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Medicine

हेपेटिक ट्यूमर कोशिकाओं के संदर्भ में प्राकृतिक हत्यारा सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी और माइग्रेशन का मापन

Published: February 22, 2020 doi: 10.3791/60714
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Alabama at Birmingham

Summary

कैंसर कोशिकाओं द्वारा प्राकृतिक हत्यारा (एनके) सेल मध्यस्थता उन्मूलन की चोरी कैंसर दीक्षा और प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम हेपेटिक ट्यूमर कोशिकाओं की ओर एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकेशन का मूल्यांकन करने के लिए दो गैर-रेडियोधर्मिता-आधारित प्रोटोकॉल पेश करते हैं। इसके अतिरिक्त, एनके सेल माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए एक तीसरा प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है।

Abstract

प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाएं सहज प्रतिरक्षा प्रणाली की साइटोटॉक्सिक लिम्फोसाइट आबादी का सबसेट हैं और रोगजनक-संक्रमित, घातक और तनावग्रस्त कोशिकाओं को साफ करके रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में भाग लेते हैं। कैंसर कोशिकाओं को समाप्त करने के लिए एनके कोशिकाओं की क्षमता उन्हें कैंसर के खिलाफ लड़ाई में एक महत्वपूर्ण उपकरण बनाती है। कई नए प्रतिरक्षा आधारित चिकित्सा कैंसर के इलाज के लिए जांच के अधीन है जो या तो एनके सेल गतिविधि को बढ़ाने या एनके सेल के लिए कैंसर की कोशिकाओं की संवेदनशीलता में वृद्धि पर भरोसा-मध्यस्थता उन्मूलन । हालांकि, इन चिकित्सीय दृष्टिकोणों को प्रभावी ढंग से विकसित करने के लिए, एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिबिलिटी और माइग्रेशन की निगरानी के लिए इन विट्रो परखों में लागत प्रभावी की भी जरूरत है । यहां, हम दो इन विट्रो प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो कैंसर कोशिकाओं (या अन्य लक्षित कोशिकाओं) पर एनके-सेल साइटोटॉक्सिकिटी के प्रभाव की मज़बूती और पुन: उत्पन्न कर सकते हैं। ये प्रोटोकॉल गैर-रेडियोधर्मिता आधारित हैं, स्थापित करने के लिए सरल हैं, और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए बढ़ाया जा सकता है। हम एनके सेल माइग्रेशन की मात्रात्मक निगरानी करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित प्रोटोकॉल भी पेश करते हैं, जिसे उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए भी बढ़ाया जा सकता है। सामूहिक रूप से, इन तीन प्रोटोकॉल का उपयोग एनके सेल गतिविधि के प्रमुख पहलुओं की निगरानी के लिए किया जा सकता है जो बेकार लक्ष्य कोशिकाओं को समाप्त करने की कोशिकाओं की क्षमता के लिए आवश्यक हैं।

Introduction

मानव शरीर की गैर-आत्म की पहचान करने और विदेशी वस्तुओं को समाप्त करने की क्षमता रोगजनकों और घातक1के खिलाफ मानव अस्तित्व की कुंजी है । मानव प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया इस प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है2,3,4. प्रमुख विशेषताओं और कार्यों के आधार पर, मानव प्रतिरक्षा प्रणाली को मोटे तौर पर दो प्रमुख कार्यात्मक समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है: अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली। अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली आमतौर पर किसी दिए गए रोगजनक के लिए विशिष्ट होती है और इसमें इम्यूनोलॉजिकल मेमोरी होती है और इस प्रकार, एक ही रोगजनक5,6,7,8,9द्वारा भविष्य के पुनः संक्रमण के लिए लंबे समय तक चलने वाली और उत्तरदायी होती है। इसके विपरीत, जन्मजात प्रतिरक्षा अपने लक्ष्य उन्मूलन और अपेक्षाकृत गैर विशिष्ट में बहुत व्यापक है । इसलिए, आमतौर पर, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया इम्यूनोलॉजिकल रक्षा10की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करती है। प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाएं जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली से संबंधित हैं और कुल परिसंचारी लिम्फोसाइट्स11का 10−15% प्रतिनिधित्व करती हैं। एनके कोशिकाएं दो प्रमुख तंत्रों के माध्यम से लक्ष्य कोशिकाओं को समाप्त करती हैं। सबसे पहले, लिगांड को सक्रिय करने वाली कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए बाध्यकारी होने पर, एनके कोशिकाएं झिल्ली-बाधित प्रोटीन पर्फोनिन और सेरीन प्रोटीज़ ग्रैनज़ीम को एक्सोसाइटोसिस के माध्यम से छोड़ती हैं, जो संयुक्त रूप से लक्ष्य कोशिकाओं12,13,14,15में एपोप्टोसिस को प्रेरित करती हैं। इसके अतिरिक्त, एनके कोशिकाओं FasL और ट्यूमर परिगलन कारक से संबंधित एपोप्टोसिस-inducing ligand (ट्रेल) मौत रिसेप्टर्स (Fas/CD95) व्यक्त लक्ष्य कोशिकाओं के साथ बातचीत, कैस्पा-निर्भर apoptosis16के लिए अग्रणी । सबसे महत्वपूर्ण बात, एनके कोशिकाओं को रोगजनक-संक्रमित या घातक कोशिकाओं को समाप्त करने के लिए एंटीजन प्रस्तुति जैसे प्रीस्टिमुलेशन की आवश्यकता नहीं होती है; इस प्रकार, वे आमतौर पर एक तैयार करने के लिए मार राज्य17,18में हैं . आदेश में ट्यूमर के विकास और प्रगति को बाधित करने और कैंसर की कोशिकाओं को समाप्त करने के लिए, एनके कोशिकाओं ट्यूमर साइट के लिए माइग्रेट करना चाहिए और, एक बार ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में, पहचान और लक्ष्य कोशिकाओं पर हमला ।

अतीत में, एनके-सेल प्रभावक कार्यों की मुख्य रूप से निगरानी की गई थी, जिसमें19,20,21को डिग्रेनुलेशन और साइटोटॉक्सिकिटी परख दिया गया था। एनके सेल साइटोटॉक्सिकिटी को 51क्रोमियम रिलीज परख22,23,24,25से भी मापा जा सकता है . हालांकि, इस परख में कुछ विशिष्ट आवश्यकताएं हैं, जिनमें गामा काउंटर की आवश्यकता शामिल है, और रेडियोधर्मिता आधारित है, जिसके लिए रेडियोधर्मी सामग्रियों से निपटने और निपटान में प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है और उपयोगकर्ता के लिए जोखिम का स्तर बन जाता है। इसलिए, एनके सेल गतिविधि का अध्ययन करने के लिए कई नए गैर-रेडियोधर्मिता आधारित परखों को विकसित और नियोजित किया गया है ।

यहां, हम एनके सेल-मध्यस्थकैंसर सेल उन्मूलन को मापने के लिए दो ऐसे प्रोटोकॉल, रंगीमेट्रिक लैक्टिक डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) माप-आधारित एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिक परख और कैल्सिन एसिटॉक्सीमिथाइल (एएम) धुंधला आधारित सूक्ष्म विधि का वर्णन करते हैं। इन परखों को रेडियोआइसोटोप के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है, सीधी, संवेदनशील होती हैं, और एनके सेल फ़ंक्शन को मिलाने वाले कारकों की पहचान करती हैं। इसके अतिरिक्त, क्योंकि एनके सेल माइग्रेशन में परिवर्तनों की निगरानी के बिना एनके सेल फ़ंक्शन का पूरी तरह से मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है, हम एनके सेल माइग्रेशन की निगरानी के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित मात्रात्मक विधि भी पेश करते हैं।

Protocol

1. एनके कोशिकाओं और हेपेटिक ट्यूमर कोशिकाओं के लिए संस्कृति माध्यम की तैयारी

  1. मानव प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (जैसे, NK92MI) और मानव जिगर कैंसर सेल लाइन (जैसे, एसके-एचईपी-1) का उपयोग करें।
  2. एनके सेल कल्चर मीडियम को तैयार करें एनके92एमआई मानव एनके कोशिकाओं के लिए निम्नलिखित घटकों को जोड़कर न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल अल्फा के 500 मीटर में रिबोन्यूक्लियोसाइड्स के बिना और संकेतित अंतिम सांद्रता के लिए डिऑक्सीराइबोन्यूक्लियोसाइड्स: 0.02 एम एम फोलिक एसिड (100 मीटर फोलिक एसिड का 100 माइक्रोन), 0.2 एम मायोइनोसिटोल (500 माइक्रोएल ऑफ 20एम मायमी मी एम मायएम इनोसिटोल), 0.1 एमएम-मर्काप्टोथेनॉल (14.3 मीटर का 3.5 माइक्रोन-मर्काप्टोथेनॉल), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन (200 मीटर एल-ग्लूटामाइन का 5 mL), 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (5 mL 100x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन), 12.5% फेटल बोरिप्टोमिसिन सीरम (एफबीएस), और 12.5% घोड़ा सीरम। 0.22 माइक्रोन बाँझ निस्पंदन इकाई का उपयोग करके मिक्स और फ़िल्टर स्टरलाइज करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. हेपेटिक ट्यूमर सेल लाइन एसके-एचईपी-1 के लिए कल्चर मीडियम तैयार करें 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन को हाई ग्लूकोज डुल्बेकको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम (डीएमईएम) में जोड़कर 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन युक्त है ।

2. कोलोरीमेट्रिक एलडीएच माप-आधारित एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी परख

  1. एकसीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में 100 एमएम सेल कल्चर पेट्री डिश में 70−80% कॉन्फिडेंसी में एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं को 70−80% तक बढ़ाएं। 1x फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) के 5 मिलील के साथ पहले वाशिंग सेल द्वारा एकल-सेल निलंबन उत्पन्न करें और इसके बाद एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न होने तक सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में 0.25% ट्राइप्सिन-ईटीए के 1 मिलील के साथ ऊष्मायन के साथ उत्पन्न करें।
    नोट: एनके सेल गतिविधि कैंसर कोशिकाओं में एनके सेल सक्रिय लिगांड की अभिव्यक्ति में परिवर्तन के कारण तनावग्रस्त कैंसर कोशिकाओं द्वारा प्रेरित किया जा सकता है । इसलिए, स्वस्थ और उप-अनुकूल कैंसर कोशिकाओं का उपयोग सटीक परिणामों के लिए किया जाना चाहिए। यह भी ध्यान रखना जरूरी है कि एनके सेल रिसेप्टर्स और लिगामेंट26,27के लिए संवेदनशील हो सकते हैं . इसलिए, ट्राइप्सिनाइजेशन प्रोटोकॉल को सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया जाना चाहिए और अत्यधिक ट्रिपसिनाइजेशन से बचना चाहिए।
  2. ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद 15 मिलीस बाँझ शंकुभाटा ट्यूब में 3 मिन के लिए 160 एक्स जी पर एसके-एचईपी-1 कल्चर मीडियम और सेंट्रलाइज के 10 मिलील जोड़ें। सेल पैलेट को 1x पीबीएस के 5 मिलील से धोएं और संस्कृति माध्यम के 5 मिलील में फिर से सस्पेंड करें।
  3. समानांतर में, 15 मीटर बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में 3 मिन के लिए 160 x ग्राम पर NK92MI कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। सेल पैलेट को 1x पीबीएस के 5 मिलील से धोएं और NK92MI सेल कल्चर मीडियम के 5 एमआईएल में रिसस्पेंड करें।
    नोट: NK92MI कोशिकाओं एनके सेल संस्कृति माध्यम में उगाया जाता है और इसी तरह प्राप्त के रूप में कदम २.१ में वर्णित है ।
  4. हीमोसाइटोमीटर या किसी भी उपलब्ध स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके एसके-एचईपी-1 और NK92MI कोशिकाओं की गणना करें।
  5. 1:10 लक्ष्य के अनुपात में एसके-एचईपी-1 कोशिकाएं (लक्ष्य कोशिकाएं) (लक्ष्य कोशिकाएं) (1 x 10 4/100 μL/well) और NK92MI कोशिकाओं (प्रभावक कोशिकाओं) (1 x 105/100μL/well) जोड़ें: प्रभावक और एक ९६ अच्छी थाली में ट्रिपलीकुड़ कुओं में बीज ।
  6. 95% हवा के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 96 वेल प्लेट और 3 घंटे के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेट करें। ऊष्मायन के बाद, कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 450 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र प्लेट।
  7. सेल गोली परेशान किए बिना, प्रत्येक कुएं से अलौकिक के 100 μL इकट्ठा करें और एक नई 96 अच्छी प्लेट में एक कुएं में स्थानांतरित करें।
  8. एलडीएच सब्सट्रेट के 50 माइक्रोन जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 न्यूनतम के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  9. पीएच 4.7 पर स्टॉप सॉल्यूशन (50% डाइमेथिलफॉर्ममाइड और 20% सोडियम डॉडेकाइल सल्फेट) के 50 माइक्रोन जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करें। प्लेट रीडर का उपयोग करके तुरंत 490 एनएम और 680 एनएम पर प्लेट के अवशोषण को मापें।
  10. 490 एनएम पर अवशोषण से 680 एनएम पर अवशोषण घटाना। प्रतिशत (%) की गणना करें एनके सेल साइटोटॉक्सिकिटी नीचे दिए गए फॉर्मूले का इस्तेमाल कररही है।

    जहां एलडीएच प्रायोगिक (प्रभावक + लक्ष्य कोशिकाएं) NK92MI कोशिकाओं और एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं का अवशोषण है, एलडीएच प्रभावक कोशिकाएं अकेले NK92MI कोशिकाओं का अवशोषण है, एलडीएच सहज अकेले एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं का अवशोषण है, और एलडीएच अधिकतम एसके-एचईपी-1 का अवशोषण है लिसिस बफर के साथ कोशिकाएं।
    नोट: सीरम हस्तक्षेप को कम करने के लिए, हमेशा निम्नलिखित नियंत्रणों का उपयोग करें: अकेले लक्ष्य कोशिकाएं (एसके-एचईपी-1), अकेले प्रभावक कोशिकाएं (NK92MI), पूरी तरह से लाइसिस नियंत्रण के रूप में लाइसिस बफर के साथ कोशिकाओं को लक्षित करें, लक्ष्य सेल माध्यम, NK92MI मध्यम, साथ ही लक्ष्य सेल माध्यम और 1:1 अनुपात में NK92MI माध्यम।

3. एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी को मापने के लिए कैल्सिन एएम धुंधला आधारित सूक्ष्म विधि

  1. संस्कृति एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं को 70−80% संवित करने के लिए। 1x पीबीएस के 5 मिलील के साथ पहले वाशिंग सेल द्वारा एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न करें और इसके बाद 0.25% ट्राइप्सिन-ईटीए के 1 मिलील के साथ ऊष्मायन करें।
  2. 3 मिन के लिए 1 60 x ग्राम पर 1 एमएल बाँझ सेंट्रलाइज ट्यूब में सेंट्रलाइज एसके-एचईपी-1 कोशिकाएं। सीरम मुक्त डीएमईएम के 3 mL में गोली को फिर से निलंबित करें।
  3. एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं में कैल्सिन एएम समाधान (10 एमएम) का 1.5 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट करें। सेंट्रलाइज कैल्सीइन एएम-लेबल एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं को 15 मीटर बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में 3 मिन के लिए 160 x ग्राम पर।
  4. अतिरिक्त कैल्सीन एएम डाये को हटाने के लिए 1x पीबीएस के 5 किलोलीटर के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
  5. समानांतर में, 15 मीटर बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में 3 मिन के लिए 160 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र NK92MI कोशिकाओं। सेल पैलेट को एक बार 1x पीबीएस के 5 एमआईएल के साथ धोएं और NK92MI सेल मीडियम के 5 एमआईएल में फिर से सस्पेंड करें।
  6. एक हीमोसाइटोमीटर या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कैल्सिन AM लेबल एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं और NK92MI कोशिकाओं की गणना करें ।
  7. एनके सेल मीडियम में 1 x 105 कोशिकाओं/mL और NK92MI कोशिकाओं में 1 x 106 कोशिकाओं/mL पर संस्कृति माध्यम में एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें ।
  8. प्लेट कैल्सिन एएम-लेबल एसके-एचईपी-1 कोशिकाएं (लक्ष्य कोशिकाएं) (1 x 10 4/100 μL/well) NK92MI कोशिकाओं (प्रभावक कोशिकाओं) (1 x 105/100 μL/well) (1:10 लक्ष्य:effector अनुपात) प्रति अच्छी तरह से एक ९६ अच्छी तरह से थाली में ट्रिपलिकेट कुओं में ।
  9. 95% हवा के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 96 वेल प्लेट और 4 घंटे के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेट करें। ऊष्मायन के बाद, 10x आवर्धन पर फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैल्सिन एएम-लेबल कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस छवियों पर कब्जा करें। प्रत्येक उपचार की स्थिति के लिए प्रत्येक दोहराने के कम से कम 10 विभिन्न क्षेत्रों पर कब्जा करें।
  10. बेतरतीब ढंग से प्रत्येक दोहराने के लिए 10 छवियों का चयन करें और CALcein AM-सकारात्मक लेबल लक्ष्य कोशिकाओं के साथ या NK92MI कोशिकाओं के बिना इनक्यूबेटेड गिनती । नीचे दिए गए फॉर्मूले का उपयोग करके% साइटोटॉक्सिकिसिटी की गणना करें।

    नोट: नियंत्रण के रूप में, NK92MI कोशिकाओं के बिना लक्ष्य कोशिकाओं का उपयोग करें और पूरी तरह से पूरी तरह से lysis नियंत्रण के रूप में लक्षित कोशिकाओं को पूरी तरह से lysis । पूरी तरह से लिसिस के लिए, 1 घंटे के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स-100 (संस्कृति मीडिया के 200 माइक्रोन में 5% ट्राइटन एक्स-100 का 20 μL) में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

4. एनके सेल माइग्रेशन परख

  1. 15 मीटर बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में 3 मिन के लिए 160 x ग्राम पर NK92MI कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को विकसित करें।
  2. सेल पैलेट को 1x पीबीएस के 5 एमआईएल के साथ दो बार धोएं और सीरम-मुक्त NK92MI सेल माध्यम के 3 mL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके NK92MI कोशिकाओं की गणना करें।
  3. ट्रांसवेल पारगम्य कक्ष (6.5 मिमी व्यास डालने और 5 माइक्रोन पोर आकार) के ऊपरी डिब्बे में प्लेट NK92MI कोशिकाएं (2.5 x 105 कोशिकाएं/100 माइक्रोन/वेल) ।
  4. नीचे कक्ष में सीरम मुक्त माध्यम के 0.6 मिलीग्राम जोड़ें जिसमें एनके सेल कीमोआकर्षितेंट गुणों (जैसे, वातानुकूलित मध्यम, केमोकिन्स, साइटोकिन्स) के लिए परीक्षण किया जाएगा।
    नोट: वातानुकूलित माध्यम तैयार करते समय, माइग्रेशन परख में सीरम प्रोटीन के हस्तक्षेप को खत्म करने के लिए बिना अतिरिक्त सीरम के कम सीरम माध्यम का उपयोग करें।
  5. 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 अच्छी तरह से पारगम्य कक्षों इनक्यूबेट। 4 घंटे के बाद, गैर-अनुयायी एकत्र करें और नीचे के कक्ष से NK92MI कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और उन्हें आगे के विश्लेषण के लिए फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    नोट: संस्कृति का समय लक्ष्य कोशिकाओं के प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकता है, साथ ही लक्ष्य कोशिकाओं द्वारा उत्पादित केमोकिनकी की मात्रा और काइनेटिक्स भी भिन्न हो सकता है। इसलिए, इस समय अनुभवजन्य रूप से प्रत्येक सेल प्रकार, केमोकिन और प्रयोग के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।
  6. माइग्रेट एनके कोशिकाओं वाले प्रत्येक ट्यूब में 50 माइक्रोन की मात्रा में प्रवाह साइटोमेट्री के लिए गिनती मोतियों की पूर्व निर्धारित संख्या जोड़ें। स्वचालित FACS आधारित सेल गिनती में सक्षम किसी भी प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर ३०० μL/अच्छी तरह से सेल निलंबन की मात्रा का मूल्यांकन करें ।
    नोट: मिक्स या भंवर-प्रवाह साइटोमेट्री के लिए गिनती मोती अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए उपयोग से पहले हर बार सुनिश्चित करें कि मोतियों की एक निरंतर संख्या प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । सटीकता बनाए रखने के लिए गिनती मोतियों के साथ रिवर्स पाइपिंग की सिफारिश की जाती है। केवल एनके कोशिकाओं का उपयोग करें और FACS विश्लेषण नियंत्रण के रूप में प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मोतियों की गिनती। लेखक कम से कम 10,000 मोतियों + एनके कोशिकाओं को संयुक्त रूप से पढ़ने की सलाह देते हैं, एक राशि जिसने अच्छी तरह से काम किया है। हालांकि, यह संख्या प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर भिन्न हो सकती है। इसलिए, मोतियों + एनके कोशिकाओं की संयुक्त संख्या अनुभवजन्य रूप से प्रत्येक प्रकार के प्रयोग के लिए निर्धारित की जानी चाहिए। इसके अतिरिक्त, सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने और विभिन्न सेल मामलों के बीच परिवर्तनशीलता के लिए खाते में जैविक ट्रिपलिकेट्स का उपयोग करके प्रयोग करना महत्वपूर्ण है।
  7. इस सूत्र का उपयोग करके माइग्रेट किए गए NK92MI कोशिकाओं की पूर्ण संख्या की गणना करें:

    जहां कोशिकाओं की संख्या = , बी = मोतियों की संख्या, सी = बहुत की मनका गिनती सौंपा (प्रवाह साइटोमेट्री/50 μL के लिए गिनती मोतियों की संख्या; इस उदाहरण में 49,500), और डी = नमूना (μL) की मात्रा।
    नोट: यदि नमूना मात्रा के 300 μL (माइग्रेट कोशिकाओं) प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मोतियों की गिनती के 50 μL के साथ FACS विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है, माइग्रेट कोशिकाओं की पूर्ण संख्या = 1,700 कोशिकाओं / 3,300 मनका घटनाओं x 49,500 मोती/300 μL = 84.975 कोशिकाओं/ यदि नमूना पतला हो जाता है या यदि मलकीयत की एक अलग मात्रा का उपयोग किया जाता है तो गणना को ठीक किया जाना चाहिए।

Representative Results

एनके सेल साइटोटॉक्सिकनेिटी परख और एनके सेल माइग्रेशन परख को एक मॉडल सिस्टम के रूप में एसके-एचईपी-1 हेपेटिक ट्यूमर सेल लाइन का उपयोग करके किया गया था। एलडीएच परख का उपयोग करके एनके सेल साइटोटॉक्सिकिटी को मापने के लिए, एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं को या तो एक गैर-विशिष्ट (एनएस) श्रना या शआरएनए को सक्रिय करने वाले ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 4(एटीएफ4)को 3 एच(चित्रा 1ए)के लिए 96 अच्छी प्लेट में NK92MI कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट किया गया था। एटीएफ4 को पहले एनके सेल साइटोटॉक्सिकिटी को सक्रिय लिगाड यूएलबीपी128को विनियमित करके दिखाया गया है । एनके सेल-मध्यस्थता लक्ष्य सेल हत्या से जुड़ी एलडीएच गतिविधि को रंगीन ढंग से मापा गया था, और प्रोटोकॉल 1 में वर्णित सूत्र का उपयोग करके प्रतिशत साइटोटॉक्सिकिनेिटी की गणना की गई थी। ATF4 नॉकडाउन ने एनएस श्रना(चित्रा 1बी-डी)व्यक्त करने वाली एनके कोशिकाओं की तुलना में एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी को काफी कम कर दिया। हमने एक कैल्सिन एएम धुंधला आधारित परख का उपयोग करके एनके सेल साइटोटॉक्सिकिटी को भी मापा। इस उद्देश्य के लिए, एनएस श्रना या एटीएफ4-लक्ष्यीकरण शर्नस व्यक्त करने वाली एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं को कैल्सिन एएम के साथ लेबल किया गया था और 96 अच्छी प्लेटों में NK92MI कोशिकाओं के साथ 4 एच के लिए इनक्यूबेट किया गया था जैसा कि चित्र ा 2एमें सचित्र है। ऊष्मायन के बाद, एक FITC/GFP फिल्टर का उपयोग कर फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा calcein AM-सकारात्मक कोशिकाओं की छवियों पर कब्जा कर लिया गया । एनके कोशिकाओं द्वारा मारे गए कोशिकाओं को इस दृष्टिकोण से पता नहीं लगाया जाता है क्योंकि वे अब कैल्सिन एएम रंग को बनाए नहीं रखते हैं। जैसा कि चित्रा 2बी, सीमें दिखाया गया है, कैल्सिन एएम-पॉजिटिव एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं की संख्या में कमी आई है, जो NK92MI कोशिकाओं के बिना उगाए गए एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं की तुलना में NK92MI कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति के बाद कम हो जाती है। हालांकि, जैसा कि उम्मीद थी, एटीएफ4 नॉकडाउन ने एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं की एनके सेल-मध्यस्थता हत्या को कम कर दिया, जो कैल्सिन एएम-पॉजिटिव कोशिकाओं(चित्रा 2बी, सी)की एक बड़ी संख्या द्वारा मनाया जाता है। इसलिए, दोनों LDH आधारित और calcein AM परख लगातार परिणाम दिखाया और पुष्टि की है कि ATF4 नॉकडाउन एनके मध्यस्थता कैंसर सेल साइटोटॉक्सिकिटी कम कर देता है । इनमें से कोई भी परख एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिसिटी का आकलन करने के लिए पर्याप्त है; हालांकि, हम परिणामों में तंगी और विश्वास दोनों को बढ़ाने के लिए दोनों तरीकों का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

हम भी एक 24 अच्छी तरह से एनके सेल प्रवास परख के परिणाम पेश करते हैं । ऊपरी कक्ष में सीरम-मुक्त NK92MI माध्यम में NK92MI कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया गया था, और निचले परगम्य कक्ष में केमोकिन, सीसी आकृति, लिगाण्ड 2 (सीसीएल 2) जोड़ा गया था। एनके सेल माइग्रेशन को धारा 3(चित्रा 3ए)में वर्णित के रूप में कहा गया था । माइग्रेट किए गए NK92MI कोशिकाओं की संख्या प्रवाह साइटोमेट्री के लिए गिनती मोतियों को जोड़कर और इसके बाद FACS विश्लेषण द्वारा निर्धारित की गई थी। जैसा कि चित्रा 3बी-सीमें दिखाया गया है, एनके92एमआई कोशिकाओं की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी जो नियंत्रण माध्यम की तुलना में सीसीएल 2 युक्त माध्यम की ओर चले गए थे।

Figure 1
चित्रा 1: कोलोरीमेट्रिक एलडीएच गतिविधि-आधारित एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी परख। (A)योजनाबद्ध रंगेम एलडीएच गतिविधि आधारित एनके सेल साइटोटॉक्सिकिटी परख के प्रमुख चरणों का चित्रण। (बी, सी) एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं में एटीएफ4 अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया था, जिसमें मात्रात्मक आरटी-पीसीआर और वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा एटीएफ4 को लक्षित करते हुए गैर-विशिष्ट (एनएस) श्रना या shRNAs व्यक्त किया गया था । (ख)एनएस श्नायाणा या एटीएफ 4 श्आरएनए व्यक्त करने वाली एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं में एसीटीआईएनबी स्तर को सामान्य करने के बाद सापेक्ष एटीएफ4 एमआरएनए स्तर दिखाया गया है। (C)एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं में एटीएफ4 और एसीटीआईएनबी प्रोटीन का स्तर एनएस श्नाया या एटीएफ 4 श्आरएनए व्यक्त करता है । (D)एलएनसेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिसिटी का विश्लेषण एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं में किया गया था, जिसमें एलडीएच विधि द्वारा एनएस श्रना या एटीएफ 4 श्आरएनए व्यक्त किया गया था । प्रतिशत (%) एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी दिखाई गई है। डेटा मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं; **पी एंड एलटी; 0.01, ***पी एंड एलटी; 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी को मापने के लिए कैल्सिन एएम धुंधला आधारित सूक्ष्म विधि। (A)योजनाबद्ध एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकता को मापने के लिए कैल्सिन एएम धुंधला आधारित सूक्ष्म विधि के प्रमुख चरणों का चित्रण । (ख)एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी का विश्लेषण एसके-एचईपी-1 कोशिकाओं में किया गया था, जिसमें कैल्सिन एएम विधि का उपयोग करके एनएस श्रना या एटीएफ 4 श्आरएनए व्यक्त किया गया था । प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है। स्केल बार = 200 माइक्रोन। (ग)पैनल बी * * पी एंड एलटी; 0.01 में प्रस्तुत प्रयोग के लिए कैल्सिन एएम-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: FACS आधारित मात्रात्मक एनके सेल प्रवास परख । (A)योजनाबद्ध FACS आधारित एनके सेल माइग्रेशन परख के प्रमुख कदमों का चित्रण । (बी, सी) एनके सेल माइग्रेशन परख 24 अच्छी तरह से थाली के नीचे चैंबर में CCL2 के ५० एनजी जोड़ने के बाद किया गया था । (ख)प्रतिनिधि एनके सेल माइग्रेशन डॉट प्लॉट्स फॉर कंट्रोल या सीसीएल2-ट्रीटकल्चर मीडियम को दिखाया गया है । (C)एनके सेल माइग्रेशन डेटा (मतलब ± एसईएम) पैनल बी में दिखाए गए प्रयोग के लिए प्रस्तुत किया जाता है । ***पी एंड एलटी; ०.००१ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां वर्णित साइटोटॉक्सिकिटी और माइग्रेशन विधियों का उपयोग कैंसर कोशिकाओं और एनके सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा चोरी तंत्र को घातक ट्यूमर में एनके सेल साइटोटॉक्सिकिटी का मूल्यांकन करने के साथ-साथ चिकित्सकीय एजेंटों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो एनके सेल गतिविधि/कार्य को बढ़ाएंगे । प्रोटोकॉल शास्त्रीय रेडियोधर्मिता आधारित 51क्रोमियम रिलीज परख के लिए सरल, संवेदनशील, प्रजनन योग्य और बेहतर विकल्प हैं। प्रोटोकॉल को विशेष रूप से अधिकांश प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए आसानी से अनुकूलनीय होने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिसमें सीधा रंग-रोगन, सूक्ष्म, या एफएसीएस आधारित रीडआउट हैं जो व्याख्या करना आसान है, जिससे शोधकर्ताओं को विश्वसनीय निष्कर्षतक पहुंचने की अनुमति मिल सके। सभी उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग-आधारित दृष्टिकोणों के लिए स्केलेबल हैं। हालांकि प्रोटोकॉल एक ही hepatic ट्यूमर सेल लाइन के संदर्भ में प्रस्तुत कर रहे हैं, वे आसानी से अंय कैंसर सेल प्रकार और/

जबकि प्रस्तुत किए गए सभी तरीके मजबूत और प्रजनन योग्य हैं, अंतर-प्रयोगात्मक भिन्नता कैंसर कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं के विभिन्न बैचों के साथ हो सकती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि परिणाम प्रयोगों के निष्कर्षों का सही समर्थन करते हैं, जैविक ट्रिपलिकेट्स का उपयोग करके प्रयोग को कम से कम दो बार दोहराने की सलाह दी जाती है।

इस विधि की एक सीमा यह है कि NK92MI कोशिकाओं की वृद्धि दर धीमी हो सकती है। इसलिए, ५० या अधिक नमूनों के साथ प्रयोगों के लिए, विलंब को रोकने के लिए NK92MI की पर्याप्त संख्या पहले से उगाई जानी चाहिए । इसके अलावा, प्रोटोकॉल में वर्णित सभी नियंत्रणों को नकली और गैर-उत्पादक परिणामों से बचने के लिए लागू किया जाना चाहिए । एनके साइटोटॉक्सिकिटी परख की एक और सीमा यह है कि एनके टू कैंसर सेल अनुपात, साथ ही ऊष्मायन समय, प्रत्येक लक्ष्य कोशिका के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, हमने कैंसर कोशिकाओं के विभिन्न अनुपातों का परीक्षण एनके कोशिकाओं (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 और 1:80) हेपेटिक कैंसर सेल लाइनों के लिए किया है, साथ ही कई ऊष्मायन समय (2, 3, 4, 5, और 6 एच)। हमारे परिणामों के आधार पर हम एनके कोशिकाओं और 3 एच के लिए ऊष्मायन के लिए कैंसर कोशिकाओं के 1:10 और 1:20 अनुपात के साथ सबसे सुसंगत परिणाम मनाया ।

इसके अलावा, ठोस ट्यूमर से प्राप्त कैंसर कोशिकाओं को देते है और संस्कृति की थाली की सतह पर विकसित होगा, जबकि एनके कोशिकाओं के निलंबन में वृद्धि होती है । यदि ऊष्मायन समय 3 घंटे से अधिक लंबा है, तो अल्ट्रालो अटैचमेंट 96 अच्छी प्लेटों का उपयोग करने की सलाह दी जाती है, जिससे प्रयोगों और जैविक प्रतिकृतियों के बीच स्थिरता और प्रजनन क्षमता में सुधार होगा। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एनके सेल-प्रेरित साइटोटॉक्सिकिलिटी परख भी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) से अलग प्राथमिक एनके कोशिकाओं का उपयोग करके किया जा सकता है। हालांकि, इस तरह के प्रयोगों के साथ कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, इन प्रयोगों के रूप में आसानी से NK92MI कोशिकाओं के साथ के रूप में नहीं पहुंचा जा सकता है । दूसरा, पीएमबीसी से अलग एनके कोशिकाओं की साइटोटॉक्सिक गतिविधि का बैच-टू-बैच भिन्नता परिणामों की प्रजनन क्षमता और व्याख्या के मामले में समस्याग्रस्त हो सकती है । इसी तरह, साहित्य में अन्य मानव एनके सेल लाइनों का वर्णन किया गया है और इस प्रकार के प्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है, जिसमें एनकेएल कोशिकाएं शामिल हैं29; हालांकि, एनके-92एमआई कोशिकाओं के विपरीत, एनकेएल कोशिकाएं आईएल-2 निर्भर हैं और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं।

कैल्सीन एएम के प्रयोगों पर विचार करते समय, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कैल्सिन एएम सेल डेथ30के बाद अपोप्टोटिक शरीर में रहता है। इसलिए, कैल्सिन एएम धुंधला की मात्रा को सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए, क्योंकि इससे एनके साइटोटॉक्सिकिटी का कम अनुमान लग सकता है।

एनके सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी के समान, साइटोकिन्स और अन्य कीमोआकर्षितेंट द्वारा एनके सेल माइग्रेशन का मॉड्यूलेशन एनके सेल फ़ंक्शन के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एनके सेल माइग्रेशन परख यहां वर्णित एक सरल मंच प्रदान करता है जैसे कि केमोकिन या कीमोआकर्षितेंट जैसे उत्तेजना के संदर्भ में एनके सेल माइग्रेशन का मूल्यांकन किया जाता है। इस परख का उपयोग उन एजेंटों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है जो एनके सेल माइग्रेशन को बढ़ावा दे सकते हैं या हस्तक्षेप कर सकते हैं - इस प्रकार, एनके सेल माइग्रेशन के एन्हांसर्स और दमनकों की पहचान करना। यह विधि आनुवंशिक/एपीजेनेटिक परिवर्तन (अपरेगुलेशन या डाउनरेगुलेशन) या दवा उपचार के कारण उत्पन्न होने के परिणामस्वरूप एनके सेल माइग्रेशन नियामक क्षमता का अध्ययन करने के लिए भी उपयोगी हो सकती है ।

एनके सेल माइग्रेशन को सही ढंग से मापने के लिए, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिनका पालन किया जाना चाहिए। वातानुकूलित माध्यम का उपयोग कर प्रयोगों के सभी के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि समकक्ष वातानुकूलित माध्यम दोनों नियंत्रण और उपचार की स्थिति से इस्तेमाल किया जा करने के लिए सटीक माप प्राप्त है । ऊष्मायन का समय शुद्ध रसायनार्थियों और वातानुकूलित माध्यम के साथ भिन्न होगा। अंत में, ट्रांसवेल माइग्रेशन परख अच्छी तरह से स्थापित किए जाते हैं और एनके सेल माइग्रेशन का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट विधि माना जाता है; हालांकि, परखों में नियोजित सजातीय मोनोकल्चर में ऊतकों या यहां तक कि 3 डी संस्कृतियों के जटिल शरीर विज्ञान की कमी होती है जो ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट की अधिक सटीक नकल कर सकती हैं।

इस प्रकार, हालांकि एनके सेल साइटोटॉक्सिकिटी परख और एनके माइग्रेशन परख के लिए कुछ सीमाएं हैं जो इस लेख में प्रस्तुत की गई हैं, ये परख प्रतिरक्षा अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होते हैं और इस प्रकार एनके सेल का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण और विश्वसनीय तरीके प्रदान करते हैं समारोह और एनके सेल मॉड्यूलरी प्रतिरक्षा चिकित्सा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम कृतज्ञता से स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान स्वीकार करते हैं: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW), और 1R01 CA218008-01A1 (NW) । हम भी रक्षा वित्तपोषण के विभाग W81XWH1910480 और W81XWH-18-1-0069 एनडब्ल्यू को स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute counting beads Thermo Fisher Scientific C36950
Alpha-MEM Sigma-Aldrich M4256
Amicon ultra Centrifugal filters Millipore UFC900324
Calcein AM dye Sigma-Aldrich 17783
DMEM Gibco 11965-092
Fetal Bovine Serum Gibco 26140079
Folic Acid Sigma-Aldrich F8758
Horse Serum Gibco 16050114
L-Glutamine (200 mM) Gibco 2530081
LDH cytotoxic assay Kit Thermo Fisher Scientific 88953
myo-Inositol Sigma-Aldrich I5125
NK92MI cells ATCC CRL-2408
Opti-MEM Gibco 31985070
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
SKHEP-1 Cells ATCC HTB-52
Transwell permeable chambers Costar 3241
Trypsin EDTA solution Gibco 25200056

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References

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हेपेटिक ट्यूमर कोशिकाओं के संदर्भ में प्राकृतिक हत्यारा सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिकिटी और माइग्रेशन का मापन
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Chava, S., Bugide, S., Gupta, R.,… More

Chava, S., Bugide, S., Gupta, R., Wajapeyee, N. Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells. J. Vis. Exp. (156), e60714, doi:10.3791/60714 (2020).

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