Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Måling af natural killer celle-medieret cytotoksicitet og migration i forbindelse med levercellede celler

Published: February 22, 2020 doi: 10.3791/60714
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Alabama at Birmingham

Summary

Unddragelse af naturlig dræber (NK) cellemedieret udryddelse af kræftceller er vigtig for kræft indledning og progression. Her præsenterer vi to ikke-radioaktivitetsbaserede protokoller for at evaluere NK cellemedieret cytotoksicitet mod levertumorceller. Derudover præsenteres en tredje protokol for at analysere NK-cellemigrering.

Abstract

Naturlige killer (NK) celler er en delmængde af cytotoksisk lymfocyt population af medfødte immunsystem og deltage som en første linje i forsvaret ved at rydde patogen-inficerede, ondartede, og stressede celler. NK-cellernes evne til at udrydde kræftceller gør dem til et vigtigt redskab i kampen mod kræft. Flere nye immunbaserede behandlinger undersøges for kræftbehandling, som enten er afhængige af at forbedre NK-celleaktiviteten eller øge kræftcellernes følsomhed over for NK-cellemedieret udryddelse. Men for effektivt at udvikle disse terapeutiske tilgange, omkostningseffektive in vitro assays at overvåge NK cellemedieret cytotoksicitet og migration er også nødvendig. Her præsenterer vi to in vitro-protokoller, der pålideligt og reproducerbart kan overvåge effekten af NK-celle cytotoksicitet på kræftceller (eller andre målceller). Disse protokoller er ikke-radioaktivitetsbaserede, nemme at konfigurere og kan skaleres op til screening med høj gennemløb. Vi præsenterer også en flow cytometri-baseret protokol til kvantitativt overvåge NK celle migration, som også kan skaleres op til high-throughput screening. Samlet set kan disse tre protokoller bruges til at overvåge centrale aspekter af NK celle aktivitet, der er nødvendige for cellernes evne til at udrydde dysfunktionelle målceller.

Introduction

Den menneskelige legemes evne til at identificere ikke-selv og udrydde fremmedlegemer er nøglen til menneskets overlevelse mod patogener og maligniteter1. Den menneskelige immunrespons spiller den vigtigste rolle i denne proces2,3,4. Baseret på centrale egenskaber og funktioner, kan det menneskelige immunsystem være bredt klassificeret i to store funktionelle grupper: adaptive immunsystem og medfødte immunsystem. Det adaptive immunsystem er typisk specifikt for et givet patogen og har immunologisk hukommelse og er derfor langvarig og lydhør over for fremtidig reinfektion med samme patogen5,6,7,8,9. Derimod er medfødt immunitet meget bredere i sin måludryddelse og relativt uspecifik. Derfor, typisk, den medfødte immunrespons fungerer som den første linje af immunologiske forsvar10. Naturlige dræberceller (NK) tilhører det medfødte immunsystem og udgør 10−15% af den samlede cirkulerende lymfocytter11. NK celler udrydde målceller via to store mekanismer. For det første, ved binding til målceller udtrykke aktivereligands, NK celler frigive membran-forstyrrende protein perforin og serin protease granzymes gennem exocytose, som i fællesskab fremkalde apoptose i målceller12,13,14,15. Derudover, NK celler udtrykker FasL og tumor nekrose faktor-relaterede apoptose-inducerende ligand (TRAIL) interagere med målceller udtrykke død receptorer (Fas/CD95), hvilket fører til caspase-afhængige apoptose16. Vigtigst er det, NK celler kræver ikke præstimulation, såsom antigen præsentation, at udrydde patogen-inficerede eller maligne celler; således er de normalt i en klar til at dræbe tilstand17,18. For at hæmme tumorudvikling og progression og udrydde kræftceller, NK celler skal migrere til tumor site og, en gang i tumor mikromiljøet, identificere og angribe målcellerne.

Tidligere blev NK-celleeffektorfunktioner primært overvåget ved degranulation og cytotoksicitetsanalyser19,20,21. NK celle cytotoksicitet kan også måles ved 51krom frigivelse assay22,23,24,25. Men denne analyse har nogle specifikke krav, herunder behovet for en gammatæller, og er radioaktivitet-baseret, hvilket kræver uddannelse i håndtering og bortskaffelse af radioaktive materialer og udgør en risiko for brugeren. Derfor er der udviklet og ansat flere nye ikke-radioaktivitetsbaserede analyser til at studere NK-celleaktivitet.

Her beskriver vi to sådanne protokoller, kolorimetrisk emælkesyredehydrogenase (LDH) målebaserede NK cellemedieret cytotoksicitetsanalyse og calcein acetoxymethyl (AM) farvningsbaseret mikroskopisk metode til måling af NK cellemedieret udryddelse af kræftceller. Disse analyser kræver ikke brug af radioisotoper, er ligetil, følsomme og reproducerbart identificere faktorer, der modulerer NK celle funktion. Da NK-cellefunktionen ikke kan evalueres fuldt ud uden at overvåge ændringer i NK-cellemigration, præsenterer vi også en flowcytometribaseret kvantitativ metode til overvågning af NK-cellemigration.

Protocol

1. Forberedelse af Kultur Medium for NK Celler og hepatiske tumorceller

  1. Brug humane naturlige dræberceller (f.eks.
  2. Forbered NK cellekultur medium for NK92MI menneskelige NK celler ved at tilføje følgende komponenter til 500 ml af minimum væsentlige medium Eagle alpha uden ribonucleosides og deoxyribonukleosider til de angivne endelige koncentrationer: 0,02 mM folinsyre (100 μL af 100 mM folinsyre), 0,2 mM myoinositol (500 μL af 200 mM myinos itol), 0,1 mM β-mercaptoethanol (3,5 μL 14,3 M β-mercaptoethanol), 2 mM L-glutamin (5 mL af 200 mM L-glutamin), 1% penicillin/streptomycin (5 ml 100x penicillin/streptomycin), 12,5% fostrets kvæg serum (FBS) og 12,5% hesteserum. Bland og filtrer steriliseres ved hjælp af en steril filtreringsenhed på 0,22 μm, og opbevares ved 4 °C.
  3. Forbered kultur medium til hepatic tumor celle linje SK-HEP-1 ved at tilføje 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin til høj-glukose Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) indeholder 2 mM L-glutamin.

2. Kolorimetrisk LDH Måling-baserede NK Celle-medieret cytotoksicitet Assay

  1. Dyrk SK-HEP-1-cellerne til 70−80% sammenløb i en 100 mm cellekultur Petri skål i 5% CO2 ved 37 °C i en CO 2-inkubator. Generér en enkeltcellesuspension ved første vaskeceller med 5 ml 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) efterfulgt af inkubation med 1 ml 0,25% trypsin-EDTA i 5% CO2 ved 37 °C i en CO 2-inkubator, indtil der genereres en enkelt cellesuspension.
    BEMÆRK: NK celleaktivitet kan induceres af stressede kræftceller på grund af ændringer i ekspressionaf NK celleaktiverende ligand i kræftceller. Derfor bør raske og sub-flydende kræftceller anvendes til nøjagtige resultater. Det er også vigtigt at bemærke , at NK cellereceptorer og ligander kan være følsomme over for trypsinisering26,27. Derfor bør trypsinisering protokol omhyggeligt optimeret og overdreven trypsinisering bør undgås.
  2. Efter trypsinisering tilsættes 10 ml SK-HEP-1 kulturmedium og centrifuger es k10 x g i 3 min i et sterilt centrifugerør på 15 ml. Vask cellepellet med 5 ml 1x PBS og resuspend i 5 ml kulturmedium.
  3. Parallelt hermed centrifugeres NK92MI-cellerne ved 160 x g i 3 min i et sterilt centrifugerør på 15 ml. Vask cellepellet med 5 ml 1x PBS og resuspend i 5 ml NK92MI cellekultur medium.
    BEMÆRK: NK92MI-celler dyrkes i NK-cellekulturmedium og fremstilles på samme måde som beskrevet i trin 2.1.
  4. Tæl SK-HEP-1- og NK92MI-cellerne ved hjælp af et hæmitivt eller en tilgængelig automatiseret celletæller.
  5. Der tilsættes SK-HEP-1-celler (målceller) (1 x 104/100 μL/brønd) og NK92MI-celler (effektorceller) (1 x 105/100 μL/brønd) i forholdet 1:10 mål:effektor og frø i treeksemplarerbrønde i en 96 brøndplade.
  6. Inkuber 96 brøndpladen ved 37 °C i en atmosfære på 95 % luft og 5% CO2 for 3 timer. Efter inkubation, centrifuge plade ved 450 x g i 5 min ved stuetemperatur.
  7. Uden at forstyrre cellepellet, indsamle 100 μL supernatant fra hver brønd og overføre til en brønd i en ny 96 godt plade.
  8. Tilsæt 50 μL LDH substrat, bland godt, og inkuberpladen i 20 min ved stuetemperatur i mørke.
  9. Reaktionen stoppes ved at tilsætte 50 μL stopopløsning (50 % dimethylformamid og 20 % natriumdodecylsulfat ved pH 4.7). Umiddelbart måle absorbans af pladen på 490 nm og 680 nm ved hjælp af en pladelæser.
  10. Træk absorbansen ved 680 nm fra absorbansen ved 490 nm. Beregne procenten (%) NK celle cytotoksicitet ved hjælp af formlen nedenfor.

    hvor LDH eksperimentelle (effektor + målceller) er absorbansen af NK92MI celler og SK-HEP-1 celler, LDH effektor celler er absorbans af NK92MI celler alene, LDH spontan er absorbans af SK-HEP-1 celler alene, og LDH maximal er absorbansaf SK-HEP-1 celler med lysisbuffer.
    BEMÆRK: For at reducere seruminterferens skal du altid bruge følgende kontrolelementer: målceller alene (SK-HEP-1), effektorceller alene (NK92MI), målceller med lysisbuffer som komplet lysiskontrol, målcellemedium, NK92MI-medium samt målcellemedium og NK92MI medium i et 1:1 forhold.

3. Calcein AM Farvningsbaseret mikroskopisk metode til måling af NK Cellemedieret Cytotoksicitet

  1. Kultur SK-HEP-1 celler til 70-80% sammenløb. Generer en enkeltcellesuspension ved første vaskeceller med 5 ml 1x PBS efterfulgt af inkubation med 1 ml 0,25% trypsin-EDTA.
  2. CentrifugeSK-HEP-1 celler i et 1 ml sterilt centrifugerør ved 160 x g i 3 min. Ophæng pelletiet i 3 ml serumfri DMEM.
  3. Der tilsættes 1,5 μL calcein AM-opløsning (10 mM) til SK-HEP-1-celler og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Centrifuge calcein AM-mærket SK-HEP-1 celler ved 160 x g i 3 min i en 15 ml steril centrifuge rør.
  4. Vask celler to gange med 5 ml 1x PBS for at fjerne overskydende calcein AM farvestof.
  5. Parallelt hermed centrifugerer NK92MI-celler ved 160 x g i 3 min i et sterilt centrifugerør på 15 ml. Cellepellet en gang med 5 ml 1x PBS og resuspend i 5 ml NK92MI cellemedium.
  6. Tælle calcein AM-mærket SK-HEP-1 celler og NK92MI celler ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celle tæller.
  7. OpslæmSK-HEP-1-celler i dyrkningsmedium ved 1 x 105 celler/ml og NK92MI-celler med 1 x 106 celler/ml i NK-cellemedium.
  8. Pladecalcein AM-mærkede SK-HEP-1-celler (målceller) (1 x 104/100 μL/brønd) med NK92MI-celler (effektorceller) (1 x 105/100 μL/brønd) (1:10 mål:effektorforhold) pr. brønd i treeksemplarerbrønde i en 96 brøndplade.
  9. Inkuber 96 brøndpladen ved 37 °C i en atmosfære på 95 % luft og 5% CO2 for 4 timer. Efter inkubation, fange fluorescens billeder af calcein AM-mærket celler ved hjælp af en fluorescens mikroskop ved 10x forstørrelse. Optag mindst 10 forskellige felter i hver replikat for hver behandlingstilstand.
  10. Vælg tilfældigt 10 billeder for hver replikat og tælle calcein AM-positive mærket målceller inkuberet med eller uden NK92MI celler. Beregn % cytotoksicitet ved hjælp af formlen nedenfor.

    BEMÆRK: Som kontrolelementer skal du bruge målceller uden NK92MI-celler og helt lysed målceller som komplet lysiskontrol. For komplet lysis inkuberer cellerne i 0,5% Triton X-100 for 1 time (20 μL 5% Triton X-100 i 200 μL kulturmedier).

4. NK Cell Migration Assay

  1. Dyrk NK92MI-celler og centrifugeceller med 160 x g i 3 min i et sterilt centrifugerør på 15 ml.
  2. Cellepellet tandgange med 5 ml 1x PBS og ophæng cellerne igen i 3 ml serumfrit NK92MI-cellemedium. Tæl NK92MI-celler ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller.
  3. Plade NK92MI-celler (2,5 x 105 celler/100 μL/brønd) i det øverste rum i det gennemsigtige permeable kammer (indsats med en diameter på 6,5 mm og 5 μm porestørrelse).
  4. I det nederste kammer tilsættes 0,6 ml serumfrit medium indeholdende materiale, der skal testes for NK-cellekemotiltrækkerens egenskaber (f.eks. konditioneret medium, chemokiner, cytokiner).
    BEMÆRK: Når konditionering konditioneret medium, bruge nedsat serum medium uden tilsat serum for at fjerne interferens fra serum proteiner i migration assay.
  5. Inkuber de 24 brøndgennemtrængelige kamre ved 37 °C i 4 timer. Efter 4 timer indsamles de ikke-klæbende og migrerede NK92MI-celler fra det nederste kammer og overfører dem til fluorescensaktiverede cellesorteringsrør (FACS) til yderligere analyse.
    BEMÆRK: Kulturtiden kan variere afhængigt af typen af målceller samt mængden og kinetik af kemoletter, der produceres af målcellerne. Derfor bør denne gang bestemmes empirisk for hver celletype, chemokin og eksperiment.
  6. Tilføj forudbestemt antal tælleperler til flowcytometri i et volumen på 50 μL til hvert rør, der indeholder migrerede NK-celler. Vurder volumenet på 300 μL/brøndcelleaffjedring ved hjælp af et flowcytometer, der kan automatisere FACS-baseret celletælling.
    BEMÆRK: Bland eller vortex-bland tælleperlerne for flowcytometri grundigt hver gang før brug for at sikre, at et konstant antal perler bruges til at minimere eksperimentel variation. Omvendt pipettering anbefales med tælleperler for at opretholde nøjagtigheden. Brug kun NK-celler og tælle perler til flowcytometri som FACS-analysekontrolelementer. Forfatterne anbefaler at læse mindst 10.000 perler + NK celler tilsammen, et beløb, der har fungeret godt. Dette tal kan dog variere afhængigt af forsøgsforholdene. Derfor bør det samlede antal perler + NK celler være empirisk bestemt for hver type eksperiment. Derudover er det vigtigt at udføre eksperimenter ved hjælp af biologiske treeksemplarer for at opnå statistisk signifikante resultater og for at tage højde for variabilitet mellem forskellige celletal.
  7. Beregn det absolutte antal migrerede NK92MI-celler ved hjælp af denne formel:

    hvor A = antal celler, B = antal perler, C = tildelt perle tæller af partiet (antal tælle perler til flow cytometri/50 μL; i dette eksempel 49.500), og D = volumen af prøven (μL).
    BEMÆRK: Hvis der anvendes 300 μL prøvevolumen (migrerede celler) til FACS-analyse med 50 μL tælleperler til flowcytometri, det absolutte antal migrerede celler = 1.700 celler /3.300 perlehændelser x 49.500 perler/300 μL = 84.975 celler/μL. Beregningen skal korrigeres, hvis prøven fortyndes, eller hvis der anvendes en anden mængde FACS-tælleperler.

Representative Results

NK celle cytotoksicitet assays og NK celle migration assay blev udført ved hjælp af SK-HEP-1 hepatic tumor celle linje som et modelsystem. For at måle NK celle cytotoksicitet ved hjælp af LDH-analysen blev SK-HEP-1-celler, der udtrykker enten en uspecifik (NS) shRNA eller shRNA- målretning, der aktiverede transskriptionsfaktor 4 (ATF4), inkuberet med NK92MI-celler i en 96 brøndplade i 3 timer (figur 1A). ATF4 har tidligere vist sig at regulere NK celle cytotoksicitet ved at upregulater eaktivating ligog ULBP128. LDH-aktivitet, der er knyttet til NK-cellemedieret målcelleaflivning, blev målt farvemæssigt, og procent cytotoksicitet beregnet ved hjælp af den formel, der er beskrevet i protokol 1. ATF4 knockdown reducerede betydeligt NK-cellemedieret cytotoksicitet sammenlignet med NK-celler, der udtrykker NS shRNA (figur 1B-D). Vi målte også NK celle cytotoksicitet ved hjælp af en calcein AM farvning-baseret analyse. Med henblik herpå blev SK-HEP-1-celler, der udtrykker NS shRNA ellerATF4-målretningshRNA'er, mærket med calcein AM og inkuberet med NK92MI-celler i 96 brøndplader for 4 timer som vist i figur 2A . Efter inkubation, billeder af calcein AM-positive celler blev fanget af fluorescens mikroskopi ved hjælp af en FITC / GFP filter. Celler dræbt af NK celler er ikke opdaget af denne fremgangsmåde, fordi de ikke længere bevarer calcein AM farvestof. Som vist i figur 2B,Creduceres antallet af calcein AM-positive SK-HEP-1-celler efter co-kultur med NK92MI-celler sammenlignet med SK-HEP-1-celler, der dyrkes uden NK92MI-celler. Som forventet reducerede ATF4-knockdown via shRNA imidlertid NK-cellemedieret drab på SK-HEP-1-celler, observeret af et større antal calcein AM-positive celler (figur 2B,C). Derfor viste både LDH-baserede og calcein AM assays ensartede resultater og bekræftede, at ATF4 knockdown reducerer NK-medieret kræftcelle cytotoksicitet. En af disse analyser er tilstrækkelig til at vurdere NK cellemedieret cytotoksicitet; Vi anbefaler dog, at du bruger begge metoder til at øge både stringens og tillid til resultaterne.

Vi præsenterer også resultaterne af en 24 brønd NK celle migration assay. NK92MI-celler blev ophængt igen i serumfrit NK92MI-medium i det øverste kammer, og chemokine, CC motiv, ligand 2 (CCL2) blev tilføjet til det nederste permeable kammer. NK celle migration blev analysen som beskrevet i afsnit 3(Figur 3A). Antallet af migrerede NK92MI-celler blev kvantificeret ved at tilføje tælleperler til flowcytometri og efterfulgt af FACS-analyse. Som vist i figur 3B-Cvar der en betydelig stigning i antallet af NK92MI-celler, der var migreret mod CCL2-holdigt medium sammenlignet med kontrolmediet.

Figure 1
Figur 1: Kolorimetrisk LDH aktivitetsbaseret NK cellemedieret cytotoksicitetsanalyse. (A) Schematic skildrer de vigtigste trin i kolorimetriske LDH aktivitetsbaserede NK celle cytotoksicitet assay. (B,C) ATF4-udtrykket blev analyseret i SK-HEP-1-celler, der udtrykker enten uspecifikke (NS) shRNA eller shRNAs rettet mod ATF4 ved kvantitativ RT-PCR og vestlig blotting. (B) Relative ATF4 mRNA-niveau påvises efter normalisering til ACTINB-niveau i SK-HEP-1-celler, der udtrykker NS shRNA- eller ATF4-shRNAs. C) ATF4- og ACTINB-proteinniveauer i SK-HEP-1-celler, der udtrykker NS shRNA eller ATF4 shRNAs. (D) NK cellemedieret cytotoksicitet blev analyseret i SK-HEP-1 celler, der udtrykker enten NS shRNA eller ATF4 shRNAs ved hjælp af LDH-metoden. Procent (%) NK cellemedieret cytotoksicitet vises. Data præsenteres som middelværdi ± SEM; ns, ikke signifikant; **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Calcein AM farvningsbaseret mikroskopisk metode til måling af NK cellemedieret cytotoksicitet. (A) Skematisk, der viser de vigtigste trin i calcein AM farvningsbaseret mikroskopisk metode til måling af NK cellemedieret cytotoksicitet. (B) NK cellemedieret cytotoksicitet blev analyseret i SK-HEP-1 celler, der udtrykker enten NS shRNA eller ATF4 shRNAs ved hjælp af calcein AM-metoden. Repræsentative billeder vises. Skalastang = 200 μm. (C) Procent af calcein AM-positive celler til eksperimentet præsenteret i panel B. ** p < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: FACS-baserede kvantitative NK celle migration assay. (A) Schematic skildrer de vigtigste trin i FACS-baserede NK celle migration assay. (B,C) NK celle migration assay blev udført efter at have tilføjet 50 ng CCL2 til det nederste kammer af 24 godt plade. (B) Repræsentative NK celle migration dot plots til kontrol eller CCL2-behandlede kultur medium er vist. C) NK-cellemigrationsdata (middel ± SEM) præsenteres for det eksperiment, der er vist i panel B. ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

De cytotoksicitets- og migrationsmetoder, der er beskrevet her, kan bruges til at evaluere NK-cellecytotoksicitet for kræftceller og NK-cellemedierede immununddragelsesmekanismer i maligne tumorer samt til at identificere terapeutiske midler, der vil forbedre NK celleaktivitet/funktion. Protokollerne er enkle, følsomme, reproducerbare, og at foretrække alternativer til klassisk radioaktivitet-baserede 51chrom frigivelse assay. Protokollerne er specielt designet til at være let tilpasselige til brug i de fleste laboratorier, med enkle kolorimetriske, mikroskopiske, eller FACS-baserede udlæsninger, der er nemme at fortolke, så forskerne kan nå pålidelige konklusioner. Alle er skalerbare til screeningbaserede tilgange med høj gennemløb. Selv om protokollerne præsenteres i forbindelse med en enkelt levercellecellelinje, kan de nemt tilpasses let til andre kræftcelletyper og/eller andre ikke-kræftmålceller.

Mens alle de fremviste metoder er robuste og reproducerbare, kan der forekomme intereksperimentel variation med forskellige partier af kræftceller og NK-celler. For at sikre, at resultaterne nøjagtigt understøtter forsøgenes konklusioner, anbefales det at gentage forsøget mindst to gange ved hjælp af biologiske treeksemplarer.

En begrænsning af denne metode er, at vækstraten for NK92MI-celler kan være langsom. Derfor bør der for forsøg med 50 prøver eller flere prøver dyrkes et tilstrækkeligt antal NK92MI på forhånd for at undgå forsinkelser. Desuden skal alle de kontroller, der er beskrevet i protokollerne, gennemføres for at undgå falske og ikke-reproducerbare resultater. En anden begrænsning af NK cytotoksicitet assay er, at NK til kræft celle forholdet, samt inkubationstiden, skal optimeres for hver målcelle. For eksempel har vi testet forskellige forhold mellem kræftceller til NK celler (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, og 1:80) for hepatic cancer cellelinjer, samt flere inkubationstider (2, 3, 4, 5 og 6 timer). Baseret på vores resultater observerede vi de mest ensartede resultater med 1:10 og 1:20 forholdet mellem kræftceller og NK-celler og inkubation i 3 timer.

Desuden vil kræftceller stammer fra solide tumorer vedhæfte og vokse på overfladen af kulturpladen, mens NK celler vokser i suspension. Hvis inkubationstiden er længere end 3 timer, er det tilrådeligt at bruge ultralav fastgørelse 96 brøndplader, hvilket vil forbedre konsistensen og reproducerbarheden mellem eksperimenter og biologiske replikater. Det er også vigtigt at bemærke, at NK celle-induceret cytotoksicitet assays også kan udføres ved hjælp af primære NK celler isoleret fra perifere blod mononukleare celler (PBPC'er). Der er imidlertid flere begrænsninger med sådanne eksperimenter. For det første kan disse eksperimenter ikke skaleres så let som med NK92MI-celler. For det andet kan batch-to-batch variation af cytotoksisk aktivitet af NK-celler isoleret fra PMBC'er være problematisk med hensyn til reproducerbarhed og fortolkning af resultaterne. På samme måde er andre humane NK-cellelinjer beskrevet i litteraturen og kan anvendes i disse typer forsøg, herunder NKL-cellerne29; I modsætning til NK-92MI-celler er NKL-celler imidlertid IL-2 afhængige og ikke kommercielt tilgængelige.

Når man overvejer calcein AM eksperimenter beskrevet, er det vigtigt at bemærke, at calcein AM forbliver i apoptotiske organer efter celledød30. Derfor bør kvantitationen af calcein AM farvning udføres omhyggeligt, da det kan føre til en undervurdering af NK cytotoksicitet.

I lighed med NK cellemedieret cytotoksicitet spiller graduering af NK-cellemigration fra cytokiner og andre kemoattractanter en vigtig rolle i reguleringen af NK-cellefunktionen. NK celle migration analyse beskrevet her giver en enkel platform til at evaluere NK celle migration i forbindelse med en stimulus såsom en chemokine eller kemoattractant. Denne analyse kan bruges til at evaluere agenter, der enten kan fremme eller forstyrre NK celle migration - således at identificere smagsforstærkere og undertrykkere af NK celle migration. Denne metode kan også være nyttig til at undersøge NK-cellemigrationsreguleringskapaciteten som følge af genetiske/epigenetiske ændringer (upregulation eller downregulation) eller som følge af narkotikabehandling.

For præcist at måle NK celle migration, er der få kritiske skridt, der bør følges. For alle forsøg med konditioneret medium er det vigtigt, at tilsvarende konditioneret medium anvendes fra både kontrol- og behandlingsbetingelser for at opnå nøjagtige målinger. Inkubationstiden vil blive varieret med rensede kemoattractants og konditioneret medium. Endelig er transwell migration assays veletablerede og betragtes som en glimrende metode til at vurdere NK celle migration; men de homogene monokulturer, der anvendes i analyserne mangler den komplekse fysiologi af væv eller endda 3D-kulturer, der mere præcist kan efterligne tumor mikromiljøet.

Selv om der er visse begrænsninger for NK-cellecytotoksicitetsanalyserne og NK-migrationsanalysen, der præsenteres i denne artikel, gælder disse analyser således for en lang række immunologiske undersøgelser og giver dermed vigtige og pålidelige metoder til vurdering af NK-cellen funktion og NK celle modulerende immunterapi.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender taknemmeligt tilskud fra National Institutes of Health: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) og 1R01 CA218008-01A1 (NW). Vi anerkender også Department of Defense finansiering W81XWH1910480 og W81XWH-18-1-0069 til NW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute counting beads Thermo Fisher Scientific C36950
Alpha-MEM Sigma-Aldrich M4256
Amicon ultra Centrifugal filters Millipore UFC900324
Calcein AM dye Sigma-Aldrich 17783
DMEM Gibco 11965-092
Fetal Bovine Serum Gibco 26140079
Folic Acid Sigma-Aldrich F8758
Horse Serum Gibco 16050114
L-Glutamine (200 mM) Gibco 2530081
LDH cytotoxic assay Kit Thermo Fisher Scientific 88953
myo-Inositol Sigma-Aldrich I5125
NK92MI cells ATCC CRL-2408
Opti-MEM Gibco 31985070
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
SKHEP-1 Cells ATCC HTB-52
Transwell permeable chambers Costar 3241
Trypsin EDTA solution Gibco 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiossone, L., Dumas, P. Y., Vienne, M., Vivier, E. Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer. Nature Reviews Immunology. 18 (11), 671-688 (2018).
  2. Borghaei, H., Smith, M. R., Campbell, K. S. Immunotherapy of cancer. European Journal of Pharmacology. 625 (1-3), 41-54 (2009).
  3. Kalbasi, A., Ribas, A. Tumour-intrinsic resistance to immune checkpoint blockade. Nature Reviews Immunology. , (2019).
  4. Zhang, Q., Cao, X. Epigenetic regulation of the innate immune response to infection. Nature Reviews Immunology. 19 (7), 417-432 (2019).
  5. Janeway, C. A. Jr The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunol Today. 13 (1), 11-16 (1992).
  6. Natoli, G., Ostuni, R. Adaptation and memory in immune responses. Nature Immunology. 20 (7), 783-792 (2019).
  7. Cooper, M. D., Alder, M. N. The evolution of adaptive immune systems. Cell. 124 (4), 815-822 (2006).
  8. Riera Romo, M., Perez-Martinez, D., Castillo Ferrer, C. Innate immunity in vertebrates: an overview. Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).
  9. Sonnenberg, G. F., Hepworth, M. R. Functional interactions between innate lymphoid cells and adaptive immunity. Nature Reviews Immunology. 19 (10), 599-613 (2019).
  10. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  11. Shi, F. D., Ljunggren, H. G., La Cava, A., Van Kaer, L. Organ-specific features of natural killer cells. Nature Reviews Immunology. 11 (10), 658-671 (2011).
  12. Trapani, J. A., Davis, J., Sutton, V. R., Smyth, M. J. Proapoptotic functions of cytotoxic lymphocyte granule constituents in vitro and in vivo. Current Opinion in Immunology. 12 (3), 323-329 (2000).
  13. Krzewski, K., Strominger, J. L. The killer's kiss: the many functions of NK cell immunological synapses. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 597-605 (2008).
  14. Berke, G. The binding and lysis of target cells by cytotoxic lymphocytes: molecular and cellular aspects. Annual Review of Immunology. 12, 735-773 (1994).
  15. Abel, A. M., Yang, C., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Natural Killer Cells: Development, Maturation, and Clinical Utilization. Frontiers in Immunology. 9, 1869 (2018).
  16. Zamai, L., et al. Natural killer (NK) cell-mediated cytotoxicity: differential use of TRAIL and Fas ligand by immature and mature primary human NK cells. Journal of Experimental Medicine. 188 (12), 2375-2380 (1998).
  17. Marcus, A., et al. Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells. Advances in Immunology. 122, 91-128 (2014).
  18. Vesely, M. D., Kershaw, M. H., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. Natural innate and adaptive immunity to cancer. Annual Review of Immunology. 29, 235-271 (2011).
  19. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  20. Bryceson, Y. T., et al. A prospective evaluation of degranulation assays in the rapid diagnosis of familial hemophagocytic syndromes. Blood. 119 (12), 2754-2763 (2012).
  21. Shabrish, S., Gupta, M., Madkaikar, M. A Modified NK Cell Degranulation Assay Applicable for Routine Evaluation of NK Cell Function. Journal of Immunology Research. 2016, 3769590 (2016).
  22. Pietra, G., et al. Melanoma cells inhibit natural killer cell function by modulating the expression of activating receptors and cytolytic activity. Cancer Research. 72 (6), 1407-1415 (2012).
  23. Fehniger, T. A., et al. Potential mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy. Journal of Clinical Investigation. 106 (1), 117-124 (2000).
  24. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  25. Roder, J. C., et al. A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells. Nature. 284 (5756), 553-555 (1980).
  26. Byrd, A., Hoffmann, S. C., Jarahian, M., Momburg, F., Watzl, C. Expression analysis of the ligands for the Natural Killer cell receptors NKp30 and NKp44. PLoS One. 2 (12), e1339 (2007).
  27. Nitahara, A., et al. NKG2D ligation without T cell receptor engagement triggers both cytotoxicity and cytokine production in dendritic epidermal T cells. Journal of Investigative Dermatology. 126 (5), 1052-1058 (2006).
  28. Gowen, B. G., et al. A forward genetic screen reveals novel independent regulators of ULBP1, an activating ligand for natural killer cells. Elife. 4, e08474 (2015).
  29. Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
  30. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).

Tags

Medicin NK celler kræft migration cytotoksicitet transskription faktorer flow cytometri
Måling af natural killer celle-medieret cytotoksicitet og migration i forbindelse med levercellede celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chava, S., Bugide, S., Gupta, R.,… More

Chava, S., Bugide, S., Gupta, R., Wajapeyee, N. Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells. J. Vis. Exp. (156), e60714, doi:10.3791/60714 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter