Summary
Unndragelse av naturlig morder (NK) cellemediert utryddelse av kreftceller er viktig for kreftinitiering og progresjon. Her presenterer vi to ikke-radioaktivitetsbaserte protokoller for å evaluere NK cellemediert cytotoksisitet mot levertumorceller. I tillegg presenteres en tredje protokoll for å analysere NK-celleoverføring.
Abstract
Naturlige killer (NK) celler er en undergruppe av cytotoksiske lymfocyttpopulasjonen i det medfødte immunsystemet og delta som en første forsvarslinje ved å rydde patogen-infiserte, ondartede og stressede celler. Evnen til NK-celler til å utrydde kreftceller gjør dem til et viktig verktøy i kampen mot kreft. Flere nye immunbaserte behandlinger er under etterforskning for kreftbehandling som er avhengige av å forbedre NK celleaktivitet eller øke følsomheten til kreftceller til NK cellemediert utryddelse. Men for å effektivt utvikle disse terapeutiske tilnærmingene, er det også nødvendig med kostnadseffektive in vitro-analyser for å overvåke NK cellemediert cytotoksisitet og migrasjon. Her presenterer vi to in vitro-protokoller som pålitelig og reproduserereffekten av NK-cellecytotoksisitet på kreftceller (eller andre målceller). Disse protokollene er ikke-radioaktivitetsbaserte, enkle å sette opp, og kan skaleres opp for screening med høy gjennomstrømning. Vi presenterer også en flow cytometribasert protokoll for å kvantitativt overvåke NK cellemigrasjon, som også kan skaleres opp for høy gjennomstrømning screening. Samlet kan disse tre protokollene brukes til å overvåke viktige aspekter ved NK-celleaktivitet som er nødvendige for cellenes evne til å utrydde dysfunksjonelle målceller.
Introduction
Menneskekroppens evne til å identifisere ikke-selv og utrydde fremmedlegemer er nøkkelen til menneskelig overlevelse mot patogener og maligniteter1. Den menneskelige immunresponsen spiller den viktigste rollen i denne prosessen2,3,4. Basert på viktige egenskaper og funksjoner, kan det menneskelige immunsystemet være bredt klassifisert i to store funksjonelle grupper: det adaptive immunforsvaret og det medfødte immunsystemet. Det adaptive immunforsvaret er vanligvis spesifikt for et gitt patogen og har immunologisk minne og dermed er langvarig og responsiv til fremtidig reinfeksjon av samme patogen5,6,7,8,9. I motsetning er medfødt immunitet mye bredere i sin målutryddelse og relativt uspesifikk. Derfor tjener den medfødte immunresponsen som den første linjen av immunologisk forsvar10. Naturlige killer (NK) celler tilhører det medfødte immunsystemet og representerer 10-15% av totalt sirkulerende lymfocytter11. NK-celler utrydder målceller via to hovedmekanismer. Først, ved binding til målceller som uttrykker aktivering av ligander, slipper NK-celler det membranforstyrrende proteinet perforin og serinprotease granzymer gjennom exocytose, som i fellesskap induserer apoptose i målceller12,13,14,15. I tillegg, NK celler som uttrykker FasL og tumor nekrose faktor-relaterte apoptose-inducing ligand (TRAIL) samhandle med målceller som uttrykker dødreseptorer (Fas / CD95), fører til caspase-avhengig apoptose16. Viktigst av alt, NK-celler krever ikke prestimulering, for eksempel antigenpresentasjon, for å utrydde patogene infiserte eller ondartede celler; dermed er de vanligvis i en klar til å drepe tilstand17,18. For å hemme tumorutvikling og progresjon og utrydde kreftceller, må NK-celler migrere til tumorstedet og, en gang i tumormikromiljøet, identifisere og angripe målcellene.
Tidligere ble NK-celleeffektorfunksjoner hovedsakelig overvåket av degranulering og cytotoksisitetsanalyser19,20,21. NK celle cytotoksisitet kan også måles med 51krom utgivelsen analyse22,23,24,25. Denne analysen har imidlertid noen spesifikke krav, inkludert behovet for en gammateller, og er radioaktivitetsbasert, noe som krever opplæring i håndtering og avhending av radioaktive materialer og utgjør et risikonivå for brukeren. Derfor er flere nye ikke-radioaktivitetsbaserte analyser utviklet og ansatt for å studere NK-celleaktivitet.
Her beskriver vi to slike protokoller, koloimetrisk laktisk dehydrogenase (LDH) målebasert NK cellemediert cytotoksisitetanalyse og kalsinacetoktyl (AM) fargingsbasert mikroskopisk metode for å måle NK cellemediert kreftcelleutryddelse. Disse analysene krever ikke bruk av radioisotoper, er enkle, følsomme og reproduserbare identifisere faktorer som modulerer NK cellefunksjon. I tillegg, fordi NK-cellefunksjonen ikke kan evalueres fullt ut uten å overvåke endringer i NK-cellemigrasjon, presenterer vi også en flytcytometribasert kvantitativ metode for å overvåke NK-cellemigrasjon.
Protocol
1. Utarbeidelse av kultur medium for NK celler og levertumorceller
- Bruk humane naturlige morderceller (f.eks. NK92MI) og cellecellelinjen for leverkreft (f.eks. SK-HEP-1).
- Forbered NK cellekulturmedium for NK92MI humannk celler ved å legge til følgende komponenter til 500 ml minimum essensielle medium Eagle alfa uten ribonucleosides og deoxyribonucleosides til de angitte endelige konsentrasjonene: 0,02 mM folsyre (100 μL av 100 mM folsyre), 0,2 mM myoinositol (500 μL av 200 mM myo myo myo myo myo myo myomyo myomyo myomyomyo myo myo myo myo myo myo myo myo myo myomyo myo myo myo myo myomyomyomyo myomyo myomyo myomyo myomyo myomyomyo myomyo myo myo myo myo myo myo myomyo inositol), 0,1 mM β-merkaptoetanol (3,5 μL av 14,3 M β-merkaptoetanol), 2 mM L-glutamin (5 ml 200 m L-glutamin), 1 % penicillin/streptomycin (5 ml 100x penicillin/streptomycin), 12,5 % fosterstorfe serum (FBS) og 12,5 % hesteserum. Bland og filtrer steriliser ved hjelp av en 0,22 μm steril filtreringsenhet, og oppbevar ved 4 °C.
- Forbered kulturmedium for hepatisk tumorcellelinje SK-HEP-1 ved å legge til 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin til høyglukose Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) som inneholder 2 mM L-glutamin.
2. Fargetrimetrisk LDH Måling-basert NK Cell-mediert Cytotoxicity Analyse
- Vokse SK-HEP-1 celler til 70-80% samflyt i en 100 mm cellekultur Petri parabolen i 5% CO2 ved 37 ° C i en CO2 inkubator. Generer en encellede suspensjon ved første vasking av celler med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) etterfulgt av inkubasjon med 1 ml 0,25 % trypsin-EDTA i 5 % CO2 ved 37 °C i en CO2-inkubator til en enkeltcellesuspensjon genereres.
MERK: NK celleaktivitet kan induseres av stressede kreftceller på grunn av endringer i uttrykket av NK celleaktiverende ligand i kreftceller. Derfor bør friske og underkonfluent kreftceller brukes til nøyaktige resultater. Det er også viktig å merke seg at NK celle reseptorer og ligands kan være følsomme for trypsinization26,27. Derfor bør trypsiniseringsprotokollen være nøye optimalisert og overdreven trypsinisering bør unngås. - Etter trypsinisering, tilsett 10 ml SK-HEP-1 kulturmedium og sentrifuge på 160 x g i 3 min i et 15 ml sterilt konisk sentrifugerør. Vask cellepelleten med 5 ml 1x PBS og resuspender i 5 ml kulturmedium.
- Parallelt, sentrifuge NK92MI cellene på 160 x g i 3 min i en 15 ml steril sentrifuge rør. Vask cellepellet en 5 ml 1x PBS og resuspender i 5 ml NK92MI cellekulturmedium.
MERK: NK92MI-celler dyrkes i NK-cellekulturmedium og oppnås på samme måte som beskrevet i trinn 2.1. - Tell SK-HEP-1- og NK92MI-cellene ved hjelp av et hemocytometer eller en tilgjengelig automatisert celleteller.
- Legg til SK-HEP-1 celler (målceller) (1 x 104/100 μL/brønn) og NK92MI celler (effektorceller) (1 x 105/100 μL/well) i forholdet mellom 1:10 mål:effector og frø i triplicate brønner i en 96 brønnplate.
- Inkuber 96 brønnplate ved 37 °C i en atmosfære på 95 % luft og 5 % CO2 i 3 timer. Etter inkubasjon en sentrifugeplate ved 450 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Uten å forstyrre cellepellet, samle 100 μL supernatant fra hver brønn og overføre til en brønn i en ny 96 brønnplate.
- Tilsett 50 μL LDH substrat, bland godt, og inkuber platen i 20 min ved romtemperatur i mørket.
- Stopp reaksjonen ved å tilsette 50 μL stoppoppløsning (50 % dimetylformamid og 20 % natriumdodesfat ved pH 4,7). Mål umiddelbart absorbansen av platen ved 490 nm og 680 nm ved hjelp av en plateleser.
- Trekk absorbansen ved 680 nm fra absorbansen ved 490 nm. Beregn prosenten (%) NK celle cytotoksisitet ved hjelp av formelen nedenfor.
der LDH eksperimentelle (effektor + målceller) er absorbansen av NK92MI-celler og SK-HEP-1-celler, LDH-effektorceller er absorbansen av NK92MI-celler alene, LDH spontan er absorbansen av SK-HEP-1-celler alene, og LDH maximal er absorbansen av SK-HEP-1 celler med lysebuffer.
MERK: For å redusere serumforstyrrelser, bruk alltid følgende kontroller: målceller alene (SK-HEP-1), effektorceller alene (NK92MI), målceller med lysisbuffer som en fullstendig lysiskontroll, målcellemedium, NK92MI-medium, samt målcellemedium og NK92MI medium i forholdet 1:1.
3. Calcein AM Fargingsbasert mikroskopisk metode for måling av NK Cell-mediert cytotoksisitet
- Kultur SK-HEP-1 celler til 70-80% samflyt. Generer en encellede suspensjon ved første vaskceller med 5 ml 1x PBS etterfulgt av inkubasjon med 1 ml 0,25% trypsin-EDTA.
- Sentrifuge SK-HEP-1 celler i en 1 ml steril sentrifuge rør på 160 x g i 3 min. Resuspenderpellet i 3 ml serumfri DMEM.
- Tilsett 1,5 μL calcein AM-oppløsning (10 mM) til SK-HEP-1-celler og inkuber i 30 min ved romtemperatur. Sentrifugecalcein AM-merket SK-HEP-1 celler ved 160 x g i 3 min i en 15 ml steril sentrifugerør.
- Vask celler to ganger med 5 ml 1x PBS for å fjerne overflødig kalsin AM-fargen.
- Parallelt, sentrifuge NK92MI celler på 160 x g i 3 min i en 15 ml steril sentrifuge rør. Vask cellepellet en gang med 5 ml 1x PBS og resuspender i 5 ml NK92MI cellemedium.
- Telle calcein AM-merket SK-HEP-1 celler og NK92MI celler ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert celleteller.
- Resuspender SK-HEP-1 celler i kulturmedium ved 1 x 105 celler/ ml og NK92MI celler ved 1 x 106 celler / ml i NK cellemedium.
- Plate calcein AM-merket SK-HEP-1 celler (målceller) (1 x 104/100 μL/brønn) med NK92MI celler (effektorceller) (1 x 105/100 μL/brønn) (1:10 mål:effektor ratio) per brønn i triplicate brønner i en 96 brønnplate.
- Inkuber 96 brønnplate ved 37 °C i en atmosfære på 95 % luft og 5 % CO2 i 4 timer. Etter inkubasjon, ta fluorescensbilder av calcein AM-merkede celler ved hjelp av et fluorescensmikroskop ved 10x forstørrelse. Fang opp minst 10 forskjellige felt av hver replikating for hver behandlingstilstand.
- Velg tilfeldig 10 bilder for hver replikering og tell calcein AM-positive merkede målceller inkubert med eller uten NK92MI-celler. Beregn % cytotoksisitet ved hjelp av formelen nedenfor.
MERK: Som kontroller, bruk målceller uten NK92MI-celler og fullstendig lysed målceller som fullstendig lysiskontroll. For fullstendig lysis, inkuber cellene i 0,5% Triton X-100 for 1 t (20 μL av 5% Triton X-100 i 200 μL kulturmedier).
4. NK celle migrasjon analyse
- Vokse NK92MI celler og sentrifugeceller på 160 x g i 3 min i en 15 ml steril sentrifuge rør.
- Vask cellepellettoganger med 5 ml 1x PBS og resuspender cellene i 3 ml serumfritt NK92MI cellemedium. Tell NK92MI-celler ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert celleteller.
- Plate NK92MI celler (2,5 x 105 celler/100 μL/brønn) i det øvre rommet av transwell permeable kammer (6,5 mm diameter innsats og 5 μm pore størrelse).
- I bunnkammeret legge 0,6 ml serum-fri medium som inneholder materiale som skal testes for NK celle kjemoattractant egenskaper (f.eks, betinget medium, chemokines, cytokiner).
MERK: Når du klargjør betinget medium, bruk redusert serummedium uten tilsatt serum for å eliminere interferens fra serumproteiner i migrasjonsanalysen. - Inkuber de 24 godt gjennomtrengelige kamrene ved 37 °C i 4 timer. Etter 4 timer, samle de ikke-tilhenger og migrerte NK92MI celler fra bunnkammeret og overføre dem til fluorescensaktivertcellesortering (FACS) rør for videre analyse.
MERK: Kulturtiden kan variere avhengig av type målceller, samt mengden og kinetikken til chemokiner produsert av målcellene. Derfor bør denne gangen bestemmes empirisk for hver celletype, chemokine og eksperiment. - Tilsett forhåndsbestemt antall telleperler for flytcytometri i et volum på 50 μL til hvert rør som inneholder migrerte NK-celler. Evaluer volumet på 300 μL/brønncelleoppheng ved hjelp av et strømningscytometer som kan automatiseres FACS-basert celletelling.
MERK: Bland eller vortex-bland telleperlene for flow cytometri grundig hver gang før bruk for å sikre at et konstant antall perler brukes til å minimere eksperimentell variasjon. Omvendt pipettering anbefales med telleperler for å opprettholde nøyaktigheten. Bruk bare NK-celler og telleperler for flytcytometri som FACS-analysekontroller. Forfatterne anbefaler å lese minst 10.000 perler + NK celler kombinert, en mengde som har fungert bra. Dette tallet kan imidlertid variere avhengig av de eksperimentelle forholdene. Derfor bør det kombinerte antallperler + NK-celler bestemmes empirisk for hver type eksperiment. I tillegg er det viktig å utføre eksperimenter ved hjelp av biologiske triplisiater for å oppnå statistisk signifikante resultater og å ta hensyn til variasjon mellom ulike celletellinger. - Beregn absolutt antall overførte NK92MI-celler ved hjelp av denne formelen:
der A = antall celler, B = antall perler, C = tildelt perleantall av tomten (antall telleperler for flyt cytometri/50 μL; i dette eksemplet 49 500) og D = volum av prøve (μL).
MERK: Hvis 300 μL prøvevolum (migrerte celler) brukes til FACS-analyse med 50 μL telleperler for flytcytometri, det absolutte antallet overførte celler = 1700 celler /3300 perlehendelser x 49 500 perler/300 μL = 84.975 celler/μL. Beregningen bør korrigeres hvis prøven fortynnes eller hvis et annet volum facs telleperler brukes.
Representative Results
NK celle cytotoxicity analyser og NK celle migrasjon analyse ble utført ved hjelp av SK-HEP-1 hepatisk tumor cellelinje som et modellsystem. For å måle NK-cellecytotoksisitet ved hjelp av LDH-analysen, ble SK-HEP-1-celler som uttrykte enten en uspesifikk (NS) shRNA eller shRNA rettet mot aktivering av transkripsjonsfaktor 4 (ATF4) inkubert med NK92MI-celler i en 96 brønnplate i 3 timer (figur 1A). ATF4 har tidligere vist seg å regulere NK celle cytotoksisitet ved å oppregulere aktivere ligand ULBP128. LDH-aktivitet forbundet med CELLEmediert celledrap på NK ble målt kolormetrisk, og prosent cytotoksisitet beregnet ved hjelp av formelen som er beskrevet i protokoll 1. ATF4 knockdown signifikant redusert NK cellemediert cytotoksisitet sammenlignet med NK-celler som uttrykker NS shRNA (Figur 1B-D). Vi målte også NK-cellecytotoksisitet ved hjelp av en calcein AM-fargebasert analyse. For dette formål ble SK-HEP-1-celler som uttrykte NS shRNA eller ATF4-målretting shRNAs merket med calcein AM og inkubert med NK92MI-celler i 96 brønnplater i 4 timer som illustrert i figur 2A. Etter inkubasjon ble bilder av calcein AM-positive celler fanget av fluorescensmikroskopi ved hjelp av et FITC/GFP-filter. Celler drept av NK-celler oppdages ikke av denne tilnærmingen fordi de ikke lenger beholder calcein AM-fargen. Som vist i figur 2B,Creduseres antall calcein AM-positive SK-HEP-1-celler etter samtidig kultur med NK92MI-celler sammenlignet med SK-HEP-1-celler dyrket uten NK92MI-celler. Som forventet reduserte imidlertid ATF4-knockdown via shRNA NK cellemediert drap på SK-HEP-1-celler, observert av et større antall calcein AM-positive celler (figur 2B,C). Derfor viste både LDH-baserte og calcein AM-analyser konsistente resultater og bekreftet at ATF4-knockdown reduserer NK-mediert kreftcellecytotoksisitet. En av disse analysene er tilstrekkelig til å vurdere NK cellemediert cytotoksisitet; Vi anbefaler imidlertid å bruke begge metodene til å øke både stringency og tillit til resultatene.
Vi presenterer også resultatene av en 24 brønn NK celle migrasjon analyse. NK92MI-celler ble resuspendert i serumfritt NK92MI-medium i det øvre kammeret, og chemokine, CC-motiv, ligand 2 (CCL2) ble lagt til det nedre gjennomtrengelige kammeret. NK cellemigrasjon ble besagt som beskrevet i avsnitt 3 (Figur 3A). Antall et migrert NK92MI-celler ble kvantifisert ved å legge til telleperler for flytcytometri og etterfulgt av FACS-analyse. Som vist i figur 3B-Cvar det en betydelig økning i antall NK92MI-celler som hadde migrert mot CCL2-holdig medium sammenlignet med kontrollmedium.
Figur 1: Fargelærrisk LDH aktivitetsbasert NK cellemediert cytotoksisitetsanalyse. (A) Skjematisk skildrer de viktigste trinnene i colorimetric LDH aktivitetsbasert NK celle cytotoksisitet analyse. - Jeg har ikke noe åsi. ATF4-uttrykk ble analysert i SK-HEP-1-celler som uttrykte enten uspesifikke (NS) shRNA eller shRNAs rettet mot ATF4 ved kvantitativRT-PCR og vestlig blotting. (B) Relativ ATF4 mRNA-nivå er vist etter normalisering til ACTINB-nivå i SK-HEP-1-celler som uttrykker NS shRNA eller ATF4 shRNAs. (C) ATF4 og ACTINB proteinnivåer i SK-HEP-1 celler som uttrykker NS shRNA eller ATF4 shRNAs. (D) NK cellemediert cytotoksisitet ble analysert i SK-HEP-1-celler som uttrykte enten NS shRNA eller ATF4 shRNAs av LDH-metoden. Prosent (%) NK cellemediert cytotoksisitet er vist. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM; ns, ikke signifikant; **p < 0,01, ***p < 0,001. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Calcein AM fargingsbasert mikroskopisk metode for måling av NK cellemediert cytotoksisitet. (A) Skjematisk skildrer de viktigste trinnene i calcein AM farging-basert mikroskopisk metode for måling av NK cellemediert cytotoksisitet. (B) NK cellemediert cytotoksisitet ble analysert i SK-HEP-1-celler som uttrykte enten NS shRNA eller ATF4 shRNAs ved hjelp av calcein AM-metoden. Representative bilder vises. Skala bar = 200 μm. (C)Prosent av calcein AM-positive celler for eksperimentet som presenteres i panel B. ** p < 0,01. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: FACS-basert kvantitativ NK-cellemigrasjonsanalyse. (A) Skjematisk skildrer de viktigste trinnene i FACS-baserte NK celle migrasjon analyse. - Jeg har ikke noe åsi. NK celle migrasjon analyse ble utført etter å legge 50 ng av CCL2 til bunnkammeret av 24 brønnplate. (B) Representative NK celle migrering dot tomter for kontroll eller CCL2-behandlet kultur medium vises. (C) NK celle overføringsdata (gjennomsnitt ± SEM) presenteres for eksperimentet som vises i panel B. *** p < 0,001. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Discussion
Cytotoksisitets- og migrasjonsmetodene som er beskrevet her, kan brukes til å evaluere NK-cellecytotoksisitet til kreftceller og NK cellemedierte immununndragelsesmekanismer i ondartede svulster, samt å identifisere terapeutiske midler som vil forbedre NK celleaktivitet/funksjon. Protokollene er enkle, følsomme, reproduserbare og fortrinnsvis alternativer til klassisk radioaktivitetsbasert 51kromutgivelsesanalyse. Protokollene er spesielt utformet for å være lett tilpasningsdyktige for bruk i de fleste laboratorier, med enkle kolormetriske, mikroskopiske eller FACS-baserte avlesninger som er enkle å tolke, slik at forskere kan nå pålitelige konklusjoner. Alle er skalerbare for screeningbaserte tilnærminger med høy gjennomstrømning. Selv om protokollene presenteres i sammenheng med en enkelt hepatisk tumorcellelinje, kan de enkelt tilpasses lett til andre kreftcelletyper og/eller andre ikke-kreftmålceller.
Mens alle metodene som presenteres er robuste og reproduserbare, kan intereksperimentell variasjon oppstå med forskjellige grupper av kreftceller og NK-celler. For å sikre at resultatene nøyaktig støtter konklusjonene i forsøkene, er det tilrådelig å gjenta eksperimentet minst to ganger ved hjelp av biologiske triplisetter.
En begrensning av denne metoden er at veksten av NK92MI-celler kan være treg. Derfor, for eksperimenter med 50 eller flere prøver, bør tilstrekkelig antall NK92MI dyrkes på forhånd for å forhindre forsinkelser. Også alle kontrollene som er beskrevet i protokollene må implementeres for å unngå falske og ikke-reproduserbare resultater. En annen begrensning av NK cytotoksisitetanalyse er at NK til kreftcelleforholdet, samt inkubasjonstiden, må optimaliseres for hver målcelle. For eksempel har vi testet ulike forhold mellom kreftceller og NK-celler (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 og 1:80) for hepatiske kreftcellelinjer, samt flere inkubasjonstider (2, 3, 4, 5 og 6 timer). Basert på våre resultater observerte vi mest konsistente resultater med 1:10 og 1:20 prosentav kreftceller til NK-celler og inkubasjon i 3 timer.
I tillegg vil kreftceller avledet fra faste svulster feste og vokse på overflaten av kulturplaten, mens NK-celler vokser i suspensjon. Hvis inkubasjonstiden er lengre enn 3 timer, anbefales det å bruke ultralave vedlegg 96 brønnplater, noe som vil forbedre konsistensen og reproduserbarheten mellom eksperimenter og biologiske replikater. Det er også viktig å merke seg at NK celleindusert cytotoksisitet si kan også utføres ved hjelp av primære NK-celler isolert fra perifere blod mononukleære celler (PBMCs). Det er imidlertid flere begrensninger med slike eksperimenter. For det første kan disse eksperimentene ikke skaleres like enkelt som med NK92MI-celler. For det andre kan batch-til-batch-variasjon av cytotoksisk aktivitet av NK-celler isolert fra PMBCer være problematisk når det gjelder reproduserbarhet og tolkning av resultatene. På samme måte er andre menneskelige NK-cellelinjer beskrevet i litteraturen og kan brukes i disse typer eksperimenter, inkludert NKL-celler29; I motsetning til NK-92MI-celler er Imidlertid NKL-celler IL-2 avhengige og ikke kommersielt tilgjengelige.
Når du vurderer calcein AM eksperimenter beskrevet, er det viktig å merke seg at calcein AM forblir i apoptotiske organer etter celledød30. Derfor bør mengden av calcein AM farging utføres nøye, da det kan føre til en undervurdering av NK cytotoksisitet.
I likhet med NK cellemediert cytotoksisitet spiller modulasjon av NK-cellemigrasjon av cytokiner og andre kjemoattractanter en viktig rolle i reguleringen av NK-cellefunksjonen. NK celle migrasjon analyse beskrevet her gir en enkel plattform for å evaluere NK celle migrasjon i sammenheng med en stimulans som en chemokine eller kjemoattractant. Denne analysen kan brukes til å evaluere agenter som enten kan fremme eller forstyrre NK-cellemigrasjon - og dermed identifisere enhancers og repressors av NK cellemigrasjon. Denne metoden kan også være nyttig å studere NK celle migrasjon regulatoriske kapasitet som følge av en genetisk / epigenetiske endringer (upregulation eller downregulation) eller oppstår på grunn av narkotikabehandling.
For å måle NK-cellemigrasjonen nøyaktig, er det få kritiske trinn som bør følges. For alle forsøkene ved hjelp av betinget medium er det viktig at tilsvarende betinget medium brukes fra både kontroll- og behandlingsforhold for å oppnå nøyaktige målinger. Inkubasjonstiden vil bli variert med rensede kjemoattractanter og betinget medium. Til slutt er transwell migrasjon analyser godt etablert og betraktet som en utmerket metode for å vurdere NK celle migrasjon; Imidlertid mangler de homogene monokulturene som brukes i analyser den komplekse fysiologien til vev eller til og med 3D-kulturer som mer nøyaktig kan etterligne tumormikromiljøet.
Dermed, selv om det er noen begrensninger for NK-cellecytotoksisitetsanalysene og NK-migrasjonsanalysen som presenteres i denne artikkelen, gjelder disse analysene for et bredt spekter av immunologiske studier og gir dermed viktige og pålitelige metoder for å vurdere NK-celle og NK celle modulatoriske immunterapier.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner takknemlig tilskudd fra National Institutes of Health: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) og 1R01 CA218008-01A1 (NW). Vi anerkjenner også Forsvarsdepartementets finansiering W81XWH1910480 og W81XWH-18-1-0069 til NW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute counting beads | Thermo Fisher Scientific | C36950 | |
| Alpha-MEM | Sigma-Aldrich | M4256 | |
| Amicon ultra Centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Calcein AM dye | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050114 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 2530081 | |
| LDH cytotoxic assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
| NK92MI cells | ATCC | CRL-2408 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| SKHEP-1 Cells | ATCC | HTB-52 | |
| Transwell permeable chambers | Costar | 3241 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25200056 |
References
- Chiossone, L., Dumas, P. Y., Vienne, M., Vivier, E. Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer. Nature Reviews Immunology. 18 (11), 671-688 (2018).
- Borghaei, H., Smith, M. R., Campbell, K. S. Immunotherapy of cancer. European Journal of Pharmacology. 625 (1-3), 41-54 (2009).
- Kalbasi, A., Ribas, A. Tumour-intrinsic resistance to immune checkpoint blockade. Nature Reviews Immunology. , (2019).
- Zhang, Q., Cao, X. Epigenetic regulation of the innate immune response to infection. Nature Reviews Immunology. 19 (7), 417-432 (2019).
- Janeway, C. A. Jr The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunol Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Natoli, G., Ostuni, R. Adaptation and memory in immune responses. Nature Immunology. 20 (7), 783-792 (2019).
- Cooper, M. D., Alder, M. N. The evolution of adaptive immune systems. Cell. 124 (4), 815-822 (2006).
- Riera Romo, M., Perez-Martinez, D., Castillo Ferrer, C. Innate immunity in vertebrates: an overview. Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).
- Sonnenberg, G. F., Hepworth, M. R. Functional interactions between innate lymphoid cells and adaptive immunity. Nature Reviews Immunology. 19 (10), 599-613 (2019).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Shi, F. D., Ljunggren, H. G., La Cava, A., Van Kaer, L. Organ-specific features of natural killer cells. Nature Reviews Immunology. 11 (10), 658-671 (2011).
- Trapani, J. A., Davis, J., Sutton, V. R., Smyth, M. J. Proapoptotic functions of cytotoxic lymphocyte granule constituents in vitro and in vivo. Current Opinion in Immunology. 12 (3), 323-329 (2000).
- Krzewski, K., Strominger, J. L. The killer's kiss: the many functions of NK cell immunological synapses. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 597-605 (2008).
- Berke, G. The binding and lysis of target cells by cytotoxic lymphocytes: molecular and cellular aspects. Annual Review of Immunology. 12, 735-773 (1994).
- Abel, A. M., Yang, C., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Natural Killer Cells: Development, Maturation, and Clinical Utilization. Frontiers in Immunology. 9, 1869 (2018).
- Zamai, L., et al. Natural killer (NK) cell-mediated cytotoxicity: differential use of TRAIL and Fas ligand by immature and mature primary human NK cells. Journal of Experimental Medicine. 188 (12), 2375-2380 (1998).
- Marcus, A., et al. Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells. Advances in Immunology. 122, 91-128 (2014).
- Vesely, M. D., Kershaw, M. H., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. Natural innate and adaptive immunity to cancer. Annual Review of Immunology. 29, 235-271 (2011).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Bryceson, Y. T., et al. A prospective evaluation of degranulation assays in the rapid diagnosis of familial hemophagocytic syndromes. Blood. 119 (12), 2754-2763 (2012).
- Shabrish, S., Gupta, M., Madkaikar, M. A Modified NK Cell Degranulation Assay Applicable for Routine Evaluation of NK Cell Function. Journal of Immunology Research. 2016, 3769590 (2016).
- Pietra, G., et al. Melanoma cells inhibit natural killer cell function by modulating the expression of activating receptors and cytolytic activity. Cancer Research. 72 (6), 1407-1415 (2012).
- Fehniger, T. A., et al. Potential mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy. Journal of Clinical Investigation. 106 (1), 117-124 (2000).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Roder, J. C., et al. A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells. Nature. 284 (5756), 553-555 (1980).
- Byrd, A., Hoffmann, S. C., Jarahian, M., Momburg, F., Watzl, C. Expression analysis of the ligands for the Natural Killer cell receptors NKp30 and NKp44. PLoS One. 2 (12), e1339 (2007).
- Nitahara, A., et al. NKG2D ligation without T cell receptor engagement triggers both cytotoxicity and cytokine production in dendritic epidermal T cells. Journal of Investigative Dermatology. 126 (5), 1052-1058 (2006).
- Gowen, B. G., et al. A forward genetic screen reveals novel independent regulators of ULBP1, an activating ligand for natural killer cells. Elife. 4, e08474 (2015).
- Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
