدفة بدون خلايا NK92MI والخلايا المستهدفة المندمجة بالكامل كتحكم كامل في الانهيل. للانضلاج الكامل، احتضان الخلايا في 0.5٪ تريتون X-100 ل1 ساعة (20 ميكرولتر من 5٪ تريتون X-100 في 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة).
4. NK خلية الهجرة الاسهاب
- تنمو خلايا NK92MI وخلايا الطرد المركزي في 160 × ز لمدة 3 دقيقة في أنبوب طرد مركزي معقم 15 مل.
- غسل بيليه الخلية مرتين مع 5 مل من 1x PBS وإعادة تعليق الخلايا في 3 مل من المصل خالية NK92MI خلية المتوسطة. الخلايا NK92MI العد باستخدام مقياس الهيموكيتومتر أو عداد الخلية الآلي.
- خلايا اللوحة NK92MI (2.5 × 105 خلايا / 100 ميكرولتر / بئر) في المقصورة العليا من غرفة نفاذية عبر ويل (إدراج قطرها 6.5 مم وحجم مسام 5 ميكرومتر).
- في الغرفة السفلية إضافة 0.6 مل من المواد المتوسطة الخالية من المصل التي تحتوي على المواد التي سيتم اختبارها لخصائص الكيموجاذب للخلايا NK (على سبيل المثال، متوسطة مكيفة، chemokines، السيتوكينات).
ملاحظة: عند إعداد متوسطة مشروطة، استخدم وسط المصل المنخفض دون إضافة مصل للقضاء على التداخل من بروتينات المصل في تحليل الهجرة. - احتضان الغرف الـ 24 القابلة للنفاذ بشكل جيد عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة. بعد 4 ح، وجمع خلايا NK92MI غير ملتصقة وهاجرت من الغرفة السفلية ونقلها إلى أنابيب فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) لمزيد من التحليل.
ملاحظة: قد يختلف وقت الثقافة وفقًا لنوع الخلايا المستهدفة، بالإضافة إلى كمية وحركية الكيموكينات التي تنتجها الخلايا المستهدفة. لذلك ، يجب تحديد هذا الوقت تجريبيًا لكل نوع من أنواع الخلايا ، وchemokine ، والتجربة. - إضافة عدد محدد مسبقا من الخرز العد للتدفق الخلوي في حجم 50 ميكرولتر إلى كل أنبوب يحتوي على خلايا NK المهاجرة. تقييم حجم تعليق الخلايا 300 ميكرولتر/بئر باستخدام أي مقياس تدفق للخلايا قادر على العد الآلي للخلايا المستندة إلى FACS.
ملاحظة: مزيج أو دوامة مزيج حبات العد لتدفق الخلايا بدقة في كل مرة قبل الاستخدام لضمان أن يتم استخدام عدد ثابت من الخرز لتقليل التباين التجريبي. ينصح عكس pipetting مع حبات العد للحفاظ على الدقة. استخدم خلايا NK فقط وأعداد الخرز لقياس التدفق الخلوي كعناصر تحكم تحليل FACS. يوصي المؤلفون بقراءة ما لا يقل عن 10000 حبة + خلايا NK مجتمعة ، وهو مبلغ عمل بشكل جيد. ومع ذلك، قد يختلف هذا العدد تبعاً للظروف التجريبية. لذلك ، يجب تحديد العدد المشترك من الخرز + خلايا NK تجريبيًا لكل نوع من التجارب. بالإضافة إلى ذلك، من المهم إجراء تجارب باستخدام ثلاثية الخلايا البيولوجية لتحقيق نتائج ذات دلالة إحصائية ولحساب التباين بين عدد الخلايا المختلفة. - حساب العدد المطلق لخلايا NK92MI التي تم ترحيلها باستخدام هذه الصيغة:
حيث A = عدد الخلايا، B = عدد الخرز، C = عدد الخرز المعين من الكثير (عدد حبات العد للقياس الخلوي التدفق/50 ميكرولتر؛ في هذا المثال 49،500)، وD = حجم العينة (μL).
ملاحظة: إذا تم استخدام 300 ميكرولتر من حجم العينة (الخلايا المهاجرة) لتحليل FACS مع 50 ميكرولتر من الخرز العد للحساب الخلوي التدفق، العدد المطلق للخلايا المهاجرة = 1700 خلية / 3300 حبة أحداث × 49500 حبة/300 ميكرولتر = 84.975 خلية / ميكرولتر. يجب تصحيح الحساب إذا تم تخفيف العينة أو إذا تم استخدام حجم مختلف من حبات عد FACS.
Representative Results
تم إجراء تحليل سمية خلايا NK وتحليل هجرة الخلايا NK باستخدام خط خلايا الورم الكبدي SK-HEP-1 كنظام نموذجي. لقياس سمية خلايا NK باستخدام تحليل LDH ، تم احتضان خلايا SK-HEP-1 التي تعبر إما عن شرنا غير محدد (NS) أو shRNA يستهدف تنشيط عامل النسخ 4(ATF4) مع خلايا NK92MI في لوحة جيدة 96 لمدة 3 ساعة(الشكل 1A). ATF4 وقد ثبت سابقا لتنظيم السمية الخلوية الخلية NK عن طريق تنظيم تنشيط ligand ULBP128. تم قياس نشاط LDH المرتبط بقتل الخلايا المستهدفة بوساطة الخلايا NK بشكل ملون، وتم حساب السمية الخلوية في المائة باستخدام الصيغة الموضحة في البروتوكول 1. ATF4 ضربة قاضية خفضت بشكل كبير NK خلية بوساطة السمية بالمقارنة مع خلايا NK التعبير عن NS shRNA(الشكل 1B-D). كما قمنا بقياس السمية الخلوية للخلايا NK باستخدام كالسين AM على أساس التصبغ. ولهذه الغاية، تم وضع علامة على خلايا SK-HEP-1 التي تعبر عن NS shRNA أو ATF4-التي تستهدف shRNAs مع calcein AM واحتضانها مع خلايا NK92MI في 96 لوحات جيدة لمدة 4 ساعة كما هو موضح في الشكل 2A. بعد الحضانة ، تم التقاط صور الخلايا الإيجابية calcein AM بواسطة المجهر الفلوري باستخدام فلتر FITC / GFP. لم يتم الكشف عن الخلايا التي قتلت هاوية الخلايا NK بواسطة هذا النهج لأنها لم تعد تحتفظ بصبغة calcein AM. كما هو مبين في الشكل 2B, C, يتم تقليل عدد خلايا Calcein AM إيجابية SK-HEP-1 بعد الثقافة المشتركة مع خلايا NK92MI مقارنة بخلايا SK-HEP-1 التي نمت بدون خلايا NK92MI. ومع ذلك ، كما هو متوقع ، ATF4 ضربة قاضية عن طريق shRNA خفض NK خلية بوساطة القتل من خلايا SK-HEP-1 ، لاحظمن قبل عدد أكبر من خلايا CALCEIN AM إيجابية(الشكل 2B ، C). ولذلك، أظهرت كل من المقالات المستندة إلى LDH وcalcein AM نتائج متسقة وأكدت أن ATF4 يقلل من السمية الخلوية للخلايا السرطانية بوساطة NK. وتكفي أي من هذه المقالات للفحص لتقييم السمية الخلوية التي تتوسط فيها الخلايا NK؛ ومع ذلك، نوصي باستخدام كلا الأسلوبين لزيادة كل من الصرامة والثقة في النتائج.
ونحن نقدم أيضا نتائج 24 جيدا NK خلية الهجرة الوزراء. تم إعادة تعليق خلايا NK92MI في وسط NK92MI الخالي من المصل في الغرفة العليا ، وأضيف الكيموكين ، سي سي عزر ، ليغاند 2 (CCL2) إلى الغرفة السفلية القابلة للنفاذة. تم تعيين ترحيل الخلايا NK كما هو موضح في القسم 3(الشكل 3A). تم تحديد عدد خلايا NK92MI المهاجرة عن طريق إضافة حبات العد لقياس التدفق الخلوي وتبعتها تحليل FACS. كما هو مبين في الشكل 3B-C، كانت هناك زيادة كبيرة في عدد خلايا NK92MI التي هاجرت نحو متوسطة تحتوي على CCL2 مقارنة بوسيط التحكم.
الشكل 1: قياس الألوان LDH النشاط المستندة إلى NK خلية بوساطة تحليل السمية. (أ)التخطيطي يصور الخطوات الرئيسية لمقياس الألوان LDH المستندة إلى النشاط NK تحليل السمية الخلوية الخلية. (B, C) تم تحليل التعبير ATF4 في خلايا SK-HEP-1 التي تعبر إما عن شرنا غير محدد (NS) أو shRNAs التي تستهدف ATF4 بواسطة RT-PCR الكمي والنشاف الغربي. (ب)يظهر مستوى ATF4 مرنا النسبي بعد التطبيع إلى مستوى ACTINB في خلايا SK-HEP-1 التي تعبر عن NS shRNA أو ATF4 shRNAs. (C)ATF4 ومستويات البروتين ACTINB في خلايا SK-HEP-1 التعبير عن NS shRNA أو ATF4 shRNAs. (D)تم تحليل سمية الخلية بوساطة NK في خلايا SK-HEP-1 التي تعبر إما عن NS shRNA أو ATF4 shRNAs بواسطة طريقة LDH. النسبة المئوية (في المائة) NK خلية بوساطة السمية الخلوية هو مبين. وترد البيانات على أنها متوسط ± SEM؛ ns، ليست كبيرة؛ **p < 0.01، ***p < 0.001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: Calcein AM طريقة مجهرية تعتمد على تلطيخ لقياس سمية الخلايا بوساطة NK. (أ)التخطيطي يصور الخطوات الرئيسية للكالسين AM طريقة مجهرية القائمة على تلطيخ لقياس سمية الخلية NK بوساطة. (B)تم تحليل سمية الخلية بوساطة NK في خلايا SK-HEP-1 التي تعبر إما عن NS shRNA أو ATF4 shRNAs باستخدام طريقة calcein AM. يتم عرض الصور التمثيلية. مقياس شريط = 200 ميكرون. (C)في المئة من خلايا كالسين AM الإيجابية للتجربة المقدمة في لوحة B. **p < 0.01. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل الهجرة الكمية للخلايا NK المستندة إلى FACS. (أ)التخطيطي الذي يصور الخطوات الرئيسية لأداة نقل الخلايا NK المستندة إلى FACS. (B, C) تم إجراء تحليل هجرة الخلايا NK بعد إضافة 50 نانوغرام من CCL2 إلى الغرفة السفلية من صفيحة البئر 24. (ب)يتم عرض وحدات ترحيل الخلايا NK التمثيلية للتحكم أو وسيط الثقافة المعالجة CCL2. (C)يتم تقديم بيانات ترحيل الخلايا NK (متوسط ± SEM) للتجربة الموضحة في اللوحة B. ***p < 0.001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يمكن استخدام طرق السمية الخلوية والهجرة الموصوفة هنا لتقييم سمية خلايا NK للخلايا السرطانية وآليات التهرب المناعي بوساطة الخلايا NK في الأورام الخبيثة ، وكذلك لتحديد العوامل العلاجية التي ستعزز نشاط / وظيفة خلايا NK. البروتوكولات هي بسيطة وحساسة، واستنساخها، والبدائل المفضلة لالكلاسيكية على أساس الإشعاع 51الكروم الإفراج عن النشرات. وقد تم تصميم البروتوكولات خصيصا لتكون قابلة للتكيف بسهولة للاستخدام في معظم المختبرات، مع قراءة مباشرة للألوان، مجهرية، أو المستندة إلى FACS التي يسهل تفسيرها، مما يسمح للباحثين للتوصل إلى استنتاجات موثوق بها. وكلها قابلة للتطوير للنهج القائمة على الفرز عالية الإنتاجية. على الرغم من أن البروتوكولات يتم تقديمها في سياق خط واحد لخلايا الورم الكبدي ، إلا أنه يمكن تكييفها بسهولة مع أنواع الخلايا السرطانية الأخرى و / أو الخلايا الأخرى المستهدفة غير السرطانية.
في حين أن جميع الأساليب المعروضة قوية وقابلة للتكرار ، يمكن أن يحدث الاختلاف بين التجارب مع دفعات مختلفة من الخلايا السرطانية وخلايا NK. ولضمان أن تدعم النتائج بدقة استنتاجات التجارب، يُستحسن تكرار التجربة مرتين على الأقل باستخدام ثلاثيات بيولوجية.
أحد قيود هذا الأسلوب هو أن معدل نمو خلايا NK92MI يمكن أن يكون بطيئاً. ولذلك، بالنسبة للتجارب التي أجريت على 50 عينة أو أكثر، ينبغي زراعة أعداد كافية من NK92MI مسبقاً لمنع التأخير. أيضاً، يجب تنفيذ كافة عناصر التحكم الموضحة في البروتوكولات لتجنب النتائج الزائفة وغير القابلة للتكرار. وثمة قيد آخر لفحص السمية الخلوية NK هو أن نسبة NK إلى الخلايا السرطانية، فضلا عن وقت الحضانة، يجب أن يكون الأمثل لكل خلية الهدف. على سبيل المثال، قمنا باختبار نسب مختلفة من الخلايا السرطانية إلى خلايا NK (1:5 و 1:10 و 1:20 و 1:40 و 1:80) لخطوط الخلايا السرطانية الكبدية، بالإضافة إلى أوقات حضانة متعددة (2 و3 و4 و5 و6 ساعة). بناء على نتائجنا لاحظنا النتائج الأكثر اتساقا مع 1:10 و 1:20 نسب الخلايا السرطانية إلى خلايا NK والحضانة لمدة 3 ساعة.
بالإضافة إلى ذلك ، سوف الخلايا السرطانية المستمدة من الأورام الصلبة نعلق وتنمو على سطح لوحة الثقافة ، في حين أن خلايا NK تنمو في تعليق. إذا كان وقت الحضانة أطول من 3 ساعات ، فمن المستحسن استخدام لوحات المرفقات عالية الكثافة 96 ، مما سيحسن الاتساق والاستنساخ بين التجارب واليكررات البيولوجية. ومن المهم أيضاً ملاحظة أن اختبارات السمية الخلوية الناجمة عن خلايا NK يمكن إجراؤها أيضاً باستخدام خلايا NK الأولية المعزولة عن الخلايا الأحادية النووية في الدم المحيطي (PBMCs). ومع ذلك، هناك العديد من القيود مع مثل هذه التجارب. أولاً، لا يمكن تحجيم هذه التجارب بسهولة كما هو الحال مع خلايا NK92MI. ثانياً، يمكن أن يكون الاختلاف من دفعة إلى دفعة من النشاط السام للخلايا السمية للخلايا NK المعزولة عن الشركات العسكرية والأمنية الخاصة مشكلة من حيث قابلية التكاثر وتفسير النتائج. وبالمثل، يتم وصف خطوط الخلايا NK الإنسان الأخرى في الأدب ويمكن استخدامها في هذه الأنواع من التجارب، بما في ذلك خلايا NKL29; ومع ذلك، على عكس خلايا NK-92MI، خلايا NKL هي IL-2 تعتمد وغير متوفرة تجارياً.
عند النظر في التجارب CALCEIN AM الموصوفة، من المهم أن نلاحظ أن calcein AM لا يزال في الهيئات المبرمج بعد وفاة الخلية30. ولذلك ، ينبغي أن يتم تنفيذ كمية من التلطيخ CALCEIN AM بعناية ، لأنها قد تؤدي إلى التقليل من تقدير سمية CYTotoxic.
على غرار سمية الخلية NK بوساطة، تعديل هجرة الخلايا NK بواسطة السيتوكينات وغيرها من الجيوفيافيانتس يلعب دورا هاما في تنظيم وظيفة الخلية NK. يوفر تحليل هجرة الخلايا NK الموصوفة هنا منصة بسيطة لتقييم هجرة الخلايا NK في سياق التحفيز مثل chemokine أو chemoattractant. ويمكن استخدام هذا الفحص لتقييم العوامل التي يمكن أن تعزز أو تتداخل مع الهجرة الخلايا NK - وبالتالي، تحديد القدرة والكبت من الهجرة الخلايا NK. ويمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة أيضاً في دراسة القدرة التنظيمية لهجرة الخلايا في ناغورني كاراباخ نتيجة للتغيرات الجينية/اللاجينية (الزيادة في التنظيم أو الخفض التنظيمي) أو الناشئة بسبب العلاج من المخدرات.
لقياس ترحيل الخلايا NK بدقة، هناك عدد قليل من الخطوات الهامة التي يجب اتباعها. بالنسبة لجميع التجارب باستخدام متوسطة مكيفة ، من المهم أن تستخدم متوسطة مكيفة مكافئة من كل من ظروف التحكم والعلاج للحصول على قياسات دقيقة. سيتم تنوع وقت الحضانة مع المنقاة الكيميائية النقية والمتوسطة المكيفة. وأخيراً، فإن تحليلات الهجرة العابرة راسخة وتعتبر طريقة ممتازة لتقييم هجرة الخلايا في ناغورني كاراباخ؛ ومع ذلك ، فإن الثقافات الأحادية المتجانسة المستخدمة في المقالات تفتقر إلى علم وظائف الأعضاء المعقد للأنسجة أو حتى الثقافات ثلاثية الأبعاد التي قد تحاكي البيئة الدقيقة للورم بدقة أكبر.
وهكذا ، على الرغم من وجود بعض القيود على الخلايا NK اختبارات السمية الخلويومق الهجرة NK المقدمة في هذه المقالة ، وهذه الاختبارات تنطبق على مجموعة واسعة من الدراسات المناعية ، وبالتالي توفير أساليب هامة وموثوق بها لتقييم الخلية NK وظيفة والعلاجات المناعية التحوير الخلية NK.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نحن نقدر بامتنان المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة: R01CA195077-01A1 (NW)، R01CA200919-01 (NW)، و 1R01 CA218008-01A1 (NW). كما نعترف بتمويل وزارة الدفاع W81XWH1910480 وW81XWH-18-1-0069 إلى NW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute counting beads | Thermo Fisher Scientific | C36950 | |
| Alpha-MEM | Sigma-Aldrich | M4256 | |
| Amicon ultra Centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Calcein AM dye | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050114 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 2530081 | |
| LDH cytotoxic assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
| NK92MI cells | ATCC | CRL-2408 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| SKHEP-1 Cells | ATCC | HTB-52 | |
| Transwell permeable chambers | Costar | 3241 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25200056 |
References
- Chiossone, L., Dumas, P. Y., Vienne, M., Vivier, E. Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer. Nature Reviews Immunology. 18 (11), 671-688 (2018).
- Borghaei, H., Smith, M. R., Campbell, K. S. Immunotherapy of cancer. European Journal of Pharmacology. 625 (1-3), 41-54 (2009).
- Kalbasi, A., Ribas, A. Tumour-intrinsic resistance to immune checkpoint blockade. Nature Reviews Immunology. , (2019).
- Zhang, Q., Cao, X. Epigenetic regulation of the innate immune response to infection. Nature Reviews Immunology. 19 (7), 417-432 (2019).
- Janeway, C. A. Jr The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunol Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Natoli, G., Ostuni, R. Adaptation and memory in immune responses. Nature Immunology. 20 (7), 783-792 (2019).
- Cooper, M. D., Alder, M. N. The evolution of adaptive immune systems. Cell. 124 (4), 815-822 (2006).
- Riera Romo, M., Perez-Martinez, D., Castillo Ferrer, C. Innate immunity in vertebrates: an overview. Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).
- Sonnenberg, G. F., Hepworth, M. R. Functional interactions between innate lymphoid cells and adaptive immunity. Nature Reviews Immunology. 19 (10), 599-613 (2019).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Shi, F. D., Ljunggren, H. G., La Cava, A., Van Kaer, L. Organ-specific features of natural killer cells. Nature Reviews Immunology. 11 (10), 658-671 (2011).
- Trapani, J. A., Davis, J., Sutton, V. R., Smyth, M. J. Proapoptotic functions of cytotoxic lymphocyte granule constituents in vitro and in vivo. Current Opinion in Immunology. 12 (3), 323-329 (2000).
- Krzewski, K., Strominger, J. L. The killer's kiss: the many functions of NK cell immunological synapses. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 597-605 (2008).
- Berke, G. The binding and lysis of target cells by cytotoxic lymphocytes: molecular and cellular aspects. Annual Review of Immunology. 12, 735-773 (1994).
- Abel, A. M., Yang, C., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Natural Killer Cells: Development, Maturation, and Clinical Utilization. Frontiers in Immunology. 9, 1869 (2018).
- Zamai, L., et al. Natural killer (NK) cell-mediated cytotoxicity: differential use of TRAIL and Fas ligand by immature and mature primary human NK cells. Journal of Experimental Medicine. 188 (12), 2375-2380 (1998).
- Marcus, A., et al. Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells. Advances in Immunology. 122, 91-128 (2014).
- Vesely, M. D., Kershaw, M. H., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. Natural innate and adaptive immunity to cancer. Annual Review of Immunology. 29, 235-271 (2011).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Bryceson, Y. T., et al. A prospective evaluation of degranulation assays in the rapid diagnosis of familial hemophagocytic syndromes. Blood. 119 (12), 2754-2763 (2012).
- Shabrish, S., Gupta, M., Madkaikar, M. A Modified NK Cell Degranulation Assay Applicable for Routine Evaluation of NK Cell Function. Journal of Immunology Research. 2016, 3769590 (2016).
- Pietra, G., et al. Melanoma cells inhibit natural killer cell function by modulating the expression of activating receptors and cytolytic activity. Cancer Research. 72 (6), 1407-1415 (2012).
- Fehniger, T. A., et al. Potential mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy. Journal of Clinical Investigation. 106 (1), 117-124 (2000).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Roder, J. C., et al. A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells. Nature. 284 (5756), 553-555 (1980).
- Byrd, A., Hoffmann, S. C., Jarahian, M., Momburg, F., Watzl, C. Expression analysis of the ligands for the Natural Killer cell receptors NKp30 and NKp44. PLoS One. 2 (12), e1339 (2007).
- Nitahara, A., et al. NKG2D ligation without T cell receptor engagement triggers both cytotoxicity and cytokine production in dendritic epidermal T cells. Journal of Investigative Dermatology. 126 (5), 1052-1058 (2006).
- Gowen, B. G., et al. A forward genetic screen reveals novel independent regulators of ULBP1, an activating ligand for natural killer cells. Elife. 4, e08474 (2015).
- Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
