Summary
Undandragande av naturliga mördare (NK) cellmedierad utrotning av cancerceller är viktigt för cancerinitiering och progression. Här presenterar vi två icke-radioaktivitetsbaserade protokoll för att utvärdera NK cellmedierad cytotoxicitet mot levertumörceller. Dessutom presenteras ett tredje protokoll för att analysera NK-cellmigrering.
Abstract
Naturliga killer (NK) celler är en delmängd av cytotoxiska lymfocyter befolkningen i det medfödda immunsystemet och delta som en första försvarslinje genom att rensa patogen-infekterade, maligna och stressade celler. NK-cellers förmåga att utrota cancerceller gör dem till ett viktigt verktyg i kampen mot cancer. Flera nya immunbaserade terapier är under utredning för cancerbehandling som är beroende av antingen på att förbättra NK-cellaktivitet eller öka cancercellernas känslighet för NK-cellmedierad utrotning. För att effektivt utveckla dessa terapeutiska metoder behövs dock också kostnadseffektiva in vitro-analyser för att övervaka NK-cellmedierad cytotoxicitet och migration. Här presenterar vi två in vitro-protokoll som tillförlitligt och reproducerbart kan övervaka effekten av NK-cells cytotoxicitet på cancerceller (eller andra målceller). Dessa protokoll är icke-radioaktivitet-baserade, enkla att ställa in, och kan skalas upp för hög genomströmning screening. Vi presenterar också ett flöde cytometri-baserade protokoll för att kvantitativt övervaka NK cell migration, som också kan skalas upp för hög genomströmning screening. Tillsammans kan dessa tre protokoll användas för att övervaka viktiga aspekter av NK cellaktivitet som är nödvändiga för cellernas förmåga att utrota dysfunktionella målceller.
Introduction
Människokroppens förmåga att identifiera icke-själv och utrota främmande föremål är nyckeln till människans överlevnad mot patogener och maligniteter1. Den mänskliga immunsvar spelar den viktigaste rollen i denna process2,3,4. Baserat på viktiga egenskaper och funktioner, kan det mänskliga immunsystemet i stort sett klassificeras i två stora funktionella grupper: adaptivt immunförsvar och det medfödda immunsystemet. Det adaptiva immunsystemet är vanligtvis specifikt för en viss patogen och har immunologiskt minne och därmed är långvarig och lyhörd för framtida återinfektion av samma patogen5,6,7,8,9. Medfödd immunitet är däremot mycket bredare i sin målutrotning och relativt ospecifik. Därför, typiskt, den medfödda immunsvar fungerar som den första raden av immunologiskt försvar10. Naturliga killer (NK) celler tillhör det medfödda immunsystemet och representerar 10−15% av den totala cirkulerande lymfocyter11. NK-celler utrotar målceller via två viktiga mekanismer. Först, vid bindning för att rikta celler som uttrycker aktivera nde ligands, NK celler släppa membran-störande protein perforin och serin proteas granzymes genom exocytosis, som gemensamt inducerar apoptos i målceller12,13,14,15. Dessutom, NK celler uttrycker FasL och tumör nekros faktor-relaterade apoptos-inducerande ligand (TRAIL) interagera med målceller uttrycker död receptorer (Fas /CD95), vilket leder till caspase-beroende apoptos16. Viktigast av allt, NK celler kräver inte prestimulation, såsom antigen presentation, för att utrota patogen-infekterade eller maligna celler; Således är de oftast i en ready-to-kill stat17,18. För att hämma tumörutveckling och progression och utrota cancerceller måste NK-celler migrera till tumörplatsen och, en gång i tumörmikromiljön, identifiera och attackera målcellerna.
Tidigare övervakades NK-cellseffektorfunktionerna huvudsakligen av degranulation och cytotoxicitetsanalyser19,20,21. NK cell cytotoxicitet kan också mätas med 51krom release analys22,23,24,25. Denna analys har dock vissa specifika krav, bland annat behovet av en gammadisk, och är radioaktivitetsbaserad, som kräver utbildning i hantering och bortskaffande av radioaktiva material och utgör en risknivå för användaren. Därför har flera nya icke-radioaktivitetsbaserade analyser utvecklats och använts för att studera NK-cellaktivitet.
Här beskriver vi två sådana protokoll, kolorimetrisk mjölkväteas (LDH) mätbaserad NK cellmedierad cytotoxicitetsanalys och calcein acetoxymethyl (AM) färgningsbaserad mikroskopisk metod för att mäta NK cellmedierad cancercellutrotning. Dessa analyser kräver inte användning av radioisotoper, är enkla, känsliga och reproducerbart identifiera faktorer som modulerar NK-cellfunktion. Dessutom, eftersom NK-cellfunktionen inte kan utvärderas helt utan att övervaka förändringar i NK-cellmigreringen, presenterar vi också en flödescytometribaserad kvantitativ metod för att övervaka NK-cellmigrering.
Protocol
1. Beredning av odlingsmedium för NK-celler och levertumörceller
- Använd mänskliga naturliga mördarceller (t.ex. NK92MI) och humanlevercancercellinje (t.ex. SK-HEP-1).
- Förbered NK cellodlingsmedium för NK92MI mänskliga NK-celler genom att lägga till följande komponenter till 500 ml minst essentiella medium Eagle alpha utan ribonucleosider och deoxyribonucleosides till de angivna slutliga koncentrationerna: 0,02 mM folsyra (100 μL av 100 mM folsyra), 0,2 mM myoinositol (500 μL av 200 mM myoinositol (500 μL av 200 mM myoinositol (500 μL av 200 mM myo 0,1 mM β-mercaptoetanol (3,5 μL av 14,3 M β-mercaptoetanol), 2 mM L-glutamin (5 ml 200 mM L-glutamin), 1% penicillin/streptomycin (5 ml 100x penicillin/streptomycin), 12,5% fetalt nötkreatur serum (FBS) och 12,5% hästserum. Blanda och filtrera sterilisera med en steril filtreringsenhet på 0,22 μm och förvara vid 4 °C.
- Förbered kulturmedium för levertumörcellinje SK-HEP-1 genom att lägga till 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin till högglukos Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) som innehåller 2 mM L-glutamin.
2. Kolorimetrisk adtraliska LDH Mätbaserade NK Cell-medierad Cytotoxicitet Analys
- Odla SK-HEP-1 celler till 70−80% confluency i en 100 mm cellkultur Petri skålen i 5% CO2 vid 37 ° C i en CO2 inkubator. Generera en encellig suspension av första tvättceller med 5 ml 1x fosfat-buffrad koksaltlösning (PBS) följt av inkubationstid med 1 ml 0,25% trypsin-EDTA i 5% CO2 vid 37 °C i en CO 2-inkubator tills en enda cellsuspension genereras.
OBS: NK cellaktivitet kan induceras av stressade cancerceller på grund av förändringar i uttryck för NK cell-aktiverande ligand i cancerceller. Därför bör friska och sub-confluent cancerceller användas för korrekta resultat. Det är också viktigt att notera att NK cellreceptorer och ligands kan vara känsliga för trypsinization26,27. Därför bör trypsinization protokollet optimeras noggrant och överdriven trypsinization bör undvikas. - Efter trypsinization, tillsätt 10 ml SK-HEP-1 kulturmedium och centrifugera vid 160 x g i 3 min i ett 15 ml sterilt koniskt centrifugrör. Tvätta cellpelleten med 5 ml 1x PBS och resuspend i 5 ml kulturmedium.
- Parallellt centrifugerar NK92MI-cellerna vid 160 x g i 3 min i ett sterilt centrifugrör på 15 ml. Tvätta cellpelleten med 5 ml 1x PBS och resuspend i 5 ml NK92MI cellodlingsmedium.
OBS: NK92MI celler odlas i NK cell odling medium och erhålls på samma sätt som beskrivs i steg 2.1. - Räkna SK-HEP-1- och NK92MI-cellerna med hjälp av en hemocytometer eller någon tillgänglig automatiserad cellräknare.
- Lägg till SK-HEP-1-celler (målceller) (1 x 104/100 μL/well) och NK92MI-celler (effektorceller) (1 x 105/100 μL/brunn) i förhållandet 1:10 mål:effektor och utsäde i triplikabrunnar i en 96 brunnsplatta.
- Inkubera 96 brunnsplattan vid 37 °C i en atmosfär av 95% luft och 5% CO2 för 3 h. Efter inkubation, centrifugplatta vid 450 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Utan att störa cellpelleten, samla in 100 μl supernatant från varje brunn och överför till en brunn i en ny 96 brunnsplatta.
- Tillsätt 50 μl LDH substrat, blanda väl och inkubera plattan i 20 min vid rumstemperatur i mörkret.
- Stoppa reaktionen genom att lägga till 50 μl stopplösning (50% dimetylformamid och 20% natrium dodecylsulfat vid pH 4,7). Mät omedelbart plattans absorbans vid 490 nm och 680 nm med hjälp av en plattläsare.
- Subtrahera absorbansen vid 680 nm från absorbansen vid 490 nm. Beräkna procenten (%) NK cell cytotoxicitet med hjälp av formeln nedan.
Där LDH experimentella (effektor + målceller) är absorbansen av NK92MI-celler och SK-HEP-1 celler, LDH-effektorceller är absorbansen av NK92MI celler ensam, LDH spontan är absorbans en SK-HEP-1 celler ensam, och LDH maximal är absorbans av SK-HEP-1 celler med lysbuffert.
OBS: För att minska serumstörningar, använd alltid följande kontroller: enbart målceller (SK-HEP-1), enbart effektellerceller (NK92MI), målceller med lysisbuffert som en komplett lysiskontroll, målcellmedium, NK92MI-medium samt målcellmedium och målcellmedium och målcellmedium och målcellmedium och målcellmedium och målcellsmedium och NK92MI medium i en 1:1 förhållande.
3. Calcein AM Färgningsbaserad mikroskopisk metod för mätning nk cellmedierad cytotoxicitet
- Kultur SK-HEP-1 celler till 70−80% confluency. Generera en encellig fjädring av första tvättceller med 5 ml 1x PBS följt av inkubationstid med 1 ml 0,25% trypsin-EDTA.
- Centrifuge SK-HEP-1 celler i ett 1 ml sterilt centrifugrör vid 160 x g i 3 min. Resuspend pelleten i 3 ml serumfri DMEM.
- Tillsätt 1,5 μl calcein AM-lösning (10 mM) till SK-HEP-1 celler och inkubera i 30 min i rumstemperatur. Centrifugkalcein AM-märkta SK-HEP-1 celler vid 160 x g för 3 min i en 15 ml steril centrifugrör.
- Tvätta celler två gånger med 5 ml 1x PBS för att ta bort överskott kalcinerad AM färgämne.
- Parallellt centrifugerar DU NK92MI-celler vid 160 x g i 3 min i ett sterilt centrifugrör på 15 ml. Tvätta cellpelleten en gång med 5 ml 1x PBS och resuspend i 5 ml NK92MI-cellmedium.
- Räkna calcein AM-märkta SK-HEP-1 celler och NK92MI celler med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cell räknare.
- Resuspend SK-HEP-1 celler i odlingsmedium vid 1 x 105 celler/ml och NK92MI celler på 1 x 106 celler/ml i NK cellmedium.
- Plattakalcein AM-märkta SK-HEP-1 celler (målceller) (1 x 104/100 μL/well) med NK92MI-celler (effektorceller) (1 x 105/100 μL/well) (1:10 mål:effektorförhållande) per brunn i triplilikabrunnar i en 96 brunnsplatta.
- Inkubera 96 brunnsplattan vid 37 °C i en atmosfär av 95% luft och 5% CO2 för 4 h. Efter inkubation, fånga fluorescens bilder av calcein AM-märkta celler med hjälp av en fluorescens mikroskop vid 10x förstoring. Fånga minst 10 olika fält av varje replikat för varje behandlingstillstånd.
- Välj slumpmässigt 10 bilder för varje replikat och räkna calcein AM-positiva märkta målceller inkuberas med eller utan NK92MI-celler. Beräkna % cytotoxicitet med formeln nedan.
OBS: Använd målceller utan NK92MI-celler och helt lysed målceller som fullständig lyskontroll. För fullständig lys, inkubera cellerna i 0,5% Triton X-100 för 1 h (20 μL av 5% Triton X-100 i 200 μL av kulturmedia).
4. NK Cell Migration Analys
- Odla NK92MI-celler och centrifugceller vid 160 x g i 3 min i ett sterilt centrifugrör på 15 ml.
- Tvätta cellpelleten två gånger med 5 ml 1x PBS och resuspend cellerna i 3 ml serumfritt NK92MI-cellmedium. Räkna NK92MI-celler med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare.
- Platta NK92MI-celler (2,5 x 105 celler/100 μL/brunn) i det övre facket av transwell permeable kammare (6,5 mm diameter insats och 5 μm por storlek).
- I bottenkammaren tillsätt0,6 ml serumfritt medium som innehåller material som ska testas för NK cellcellchemoattractant egenskaper (t.ex. konditionerat medium, kemokineser, cytokiner).
OBS: När du förbereder konditionerat medium, använd reducerat serummedium utan tillsats av serum för att eliminera störningar från serumproteiner i migreringsanalysen. - Inkubera de 24 brunnspermebara kamrarna vid 37 °C för 4 h. Efter 4 h, samla in icke-anhängare och migrerade NK92MI-celler från bottenkammaren och överföra dem till fluorescens-aktiverade cellsortering (FACS) rör för vidare analys.
OBS: Tiden för kulturen kan variera beroende på vilken typ av målceller, liksom mängden och kinetik av cellgifter som produceras av målcellerna. Därför bör denna gång empiriskt bestämmas för varje celltyp, chemokine och experiment. - Lägg till förutbestämda antal räknapärlor för flödecytometri i en volym av 50 μL till varje rör som innehåller migrerade NK-celler. Utvärdera volymen på 300 μL/brunncellsuspension med hjälp av eventuell flödescytometer som kan automatiserad FACS-baserad cellräkning.
OBS: Blanda eller virvel-blanda räkna pärlor för flöde cytometri noggrant varje gång före användning för att säkerställa att ett konstant antal pärlor används för att minimera experimentell variation. Omvänd pipettning rekommenderas med räknepärlor för att bibehålla noggrannheten. Använd endast NK-celler och räkna pärlor för flödescytometri som FACS-analyskontroller. Författarna rekommenderar att läsa minst 10.000 pärlor + NK celler tillsammans, en mängd som har fungerat bra. Detta antal kan dock variera beroende på försöksförhållandena. Därför bör det sammanlagda antalet pärlor + NK-celler empiriskt fastställas för varje typ av experiment. Dessutom är det viktigt att utföra experiment med biologiska triplicates för att uppnå statistiskt signifikanta resultat och att redogöra för variationer mellan olika cellantal. - Beräkna absolut antal migrerade NK92MI-celler med den här formeln:
där A = antal celler, B = antal pärlor, C = tilldelade pärlantal av partiet (antal räkna pärlor för flödecytometri/50 μL; i detta exempel 49.500) och D = volymen av provet (μL).
OBS: Om 300 μl provvolym (migrerade celler) används för FACS-analys med 50 μl räkna pärlor för flödecytometri, det absoluta antalet migrerade celler = 1 700 celler /3 300 pärlstavhändelser x 49 500 pärlor/300 μL = 84.975 celler/μL. Beräkningen bör korrigeras om provet späds ut eller om en annan volym FACS-inventeringspärlor används.
Representative Results
NK cell cytotoxicitet analyser och NK cell migration analys utfördes med hjälp av SK-HEP-1 lever tumör cellinje som ett modellsystem. För att mäta NK-cellcytotoxicitet med ldh-analysen inkuberas SK-HEP-1-celler som antingen uttrycker en icke-specifik (NS) shRNA eller shRNA-inriktning på att aktivera transkriptionsfaktor 4 (ATF4) med NK92MI-celler i en 96 brunnsplatta för 3 h(figur 1A). ATF4 har tidigare visat sig reglera NK-cellcytotoxicitet genom att uppreglera den aktiverande liganden ULBP128. LDH aktivitet i samband med NK cell-medierad målcell dödande mätts kolorimetriskt, och procent cytotoxicitet beräknas med hjälp av formeln som beskrivs i protokoll 1. ATF4 knockdown avsevärt minskat NK cell-medierad cytotoxicitet jämfört med NK celler uttrycker NS shRNA(Figur 1B-D). Vi mätte också NK cell cytotoxicitet med hjälp av en calcein AM färgning-baserad analys. För detta ändamål var SK-HEP-1 celler som uttrycker NS shRNA eller ATF4-inriktningshRNAs märktmed calcein AM och ruvade med NK92MI celler i 96 brunn plattor för 4 h som illustreras i figur 2A. Efter inkubation fångades bilder av calcein AM-positiva celler av fluorescensmikroskopi med hjälp av ett FITC/GFP-filter. Celler som dödas av NK-celler upptäcks inte av detta tillvägagångssätt eftersom de inte längre behåller calcein AM färgämne. Som visas i figur 2B,Cminskar antalet calcein AM-positiva SK-HEP-1 celler efter samodling med NK92MI-celler jämfört med SK-HEP-1 celler som odlas utan NK92MI-celler. Som väntat minskade ATF4-knockdown via shRNA NK cellmedierad dödande av SK-HEP-1 celler, observerad av ett större antal calcein AM-positiva celler(figur 2B,C). Därför visade både LDH-baserade och calcein AM analyser konsekventresultat och bekräftade att ATF4 knockdown minskar NK-medierad cancercell cytotoxicitet. Någon av dessa analyser är tillräcklig för att bedöma NK cellmedierad cytotoxicitet; Vi rekommenderar dock att du använder båda metoderna för att öka både stringensoch förtroendet för resultaten.
Vi presenterar också resultaten av en 24 väl NK cell migration analys. NK92MI-celler återsuspenderades i serumfritt NK92MI-medium i den övre kammaren, och chemokine, CC-motiv, ligand 2 (CCL2) lades till i den lägre permeable kammaren. NK-cellmigrering analyserades enligt beskrivningen i avsnitt 3 (figur 3A). Antalet migrerade NK92MI-celler kvantifierades genom att räkna pärlor för flödescytometri och följt av FACS-analys. Som framgår av figur 3B-C,det fanns en betydande ökning av antalet NK92MI celler som hade migrerat mot CCL2-innehållande medium jämfört med kontroll medium.
Bild 1: Kolorimetrisk adtraliska LDH aktivitetsbaserade NK cellmedierad cytotoxicitetanalys. (A)Schematisk som skildrar de viktigaste stegen i kolorimetriska LDH aktivitetsbaserade NK cell cytotoxicitet analys. (B,C) ATF4 uttryck analyserades i SK-HEP-1 celler uttrycker antingen ospecificerad (NS) shRNA eller shRNAs inriktning ATF4 av kvantitativa RT-PCR och västra blotting. (B)Relativ ATF4 mRNA-nivå visas efter normalisering till ACTINB-nivå i SK-HEP-1-celler som uttrycker NS shRNA eller ATF4 shRNAs. (C)ATF4- och ACTINB-proteinnivåer i SK-HEP-1-celler som uttrycker NS shRNA eller ATF4 shRNAs. (D)NK cellmedierad cytotoxicitet analyserades i SK-HEP-1 celler som uttrycker antingen NS shRNA eller ATF4 shRNAs av LDH-metoden. Procent (%) NK cellmedierad cytotoxicitet visas. Uppgifterna presenteras som medelvärde ± SEM. ns, inte betydande; **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Calcein AM färgningsbaserad mikroskopisk metod för mätning av NK-cellmedierad cytotoxicitet. (A)Schematisk som skildrar de viktigaste stegen i calcein AM färgning-baserade mikroskopisk metod för att mäta NK cellmedierad cytotoxicitet. (B)NK cellmedierad cytotoxicitet analyserades i SK-HEP-1 celler som uttrycker antingen NS shRNA eller ATF4 shRNAs med calcein AM-metoden. Representativa bilder visas. Skalstång = 200 μm. (C)Procent av calcein AM-positiva celler för experimentet presenteras i panel B. ** p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: FACS-baserade kvantitativa NK-cellmigreringsanalys. (A)Schematisk som visar de viktigaste stegen i FACS-baserade NK cell migration analys. (B,C) NK cell migration analys genomfördes efter att ha lagt till 50 ng av CCL2 till den nedre kammaren i 24 väl plattan. (B)Representativa NK-cellmigreringspunkter för kontroll eller CCL2-behandlat odlingsmedium visas. (C)NK-cellmigreringsdata (medelvärde ± SEM) presenteras för det experiment som visas i panel B. ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
De cytotoxicitets- och migreringsmetoder som beskrivs här kan användas för att utvärdera NK-cellcytotoxicitet till cancerceller och NK-cellmedierade mekanismer för immunundandragande i maligna tumörer, samt för att identifiera terapeutiska medel som kommer att förbättra NK-cellaktivitet/funktion. Protokollen är enkla, känsliga, reproducerbara och föredragna alternativ till klassisk radioaktivitetbaserad 51krom release analys. Protokollen har utformats speciellt för att vara lätt anpassningsbara för användning i de flesta laboratorier, med enkel kolorimetrisk, mikroskopisk eller FACS-baserade avläsningar som är lätta att tolka, så att forskare kan nå tillförlitliga slutsatser. Alla är skalbara för screeningbaserade metoder med hög genomströmning. Även om protokollen presenteras i samband med en enda levertumörcellinje, kan de enkelt anpassas enkelt till andra cancercelltyper och/eller andra målceller som inte är cancer.
Medan alla metoder som presenteras är robusta och reproducerbara, kan interexperimentell variation uppstå med olika partier av cancerceller och NK-celler. För att säkerställa att resultaten korrekt stöder slutsatserna av experimenten är det lämpligt att upprepa experimentet minst två gånger med hjälp av biologiska triplicates.
En begränsning av denna metod är att tillväxten av NK92MI celler kan vara långsam. För experiment med 50 eller fler prover bör därför tillräckligt många NK92MI odlas i förväg för att förhindra förseningar. Dessutom måste alla kontroller som beskrivs i protokollen genomföras för att undvika falska och icke reproducerbara resultat. En annan begränsning av NK cytotoxicitet analys är att NK till cancer cellförhållandet, liksom inkubationstiden, måste optimeras för varje målcell. Till exempel har vi testat olika förhållanden i cancerceller till NK-celler (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 och 1:80) för levercancer cellinjer, samt flera inkubationstider (2, 3, 4, 5 och 6 h). Baserat på våra resultat observerade vi mest konsekventa resultat med 1:10 och 1:20 nyckeltal av cancerceller till NK-celler och inkubationsinför 3 h.
Dessutom kommer cancerceller som härrör från fasta tumörer att fästa och växa på ytan av odlingsplattan, medan NK-celler växer i suspension. Om inkubationstiden är längre än 3 h, är det lämpligt att använda ultralow fastsättning 96 brunnplattor, vilket kommer att förbättra konsistensoch reproducerbarhet mellan experiment och biologiska replikat. Det är också viktigt att notera att NK cell-inducerad cytotoxicitet analyser kan också utföras med hjälp av primära NK-celler isolerade från perifera blod mononukleära celler (PBMC). Det finns dock flera begränsningar med sådana experiment. För det första kan dessa experiment inte lika lätt skalas som med NK92MI-celler. För det andra kan batch-to-batch-variation av cytoxisk aktivitet hos NK-celler som isolerats från PMBC vara problematisknär det gäller reproducerbarhet och tolkning av resultaten. På samma sätt beskrivs andra mänskliga NK-cellinjer i litteraturen och kan användas i dessa typer av experiment, inklusive NKL-celler29; Men till skillnad från NK-92MI celler, NKL celler är IL-2 beroende och inte kommersiellt tillgängliga.
När man överväger calcein AM experiment beskrivs, är det viktigt att notera att calcein AM kvar i apoptotiska organ efter celldöd30. Därför bör mängden kalcinerad avkalkning av kalcinerad AM utföras noggrant, eftersom det kan leda till en underskattning av NK cytotoxicitet.
I likhet med NK cellmedierad cytotoxicitet spelar modulering av NK-cellmigration genom cytokiner och andra kemoattractanter en viktig roll i regleringen av NK-cellfunktion. NK cell migration analys som beskrivs här ger en enkel plattform för att utvärdera NK cellmigration i samband med en stimulans såsom en chemokine eller chemoattractant. Denna analys kan användas för att utvärdera agenter som antingen kan främja eller störa NK cellmigration - vilket identifierar förstärkare och förtryckare av NK cellmigration. Denna metod kan också vara användbar för att studera NK-cellens regleringskapacitet till följd av en genetisk/epigenetisk förändring (uppreglering eller nedreglering) eller som uppstår på grund av läkemedelsbehandling.
För att exakt mäta NK-cellmigrering finns det få kritiska steg som bör följas. För alla experiment med konditionerat medium är det viktigt att likvärdigt konditionerat medium används från både kontroll- och behandlingsförhållanden för att få korrekta mätningar. Tiden för inkubation kommer att varieras med renade kemoattractanter och konditionerade medium. Slutligen är transwell migreringsanalyser väl etablerade och anses vara en utmärkt metod för att bedöma NK-cellmigrering. men de homogena monokulturer som används i analyserna saknar den komplexa fysiologi vävnader eller till och med 3D kulturer som mer exakt kan efterlikna tumör mikromiljön.
Även om det finns vissa begränsningar för nk-cellencytotoxicitetsanalyser och NK-migreringsanalys som presenteras i denna artikel, är dessa analyser således tillämpliga på ett brett spektrum av immunologiska studier och ger därmed viktiga och tillförlitliga metoder för att bedöma NK-cellen funktion och NK-cellmodulerande immunterapier.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt bidrag från National Institutes of Health: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) och 1R01 CA218008-01A1 (NW). Vi erkänner också Försvarsdepartementet finansiering W81XWH1910480 och W81XWH-18-1-0069 till NW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute counting beads | Thermo Fisher Scientific | C36950 | |
| Alpha-MEM | Sigma-Aldrich | M4256 | |
| Amicon ultra Centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Calcein AM dye | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050114 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 2530081 | |
| LDH cytotoxic assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
| NK92MI cells | ATCC | CRL-2408 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| SKHEP-1 Cells | ATCC | HTB-52 | |
| Transwell permeable chambers | Costar | 3241 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25200056 |
References
- Chiossone, L., Dumas, P. Y., Vienne, M., Vivier, E. Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer. Nature Reviews Immunology. 18 (11), 671-688 (2018).
- Borghaei, H., Smith, M. R., Campbell, K. S. Immunotherapy of cancer. European Journal of Pharmacology. 625 (1-3), 41-54 (2009).
- Kalbasi, A., Ribas, A. Tumour-intrinsic resistance to immune checkpoint blockade. Nature Reviews Immunology. , (2019).
- Zhang, Q., Cao, X. Epigenetic regulation of the innate immune response to infection. Nature Reviews Immunology. 19 (7), 417-432 (2019).
- Janeway, C. A. Jr The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunol Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Natoli, G., Ostuni, R. Adaptation and memory in immune responses. Nature Immunology. 20 (7), 783-792 (2019).
- Cooper, M. D., Alder, M. N. The evolution of adaptive immune systems. Cell. 124 (4), 815-822 (2006).
- Riera Romo, M., Perez-Martinez, D., Castillo Ferrer, C. Innate immunity in vertebrates: an overview. Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).
- Sonnenberg, G. F., Hepworth, M. R. Functional interactions between innate lymphoid cells and adaptive immunity. Nature Reviews Immunology. 19 (10), 599-613 (2019).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Shi, F. D., Ljunggren, H. G., La Cava, A., Van Kaer, L. Organ-specific features of natural killer cells. Nature Reviews Immunology. 11 (10), 658-671 (2011).
- Trapani, J. A., Davis, J., Sutton, V. R., Smyth, M. J. Proapoptotic functions of cytotoxic lymphocyte granule constituents in vitro and in vivo. Current Opinion in Immunology. 12 (3), 323-329 (2000).
- Krzewski, K., Strominger, J. L. The killer's kiss: the many functions of NK cell immunological synapses. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 597-605 (2008).
- Berke, G. The binding and lysis of target cells by cytotoxic lymphocytes: molecular and cellular aspects. Annual Review of Immunology. 12, 735-773 (1994).
- Abel, A. M., Yang, C., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Natural Killer Cells: Development, Maturation, and Clinical Utilization. Frontiers in Immunology. 9, 1869 (2018).
- Zamai, L., et al. Natural killer (NK) cell-mediated cytotoxicity: differential use of TRAIL and Fas ligand by immature and mature primary human NK cells. Journal of Experimental Medicine. 188 (12), 2375-2380 (1998).
- Marcus, A., et al. Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells. Advances in Immunology. 122, 91-128 (2014).
- Vesely, M. D., Kershaw, M. H., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. Natural innate and adaptive immunity to cancer. Annual Review of Immunology. 29, 235-271 (2011).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Bryceson, Y. T., et al. A prospective evaluation of degranulation assays in the rapid diagnosis of familial hemophagocytic syndromes. Blood. 119 (12), 2754-2763 (2012).
- Shabrish, S., Gupta, M., Madkaikar, M. A Modified NK Cell Degranulation Assay Applicable for Routine Evaluation of NK Cell Function. Journal of Immunology Research. 2016, 3769590 (2016).
- Pietra, G., et al. Melanoma cells inhibit natural killer cell function by modulating the expression of activating receptors and cytolytic activity. Cancer Research. 72 (6), 1407-1415 (2012).
- Fehniger, T. A., et al. Potential mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy. Journal of Clinical Investigation. 106 (1), 117-124 (2000).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Roder, J. C., et al. A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells. Nature. 284 (5756), 553-555 (1980).
- Byrd, A., Hoffmann, S. C., Jarahian, M., Momburg, F., Watzl, C. Expression analysis of the ligands for the Natural Killer cell receptors NKp30 and NKp44. PLoS One. 2 (12), e1339 (2007).
- Nitahara, A., et al. NKG2D ligation without T cell receptor engagement triggers both cytotoxicity and cytokine production in dendritic epidermal T cells. Journal of Investigative Dermatology. 126 (5), 1052-1058 (2006).
- Gowen, B. G., et al. A forward genetic screen reveals novel independent regulators of ULBP1, an activating ligand for natural killer cells. Elife. 4, e08474 (2015).
- Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
