Vi beskriver en metode for retrograd sporing av Drosophila embryonale motor neurons bruker lipofile fluorescerende fargestoffer.
Vi beskriver en teknikk for retrograd merking av motor neurons i Drosophila. Vi bruker en olje-oppløst lipofile fargestoff og levere en liten dråpe til en embryonale filet forberedelse av en microinjector. Hver motor Nevron som membranen er kontaktet av dråpe kan da være raskt merket. Individuelle motor neurons er kontinuerlig merket, slik at fine strukturelle detaljer å være tydelig visualisere. Gitt at lipofile fargestoffer kommer i ulike farger, gir teknikken også et middel for å få tilstøtende neurons merket i flerfarget. Denne tracing teknikken er derfor nyttig for å studere neuronal morphogenesis og Synaptic tilkobling i motorisk Nevron system av Drosophila.
Den embryonale motor Nevron system av Drosophila tilbyr en kraftig eksperimentell modell for å analysere mekanismene underliggende utviklingen av sentralnervesystemet (CNS)1,2,3. Den motoriske Nevron systemet er mottagelig for biokjemiske, genetisk, Imaging, og elektrofysiologisk teknikker. Ved hjelp av teknikker, kan genetiske manipulasjoner og funksjonelle analyser utføres på nivå med én motor neurons2,4,5,6.
I løpet av tidlig utvikling av nervesystemet, neuroblasts dividere og generere et stort antall glia og neurons. Spatiotemporal forholdet mellom delaminering og gen uttrykks profilen til neuroblasts har tidligere blitt undersøkt i detalj7,8,9. I tilfelle av motor Nevron systemet, dannelsen av embryonale nevromuskulær Junction (nmj) har blitt grundig studert ved hjelp av aCC (fremre hjørne celle), RP2 (RAW reke 2), og RP5 motor neurons2,10. For eksempel, når RP5 motor Nevron danner en begynnende Synaptic Junction, pre-Synaptic og post-Synaptic filopodia er blandet11,12,13. Slik direkte cellulær kommunikasjon er avgjørende for å starte NMJ formasjon. I motsetning til hva vi vet om perifere nerve grener, vår kunnskap om hvordan motor dendrites initiere Synaptic tilkobling innenfor CNS er fortsatt primitive.
I denne rapporten presenterer vi en teknikk som gjør at retrograd merking av motor neurons i embryo ved hjelp av micropipette-mediert levering av lipofile fargestoffer. Denne teknikken gjør det mulig for oss å spore 38 motor neurons innervating hver av de 30 kroppen veggen musklene i en hemi-segmentet på 15 h etter egglegging (AEL)14. Ved å bruke denne teknikken, har vår gruppe grundig undersøkt mange gevinst-av-funksjon/tap-of-funksjon alleler15,16,17. Vi har nylig unraveled den molekylære mekanismer som driver initiering av motor dendrit tilkobling og viste at en Dscam1-Dock-Pak interaksjon definerer stedet for dendrit utvekst i aCC motor Nevron17. Generelt, denne teknikken er tilpasningsdyktig for fenotypiske analyse av eventuelle embryonale motoriske neurons i vill type eller mutant stammer, styrke vår evne til å gi ny innsikt i funksjonell design av Drosophila nervesystemet.
Bruken av fargestoff merkingsteknikker for å studere neuronal morfologi har flere fordeler fremfor genetisk celle-merking teknikk. Fargestoffet merkingsteknikker kan minimere mengden tid som trengs for merking og Imaging morfologier av motor neurons. Fargestoffet merkingsprosessen er ganske rask som det tar mindre enn 2 h og gjør oss i å definere omrisset av neuronal anslag. Som et alternativ, kan man visualisere aCC motoriske Nevron ved å velge en GAL4 linje som uttrykker gjær GAL4 transkripsjon faktor i aCC, og kr…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer av Kamiyama Lab for kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en NIH R01 NS107558 (til M.I., K.B., og dk).
10x objective lens | Nikon | Plan | |
40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
DiD | ThermoFisher | V22886 | |
DiI | ThermoFisher | V22888 | |
DiO | ThermoFisher | V22887 | |
Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
ImageJ | NIH | Image processing software | |
Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
Needle puller | Narishige | PC-100 | |
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
Nylon Net Filter | Millipore | ||
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |