Summary

Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

Published: January 12, 2020
doi:

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur retrograden Rückverfolgung der embryonalen motorischen Neuronen Von Drosophila mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoffen.

Abstract

Wir beschreiben eine Technik zur retrograden Kennzeichnung von motorischen Neuronen in Drosophila. Wir verwenden einen ölaufgelösten lipophilen Farbstoff und liefern ein kleines Tröpfchen an ein embryonales Filetpräparat durch einen Mikroinjektor. Jedes Motorneuron, dessen Membran vom Tröpfchen kontaktiert wird, kann dann schnell beschriftet werden. Einzelne Motorneuronen werden kontinuierlich beschriftet, so dass feine Strukturdetails klar visualisiert werden können. Da lipophile Farbstoffe in verschiedenen Farben erhältlich sind, bietet die Technik auch ein Mittel, um benachbarte Neuronen in mehrfarbig beschriftet zu bekommen. Diese Tracing-Technik ist daher nützlich für die Untersuchung der neuronalen Morphogenese und synaptischen Konnektivität im motorischen Neuronensystem von Drosophila.

Introduction

Das embryonale motorische Neuronensystem von Drosophila bietet ein leistungsfähiges experimentelles Modell zur Analyse der Mechanismen, die der Entwicklung des Zentralnervensystems (ZNS)1,2,3zugrunde liegen. Das motorische Neuronensystem ist für biochemische, genetische, bildgebende und elektrophysiologische Techniken zugänglich. Mit den Techniken können genetische Manipulationen und funktionelle Analysen auf der Ebene der einzelnen motorischen Neuronen2,4,5,6durchgeführt werden.

Während der frühen Entwicklung des Nervensystems, Neuroblasten teilen und erzeugen eine große Anzahl von Glia und Neuronen. Die räumlich-zeitliche Beziehung zwischen der Delamination und dem Genexpressionsprofil von Neuroblasten wurde zuvor im Detail untersucht7,8,9. Im Falle des motorischen Neuronsystems wurde die Bildung embryonaler neuromuskulärer Knoten (NMJ) mit dem aCC (vordere Eckzelle), RP2 (Rohgarnelen 2) und RP5 Motorneuronen2,10ausgiebig untersucht. Wenn das RP5-Motorneuron beispielsweise eine entstehende synaptische Verbindung bildet, werden die präsynaptischen und postsynaptischen Filopodia11,12,13vermischt. Eine solche direkte zelluläre Kommunikation ist entscheidend, um die NMJ-Bildung zu initiieren. Im Gegensatz zu dem, was wir über die peripheren Nervenzweige wissen, ist unser Wissen darüber, wie motorische Dendriten eine synaptische Konnektivität innerhalb des ZNS initiieren, immer noch primitiv.

In diesem Bericht stellen wir eine Technik vor, die eine retrograde Kennzeichnung von motorischen Neuronen in Embryonen mittels mikropipettevermittelter Abgabe lipophiler Farbstoffe ermöglicht. Diese Technik ermöglicht es uns, die 38 motorischen Neuronen zu verfolgen, die jede der 30 Körperwandmuskeln in einem Hemi-Segment bei 15 h nach Dereiablage (AEL)14innervieren. Mit dieser Technik hat unsere Gruppe zahlreiche Funktionsverstärkungs-/Funktionsverlust-Allele15,16,17gründlich untersucht. Wir haben vor kurzem die molekularen Mechanismen entwirrt, die die Initiierung der motorischen Dendritenkonnektivität vorantreiben, und gezeigt, dass eine Dscam1-Dock-Pak-Interaktion den Ort des Dendritenauswachsens im aCC-Motorneuron17definiert. Im Allgemeinen ist diese Technik anpassungsfähig für die phänotypische Analyse von embryonalen motorischen Neuronen in wilden Typ- oder mutierten Stämmen, was unsere Fähigkeit verbessert, neue Einblicke in das funktionelle Design des Drosophila-Nervensystems zu geben.

Protocol

1. Ausrüstung und Zubehör Materialien für das Sammeln von Embryonen und die Ausbildung von Erwachsenen zum Eierlegen Bereiten Sie das Filtergerät vor, indem Sie ein 50 ml-Rohr abtrennen und ein Loch in der Kappe öffnen, um einen Netzfilter mit Poren von 100 m (Materialtabelle) zwischen Rohr und Kappe zu setzen.HINWEIS: Alternativ können Zellsiebe mit Poren von 100 m (Materialtabelle) für den Filtrationsschritt der Embryoentnahme verwendet werden. A…

Representative Results

Ein repräsentatives Bild der motorischen Neuronen aCC und RP3 ist in Abbildung 3C dargestellt, um die mehrfarbige Kennzeichnung von motorischen Neuronen bei 15 h AEL zu demonstrieren. Ihre dendritischen Morphologien sind weitgehend invariant zwischen Embryonen. Das mit Anti-HRP-Antikörpern erhaltene Färbemuster ist grau dargestellt. Ein kleines Tröpfchen DiO oder DiD wurde auf dem NMJ von Muskel 1 bzw. 6/7 abgelagert. Abbildung 4 zeigt die F…

Discussion

Die Verwendung von Farbstoffkennzeichnungen zur Untersuchung der neuronalen Morphologie hat mehrere Vorteile gegenüber genetischen Zelletikettierungstechniken. Die Färbeetikettierungstechnik kann den Zeitaufwand für die Etikettierung und Abbildung der Morphologien von motorischen Neuronen minimieren. Der Färbeetikettierungsprozess ist recht schnell, da er weniger als 2 h dauert und es uns ermöglicht, die Umrisse neuronaler Projektionen zu definieren. Alternativ kann man das aCC-Motorneuron visualisieren, indem man e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Mitgliedern des Kamiyama Lab für die Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde von einem NIH R01 NS107558 (nach M.I., K.B. und D.K.) unterstützt.

Materials

10x objective lens Nikon Plan
40x water-immersion lens Nikon NIR Apo
Capillary tubing Frederick Haer&Co 27-31-1
Confocal microscope Andor N/A Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass Corning 22×22 mm Square #1
DiD ThermoFisher V22886
DiI ThermoFisher V22888
DiO ThermoFisher V22887
Dissecting microscope Nikon N/A SMZ-U
Double Sided Tape Scotch 665
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Sci. 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Egg collection cage FlyStuff 59-100
FemtoJet 5247 Eppendorf discontinued FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ NIH Image processing software
Micromanipulator Sutter MP-225
Micropipette beveler Sutter BV-10-B
Needle puller Narishige PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets FlyStuff 47-102
Nylon Net Filter Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 15710 Any EM grades
PBS Roche 11666789001 Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200 Kodak 146 4510 Wetting agent
Upright fluorescence microscope Nikon N/A Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape Scotch 6143
VWR Cell Strainers VWR 10199-659
Yeast FlyStuff 62-103 Active dry yeast (RED STAR)

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Cite This Article
Inal, M. A., Banzai, K., Kamiyama, D. Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (155), e60716, doi:10.3791/60716 (2020).

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