친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적
Summary
우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.
Abstract
우리는 Drosophila에있는 모터 신경의 역행 표지를 위한 기술을 기술합니다. 우리는 오일 용해 된 친유성 염료를 사용하고 마이크로 인젝터에 의해 배아 필렛 제제에 작은 물방울을 전달합니다. 그 막이 물방울에 의해 접촉되는 각 모터 신경은 그 때 급속하게 표지될 수 있습니다. 개별 운동 뉴런은 지속적으로 라벨을 부착하여 미세한 구조적 세부 사항을 명확하게 시각화할 수 있습니다. 친유성 염료가 다양한 색상으로 제공된다는 점을 감안할 때, 이 기술은 또한 인접한 뉴런을 여러 가지 색으로 표시할 수 있는 수단을 제공한다. 이 추적 기술은 따라서 Drosophila의모터 뉴런 시스템에서 신경 형태 형성 및 시냅스 연결을 연구하는 데 유용합니다.
Introduction
Drosophila의 배아 운동 뉴런 시스템은 중추 신경계 (CNS)1,2,3의발달의 기초가되는 메커니즘을 분석하는 강력한 실험 모델을 제공합니다. 모터 뉴런 시스템은 생화학적, 유전적, 이미징 및 전기 생리학적 기술을 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 유전 적 조작 및 기능 분석은 단일 운동 뉴런2,4,5,6의수준에서 수행 될 수있다.
신경계의 초기 발달 도중, neuroblasts는 분할하고 glia와 신경의 다수를 생성합니다. 신경아세포의 배분과 유전자 발현 프로필 사이의 시공간적 관계는 이전에 상세히 조사되어왔다 7,8,9. 운동 뉴런 시스템의 경우, 배아 신경근육 접합부(NMJ)의 형성은 aCC(전방 코너 셀), RP2(원시 새우 2), 및 RP5 운동 뉴런2,10을사용하여 광범위하게 연구되었다. 예를 들어, RP5 운동 뉴런이 초기 시냅스 접합을 형성할 때, 시냅스 전 및 시냅스 후 필로포디아는11,12,13을혼합한다. 이러한 직접적인 세포 통신은 NMJ 형성을 시작하는 데 필수적이다. 우리가 말초 신경 지점에 관하여 알고 있는 것과는 반대로, 어떻게 모터 수상돌이 CNS 내의 시냅스 연결을 개시하는지의 우리의 지식은 아직도 원시적입니다.
이 보고에서는, 우리는 친유성 염료의 micropipette 중재한 납품을 통해 태아에 있는 모터 신경의 역행 표지를 허용하는 기술을 제시합니다. 이 기술은 우리가 계란 누워 후 15 시간 (AEL)14에서헤미 세그먼트에 30 신체 벽 근육의 각각을 내음 38 모터 뉴런을 추적 할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 우리 그룹은 철저하게 수많은 기능 의 이득 / 기능 상실 – 기능 의 상실 을 조사했다15,16,17. 우리는 최근에 모터 모수석 연결의 개시를 구동하는 분자 메커니즘을 해명하고 Dscam1-Dock-Pak 상호 작용이 aCC 모터뉴런(17)에서모수석 의 자성장 부위를 정의한다는 것을 입증했다. 일반적으로, 이 기술은 야생 형 또는 돌연변이 균주에 있는 어떤 배아 운동 뉴런든지의 표현형 분석에 적응할 수 있습니다, Drosophila 신경계의 기능적인 디자인에 새로운 통찰력을 제공하는 우리의 기능을 강화하.
Protocol
Representative Results
Discussion
신경 형태학을 공부하기위한 염료 라벨링의 사용은 유전 세포 라벨링 기술에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 염료 라벨링 기술은 운동 뉴런의 형태에 라벨링 및 이미징에 필요한 시간을 최소화할 수 있습니다. 염료 라벨링 과정은 2 시간 미만이 걸리고 뉴런 돌기의 윤곽을 정의 할 수 있기 때문에 매우 빠릅니다. 대안으로, aCC에서 효모 GAL4 전사 인자를 발현하는 GAL4 라인을 선택하고, 상류 활성화 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고에 대한 의견에 대해 가미야마 연구소 회원들에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH R01 NS107558(M.I., K.B., D.K.)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
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