Fluorescerende kalsiumavbildning og påfølgende in Situ hybridisering for nevronal forløper karakterisering i Xenopus laevis

Summary

Vi presenterer en todelt protokoll som kombinerer fluorescerende kalsiumavbildning med in situ hybridisering, slik at eksperimentereren kan korrelere mønstre av kalsiumaktivitet med genuttrykksprofiler på et enkeltcellenivå.

Abstract

Spontan intracellulær kalsiumaktivitet kan observeres i en rekke celletyper og foreslås å spille kritiske roller i en rekke fysiologiske prosesser. Spesielt er passende regulering av kalsiumaktivitetsmønstre under embryogenese nødvendig for mange aspekter ved virveldyr nevrale utvikling, inkludert riktig neural tube nedleggelse, synaptogenesis, og nevrotransmitter fenotype spesifikasjon. Mens observasjonen om at kalsiumaktivitetsmønstre kan variere i både frekvens og amplitude antyder en overbevisende mekanisme der disse fluksene kan overføre kodede signaler til nedstrøms effektorer og regulere genuttrykk, eksisterende tilnærminger på befolkningsnivå har manglet presisjonen som er nødvendig for å utforske denne muligheten ytterligere. Videre begrenser disse tilnærmingene studier av rollen til cellecelleinteraksjoner ved å utelukke evnen til å analysetilstanden til nevronal bestemmelse i fravær av cellecellekontakt. Derfor har vi etablert en eksperimentell arbeidsflyt som kombinerer tidsforløp kalsiumavbildning av dissosierte nevronale explants med en fluorescens i situ hybridiseringanalyse, slik at entydig korrelasjon av kalsiumaktivitetsmønster med molekylær fenotype på et enkeltcellenivå. Vi var vellykket i stand til å bruke denne tilnærmingen til å skille og karakterisere spesifikke kalsiumaktivitetsmønstre forbundet med å differensiere nevrale celler og nevrale stamceller, henholdsvis; utover dette kan imidlertid det eksperimentelle rammeverket som er beskrevet i denne artikkelen, lett tilpasses for å undersøke sammenhenger mellom enhver aktivitetsprofil i tidsserien og uttrykk for et gen eller gener av interesse.

Introduction

Gratis cytosolic kalsium er avgjørende for en rekke biologiske prosesser, alt fra cellespredning og migrasjon til apoptose og autofagi^1,2,3. Innenfor disse banene kan kalsium utøve nedstrømseffekter på genuttrykk ved å samhandle med kalsiumbindende domener for å indusere konformasjonsendringer som modulerer proteinaktivitet og interaksjoner. For eksempel holdes en nevronal kalsiumsensor kjent som Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) i en utfoldet mellomliggende konformasjon når den er bundet av kalsium, og hindrer det i å samhandle med protein- og DNA-målene⁴. Utover å tjene som et enkelt signalmolekyl, gjør imidlertid den dynamiske karakteren av intracellulære kalsiumtransienter disse aktivitetsmønstrene å kode mer komplekse amplitude- eller frekvensbaserte signaler^5,6. Kjernefysisk overføring av transkripsjonsfaktoren kjernefysisk faktor av aktiverte T-celler (NFAT) forsterkes av høyfrekvente kalsiumsvingninger, men hemmes av lavfrekvente svingninger⁷. Overbevisende, nyere arbeid har antydet at NFAT kan faktisk lydhør for kumulativ kalsiumeksponering⁸. Både kalsineurin og Ca²⁺/calmodulin-avhengig protein kinase II (CaMKII) viser også tydelige svar på kalsiumtransienter av en bestemt frekvens, varighet eller amplitude⁹. For å legge til et ekstra nivå av regulatorisk kompleksitet, beregningsmodeller tyder på at mange nedstrøms kalsiumbindende proteiner blir mer eller mindre frekvensavhengige som svar på tilstedeværelsen eller fraværet av bindende konkurrenter^10,11.

Innenfor det utviklende nervesystemet er to hovedklasser av kalsiumaktivitetsatferd definert og forbundet med spesifikke biologiske prosesser. Kalsiumtilstrømninger klassifiseres som "pigger" hvis de oppstår i individuelle celler, når en toppintensitet på ~ 400% av grunnlinjen innen fem sekunder, og viser dobbel eksponentiell forfall¹². Denne typen signal er forbundet primært med nevrotransmitter fenotype spesifikasjon¹³. I motsetning er "bølger" definert som langsommere, mindre ekstreme kalsiumtransienter der en celles intracellulære kalsiumkonsentrasjon stiger til ~ 200% av baseline over en periode på tretti sekunder eller mer, og forfaller deretter over flere minutter¹². Disse signalene ofte forplante seg over flere nærliggende celler, og deres tilstedeværelse har vært forbundet med nøysom mekultur og cellespredning^14,15. Men selv om disse to klassene er definert basert på karakteristiske kinetiske profiler, er det fortsatt uklart nøyaktig hvilke egenskaper ved disse mønstrene som faktisk oppdages av celler og oversettes av nedstrøms effektorer.

Å forstå forholdet mellom intracellulære kalsiumsvingninger og genuttrykk ville gi avgjørende innsikt i en av de regulatoriske mekanismene som sikrer riktig utvikling og mønster av nervesystemet. For dette formål har studier av den embryonale ryggmargen vist at økt kalsiumtoppaktivitet under utvikling er forbundet med høyere nivåer av hemmende nevroner, mens redusert kalsiumspikeaktivitet er forbundet med høyere nivåer av eksitatoriske nevroner¹³. Imidlertid har disse befolkningsnivå analysene ikke blitt brukt til å knytte kalsiumaktivitet med genuttrykk på et enkeltcellenivå.

Nærmer seg disse spørsmålene på nivået av enkeltcellen tilbyr flere forskjellige fordeler fremfor tidligere arbeid. For det første tillater evnen til å vurdere kalsiumaktivitet og genuttrykk i mange celler individuelt at det fulle repertoaret av distinkte aktivitetsmønstre observeres uten å bli obfuscated av en bulk-nivå måling. I tillegg betyr det å studere disse relasjonene i encelles primærkultur at celleautonome koblinger mellom kalsiumaktivitet og genuttrykk vil bli opprettholdt, mens interaksjoner som krever cellecellekommunikasjon vil bli avskaffet. Derfor gjør denne tilnærmingen at disse celle-autonome mekanismene kan studeres isolert. Det gjør det imidlertid også at rollen som ikke-celle-autonom kalsiumaktivitet skal belyses og forhøres. For eksempel kan celler dissekeres fra et embryo på nevrale platestadiet, dyrket til søskenkontroller når nevrale rørstadiet, og deretter sammenlignet med celler som har blitt nydissekert fra et neural-tube-stadium embryo. Dette tillater direkte sammenligning av celler som beholdt celle-celle kommunikasjon over en viktig utviklingsperiode til de der celle-celle kommunikasjon ble avskaffet.

I forsøket på å løse begrensningene i tidligere eksperimentelle tilnærminger, utviklet vi en protokoll som ville muliggjøre vurdering av både kalsiumaktivitet og genuttrykk i individuelle nevrale stamceller, noe som letter korrelasjonen av spesifikke aktivitetsmønstre med påfølgende differensieringsprogrammer. Neuralt vev ble dissekert fra Xenopus laevis på ulike stadier av neural utvikling, dissosiert i enkeltceller, og avbildet via konfokal mikroskopi i nærvær av en fluorescerende kalsiumindikator. Etter live-celle bildebehandling ble prøver løst og sayed via fluorescens in situ hybridization (FISH) for å oppdage uttrykk for et gen eller isoform av interesse. Viktigere, individuelle celler kan spores på tvers av begge bildeforsøk, noe som betyr at en celles kalsiumaktivitetsprofil og genuttrykksnivået kan knyttes til hverandre (Figur 1). Protokollen som rapporteres her er ment å undersøke sammenhenger mellom kalsiumaktivitetsmønstre og genuttrykk på tvers av embryonisk nevroutvikling i Xenopus laevis. Imidlertid kan det bredere eksperimentelle rammeverket (encellede time-course imaging etterfulgt av FISH og bildecoregistration) endres og brukes på nesten alle celletyper, fluorescerende reporter og et gen av interesse.

Protocol

Alt arbeid som involverte dyr ble utført i samsvar med protokoller godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved College of William and Mary.

1. Dyrepleie og embryohåndtering

1. Indusere naturlig parring ved å administrere en subkutan injeksjon av humant choriongonadotropin (HCG) inn i dorsal lymfesekken til voksne Xenopus laevis i en dose på 600 U for kvinner og 400 U for menn.
2. Etter injeksjon, plasser minst en mannlig og en kvinnelig frosk i en romtemperatur holdertank over natten. Egglegging begynner vanligvis 9-12 timer etter HCG-administrasjon.
3. Samle embryoer. Dejelly ved å vaske forsiktig med 2% cystein (pH 8.0) i 2-4 min.
4. Skyll embryoene 3x i 0,1x Merkets modifiserte ringeoppløsning (MMR) (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO_4,2 mM CaCl_2,5 mM HEPES, pH justert til 7,4–7,6).
5. Overfør embryoene til 100 mm glass Petriretter som inneholder 0,1 x MMR og 50 μg/ml gentamycin. Tetthet på 50-100 embryoer per plate er hensiktsmessig.
6. Inkuber opp vaskene ved 14 °C–22 °C og la embryoene utvikle seg til de når ønsket utviklingsstadium(er). Fjern periodisk ubefruktede celler og nekrotiske eller unormalt utviklende embryoer med en plastoverføringspipett.
   MERK: For å sikre konsistens utføres utviklingsiscenesettelse i henhold til morfologiske kriterier definert av Nieuwkoop og Faber¹⁶. Stadier av interesse vil variere basert på eksperimentelt fokus. For eksempel er viktige neurodevelopmental landemerker forbundet med stage 14 (utbruddet av nevrologi), Trinn 18 (utbruddet av neural tube nedleggelse), og Trinn 22 (utbruddet av tailbud forlengelse).

2. Embryodisseksjon og prøveforberedelse

1. Løsning forberedelse
   1. Forbered 2 mM Ca^{2 +} oppløsning som inneholder 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2 mM CaCl₂·2H₂O, 1,31 mM MgSO₄og 4,6 mM Tris. For hver 100 ml oppløsning tilsett 1 ml penicillin/streptomycin (10 000 U/ml penicillin; 10 000 μg/ml streptomycin). Juster pH til 7,8 og filtersteriliser.
   2. Forbered kalsium- og magnesiumfri (CMF) oppløsning ved å kombinere 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 4,6 mM Tris og 0,4 mM EDTA. Juster pH til 7,8 og autoklav for å sterilisere. For hver 100 ml oppløsning tilsett 1 ml penicillin/streptomycin (10 000 U/ml penicillin; 10 000 μg/ml streptomycin). Juster pH til 7,8 og filtersteriliser.
2. Tilberedning av plater for disseksjon og bildebehandling
   1. UV-sterilisere to 35 mm plast Petri retter og en 35 mm Celle kultur rett (se Tabell av materialer).
   2. Mens du arbeider i en lamstrømningshette, klargjør du to 50 ml plastkonisk rør som inneholder 10 ml 2 mM Ca²⁺ oppløsning hver.
   3. Fortsett å arbeide i laminar strømningshetten og tilsett 2 ml 2 mM Ca²⁺ oppløsning til en 35 mm plast Petriskål, 2 ml 2 mM^{Ca 2+} oppløsning til en 35 mm cellekulturrett og 2 ml CMF-løsning til en 35 mm plastpetriskål.
   4. Fyll to 100 mm plastpetriretter og én 35 mm plastpetriskål med 0,1 x MMR med gentamycin (50 μg/ml). Fyll en 60 mm plast Petri-tallerken med 70 % etanol.
   5. Umiddelbart før disseksjon, tilsett 0,01 g kollagenb til en av de 50 ml rørene som inneholder Ca^{2 +} oppløsning. Bland godt og overfør løsningen til en frisk 60 mm plast Petriskål.
3. Ved hjelp av et dissekeringsmikroskop, identifiser embryoer av ønsket utviklingsstadium. Bruk en steril overføringspipette til å overføre minst seks passende embryoer til en av de 100 mm platene som inneholder 0,1 x MMR + gentamycin tilberedt i trinn 2.2.4. Dette vil tjene som holdeplaten.
4. Bruk en steril overføringspipette til å overføre ett embryo til den andre 100 mm platen som inneholder 0,1 x MMR + gentamycin. Dette vil tjene som disseksjonsplaten.
   1. Hvis dissekere embryoer gamle nok til å bevege seg (ca. stadium 23 eller eldre), bedøve hvert embryo før disseksjon ved å overføre den til en tallerken som inneholder 0,1% 3-aminobenzosyre etylester fortynnet i 0,1 x MMR med gentamycin (50 μg/ml). Når embryoet er immobilisert, overfør det tilbake til fatet som inneholder 0,1 x MMR med gentamycin (50 μg/ml) og fortsett med disseksjonen.
5. Fjern forsiktig vitellinmembranen som omgir embryoet. Dette kan oftest gjøres ved hjelp av et par stumpe tang for å stabilisere embryoet mens du bruker et par fine tang for å forstå membranen. Trekk forsiktig med de fine pinsettene for å skrelle vitellinmembranen fra hverandre.
6. Bruk fine tang for å skille embryoets dorsal- og ventrale områder. Dette kan gjøres ved å bruke tang til å "klemme" embryoet langs den fremre bakre aksen, kutte det i to. Med en steril overføringspipett overfører du dorsaldelen til 60 mm plate med kollagenslikerløsning tilberedt i trinn 2.2.5. Kast ventrale delen.
7. La dorsaleksplanten inkubere i kollagensliket i 1–2 min ved romtemperatur. Overfør den forsiktig tilbake til disseksjonsplaten.
8. Fullfør disseksjonved å forsiktig fjerne all gjenværende endodermal og mesodermal forurensning fra det presumptive nevrale vevet i ektodermen. For embryoer på trinn 22 eller eldre bør nevrale røret også fjernes og kastes.
   MERK: Om nødvendig under disseksjonen kan fatet på 70 % etanol tilberedt i trinn 2.2.4 brukes til å fjerne eller resterilisere tangene.
9. Når disseksjonen er fullført, overfører du forsiktig eksplanten til 35 mm-platen på Ca^{2+-oppløsningen} som ble utarbeidet i trinn 2.2.3.
10. Gjenta trinn 2.4-2.9 til fire explants er samlet inn.
11. Bruk en P1000 mikropipette til å overføre alle fire eksplanter til 35 mm platen som inneholder CMF-oppløsning, og pass på at du unngår kontakt mellom eksplantene og luftvannsgrensesnittet. Virvle forsiktig parabolen slik at alle eksplanter klynger seg i midten av platen.
12. Inkuber 1 t ved romtemperatur for å tillate explants å dissosiere.
    MERK: For å hjelpe til med dissosiasjon kan 0,025%–0,01 % trypsin legges til CMF-løsningen. Dette kan være nødvendig for effektiv dissosiasjon av eldre embryoer (trinn 22 og eldre).
13. På dette tidspunktet bør minst to passende iscenesatte embryoer forbli på holdeplaten. Overfør disse embryoene til en frisk tallerken fylt med 0,1 x MMR med gentamycin tilberedt i trinn 2.2.4 og la dem utvikle seg uforstyrret med parabolen dekket for å matche explant parabolen. Disse embryoene vil tjene som søskenkontroller.
14. Bruk superlim til å feste en mikrostyrt dekkslip (se Materialtabell)til bunnen av 35 mm cellkulturrett utarbeidet i trinn 2.2.3.
    MERK: Plasser små dabs av superlim rundt kantene på dekkslip, og trykk den deretter fast mot undersiden av cellkulturretten. Posisjonsmarkeringene vil bli skjult hvor som helst limet kontakter rutenettet, så det er viktig å holde den sentrale gridded delen av coverslip fri fra lim.
15. Etter at eksplantene har dissosiert i 1 t, bruk en P100 mikropipette for å overføre dem til cellkulturretten. For å plate så mange celler som mulig på den griddede delen av parabolen, hold pipetten i en grunn vinkel nær overflaten av parabolen, plasser pipettespissen i hjørnet av rutenettet vendt innover, og utvise cellesuspensjonen godt over den griddede ar ea. Ideelt sett vil cellene bosette seg i en tett tett klynge.
16. Inkuber i 1 t ved romtemperatur for å la cellene holde seg til platen. Bestem og registrer utviklingsstadiet av søskenkontrollembryoene når denne inkubasjonen begynner.
17. Kombiner 5 μL 1 mM Fluo-4 AM (se Materialtabell)med 2 μL 10% pluronisk F-127 syre.
    MERK: Fluo-4 AM er lysfølsom og bør holdes i et lett sikkert eller foliedekket rør til enhver tid.
18. Når inkubasjonen er fullført, flytter du prøvefatet til et mørkerom eller et annet lysbeskyttet sted. Bruk en mikropipette til å fjerne 100 μL oppløsning fra kanten av parabolen. Tilsett denne løsningen til aliquot av Fluo-4 AM /Pluronic F-127 syre, pipette opp og ned for å blande, og returnere hele volumet til prøveparabolen. Virvler forsiktig for å blande.
19. Dekk platen med aluminiumsfolie og la det inkubere i 1 t ved romtemperatur. Bestem og registrer utviklingsstadiet av søskenkontrollembryoene når denne inkubasjonen begynner.
20. På slutten av inkubasjonen, bruk de resterende konisk røret på 2 mM Ca^{2 +} til å utføre tre medievasker på følgende måte: 1) fjern 1 ml oppløsning fra fatet, tilsett 3 ml fersk oppløsning, 2) fjern 3 ml oppløsning fra parabolen, tilsett 3 ml fersk oppløsning, 3 ml fersk oppløsning, 3) fjern 3 ml oppløsning fra parabolen, tilsett 3 ml fersk oppløsning.

3. Kalsiumbildebehandling

MERK: Kalsiumavbildning ble utført ved hjelp av et invertert konfokalmikroskop (Materialtabell).

1. Plasser prøveplaten på mikroskopstadiet, og ta vare på å beskytte den mot eksponering av omgivelseslys. Når platen er sikret, bruker du en markør til å merke forpunktet på platen slik at det samme synsfeltet finnes i etterfølgende bildebehandling.
2. Finn prøven under mikroskopet – først ved 10X og deretter ved 20X-forstørrelse – og velg et passende visningsfelt for bildebehandling. Et ideelt synsfelt er celletett, men ikke så tett at cellene klumpes eller er vanskelige å skille mellom individuelt.
3. Juster mikroskopfokus slik at den rutenettstyrte dekksslipen er synlig. Tallene som er merket på følgeseddelen, fungerer som unike identifikatorer for bestemte rutenettlocus, og kan brukes til å finne det samme visningsfeltet for ekstra bildebehandling. Hvis det opprinnelig valgte visningsfeltet ikke overlapper med noen tall, må du justere til et identifiserbart nummer er i rammen.
4. Ta et sterkt feltbilde av det valgte visningsfeltet med rutenettstyrt forsideslip i fokus.
5. Juster fokusinnstillingene og ta et lyst feltbilde av det valgte visningsfeltet med cellene i fokus.
6. Med cellelaget i fokus, belyse prøvene med en 488 nm laser. HV- og Offset-verdier kan optimaliseres for hvert eksperiment for å sikre at et dynamisk område av fluorescens oppdages på FITC-kanalen.
7. Hvis du vil ha et to timers bilde, kan du endre bildekonfigurasjonen for å registrere 901-rammer med en skannetid på 3,93 s og et intervall på 8 s. Kjør konfigurasjon for å hente bilde.
8. Når avbildningen er fullført, fjerner du platen fra mikroskopstadiet. Fjern 1 ml oppløsning fra platen og skift den ut med 1 ml 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA og 2 mM MgSO₄ i 7,4 % formaldehyd).
9. Inkuber platen i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C. Bestem og registrer utviklingsstadiet av søskenkontrollembryoene når denne inkubasjonen begynner.
10. Etter at fikseringen er fullført, fjern all oppløsning fra platen og skift den ut med 2 ml 1x PBS. Oppbevar plater ved 4 °C for videre behandling.

4. Analyse av genuttrykk: Probesyntese

1. Som beskrevet nedenfor, generere en antisense RNA sonde for in situ hybridisering. I tillegg genererer du en følelsessonde for samme gen for bruk som en negativ kontroll.
2. For å rense plasmid DNA som inneholder sonde malsekvensen, inokulere 150 ml LB kjøttkraft med bakteriellglyserolbestander som inneholder malen plasmid. Inkuber ved 37 °C med risting over natten eller til kulturen er ubundet.
3. Rens plasmid DNA fra bakteriekulturen ved hjelp av din metode for valg.
   MERK: Vi bruker McNary-Nagel midi-prep-settet for å oppnå høye utbytter av plasmid DNA.
4. For å bekrefte at plasmid inneholder forventet innsats, utfør en begrensning fordøye og analysere produktene på en agarose gel. Uklippet plasmid kan også analyseres på en agarosegel for å se etter genomisk DNA-forurensning.
5. For å linearisere mal-DNA, sett opp en 100 μL begrensning fordøye reaksjon som inneholder 20 μg plasmid DNA, 2 μL av passende begrensning enzym, og 1x passende buffer. Inkuber ved 37 °C i minst 2 timer.
6. Trekk ut linearisert DNA ved å utføre en fenol/kloroformekstraksjon etterfulgt av en kloroformekstraksjon.
7. Utløse DNA med 100% etanol. Dette kan gjøres raskt ved å legge til to volumer kald etanol til prøven og inkubere den ved -80 °C til den stivner (15-30 min).
8. Bruk en nedkjølt sentrifuge til pellet DNA ved å spinne i 20 min ved 12.000 x g/4 °C.
9. Fjern supernatanten og vask pelleten med 200 μL 70% etanol. Snurr i 5 min ved 12 000 x g°C.
10. Fjern den supernatant og lufttørkede pelleten i ca. 5 min. Resuspend i 20 μL av 1x TE og oppbevar ved 4 °C inntil videre.
11. For å syntetisere og rense antisense RNA-sonde, lag en 2,5 mM rNTP-blanding ved å kombinere 15 μL på 10 mM rCTP, 15 μL av 10 mM rGTP, 15 μL på 10 mM rATP, 9,75 μL av 10 mM rUTP og 5,25 μL på 10 mM dig-11P UT (Se tabell av materialer).
12. Sett opp en 50 μL in vitro transkripsjonsreaksjon som inneholder 4 μg lineærisert mal DNA fra trinn 4.2-4.10, 15 μL 2,5 ml rNTP-blanding fra trinn 4,11, 10 μL 5x transkripsjonsbuffer, 5 μL 0,1 M DTT, 0,5 μL RNAse-hemmer (20 U/μL) og 1,5 μL av passende RNA-polymerase (T3, T7 eller SP6). Inkuber 1 time ved 37 °C.
13. Tilsett ytterligere 1,5 μL RNA-polymerase til reaksjonen og gå tilbake til 37 °C i en ekstra time.
14. Tilsett 1 μL RQ1 DNAse til reaksjon og inkuber ved 37 °C i 10 min for å degradere DNA-mal.
15. Tilsett 30 μL 7,5 M LiCl-oppløsning for å prøve. Pipette å blande og inkubere ved -20 °C i minst 1 timer.
16. Ved hjelp av en nedkjølt sentrifuge, spinn prøven 25 min ved 14.000 x g/4 °C.
17. Fjern supernatanten og skyll pelleten med 500 μL 70% etanol. Snurr i 5 min ved 14 000 x g°C.
18. Fjern den supernatant og lufttørkede pelleten i ca. 5 min. Resuspend i 20 μL kjernefritt vann.
19. Opprett ved 10x probelager ved å fortynne prøven til en konsentrasjon på 10 ng/μL i hybridiseringsbuffer (50 % formamid, 5x SSC (saltvann-natriumcitrat; 750 mM NaCl, 75 mM natriumsitrat, pH 7.0), 1 mg/ml torula RNA, 0,1 % Tween-20, 1x Denhardts løsning, 0,1 % CHAPS, 10 mM EDTA og 100 μg/ml heparin). Oppbevares ved -20 °C inntil videre.

5. Analyse av genuttrykk: Fluorescens i Situ hybridisering

MERK: Alle vasker skal utføres med ca. 1 ml oppløsning ved hjelp av en steril, individuelt innpakket overføringspipett. Pipetten skal plasseres på kanten av platen når du fjerner eller tillegger oppløsning, og vaskene skal utføres så forsiktig som mulig for å sikre at cellene ikke løsnes fra plateoverflaten og går tapt.

1. Fjern 1x PBS fra platen (fra trinn 3.10). Skift ut med fersk 1x PBS og inkubator 5 min ved romtemperatur.
2. Kombiner 25 ml 0,1 M trietanolamin (pH 8,0) med 62,5 μL eddikanhydrid. Bland godt. Vask platen med denne oppløsningen i 10 min.
3. Vask platen med 1x SSC i 5 min.
4. Vask platen med 0,02 M HCl i 10 min for å permeabilize celler.
5. Vask 2x med 1x PBS i 5 min hver.
6. Fjern løsningen og legg til 1 ml hybridiseringsbuffer (50 % formamid, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM natriumsitrat, pH 7.0), 1 mg/ml torula RNA, 0,1 % Tween-20, 1x Denhardts løsning, 0,1 % CHAPS, 10 mM EDTA og 100 μg/mLpar hein) til plate. Inkuber med risting i minst 6 timer ved 60 °C.
7. Fjern hybridiseringsbufferen og erstatt med 750 μL av 1x RNA Probe-oppløsning (fortynnet form 10x-aksjen som ble laget i trinn 4,19. Sense RNA-sonder kan brukes som en negativ kontroll.
8. Inkuber med risting i 8-14 timer ved 60 °C.
9. Fjern sonden og oppbevar ved -20 °C.
   MERK: 1x probefortynning kan brukes på nytt opptil tre ganger før den kastes.
10. Skyll platen med 0,2 x SSC.
11. Vask med fersk 0,2 x SSC i 1 t ved 60 °C.
12. Flytt platene til romtemperatur og likevekt i 5 min.
13. Vask platen med 0,2 x SSC i 5 min.
14. Vask platen med 1x PBT i 15 min.
15. Vask platen med 2 % H₂O₂ i 1x PBT (0,1 % Triton-x-100) i 1 timer.
    MERK: Denne løsningen er lysfølsom, så den skal gjøres frisk for hvert eksperiment og skjermes fra lys. Plater bør også skjermes fra lys eller folies under denne inkubasjonen.
16. Vask platen med 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1%Tween-20) i 15 min.
17. Fortynn blokkering av reagens til 2 % i malesyrebuffer (100 mM malesyre, 150 mM NaCl, pH 7,5). Blokker cellene i denne blandingen i minst 1 t ved romtemperatur.
18. Erstatt blokkeringsoppløsning med anti-digoxygenin-POD antistoff fortynnet 1:1000 i 2% Blokkering reagens i malesyrebuffer. Inkuber over natten ved 4 °C.
19. Skyll platen 3x med 1x TBST.
20. Vask 4x med 2ml 1x TBST i minst 15 min per vask med kontinuerlig gynge.
21. Vask 2x med 1x PBT i minst 10 min per vask med kontinuerlig gynge.
22. Fortynn Cy3-konjugert tyramid 1:25 i 1x PBT. Vask platen med 750 μL av denne fortynningen i 5 min.
    MERK: Denne løsningen er ekstremt lysfølsom, og platene skal holdes foliet eller skjermet fra lys resten av eksperimentet for å unngå signalforringelse.
23. Tilsett 2,5 μL på 0,3 % H₂O₂ til denne løsningen og inkuber med kontinuerlig gynge i ytterligere 40 min ved romtemperatur.
24. Vask 4x med 1x TBST i minst 15 min per vask med kontinuerlig gynge.
25. Skyll med 1x PBT.
26. Fest cellene ved å inkubere i 1 t ved romtemperatur i 1x MEMFA (100 mM MOPS, 1 mM EGTA og 1 mM MgSO₄ i 3,7% formaldehyd).
27. Fjern oppløsningen og skift ut med 1x PBS. Oppbevar platene i en foliebeholder ved 4 °C til videre behandling.

6. Bildeceller

MERK: Bildebehandling ble utført ved hjelp av et invertert konfokalmikroskop.

1. Plasser prøveplaten på mikroskopstadiet, og juster merket i trinn 3.1 til forsiden av scenen.
2. Fokuser bildet slik at rutenettforet forsideslip er synlig, og bruk rutenettbildet som er tatt i trinn 3.4 som referanse, justerer visningsfeltet slik at det samsvarer med synsfeltet som er tatt i kalsiumbildet (avsnitt 3).
3. Hent lyse feltbilder av både rutenettet og cellene.
4. Belyse prøvene med en 595 nm TRITC-laser. Juster gevinstverdier for å skille signal fra bakgrunnen ved hjelp av bildene fra de negative kontrollcellene og få et stillbilde.
   MERK: Ideelt sett bestemmes bakgrunnsfluorescensnivåer basert på en negativ kontrollplate behandlet parallelt med en ikke-målrettingssans RNA-sonde. Forsterkningsinnstillingene justeres slik at denne platen vises helt svart (tilsvarende bakgrunnsnivåer), og deretter holdes konstant for andre plater avbildet fra det eksperimentelle partiet.

7. Databehandling

MERK: Databehandling ble utført ved hjelp av Nikon Elements-programvaren.

1. Åpne 2 t kalsiumbilde fra trinn 3.7. Identifiser pikslene som tilsvarer hver enkelt celle ved å velge Binær > Spotdeteksjon > Lyse flekker. Kontroller at FITC-kanalen er valgt.
2. Fargede sirkler vises over individuelle celler etter at dette laget er generert. Juster celledistribusjons- og størrelsesparameterne slik at så mange celler som mulig gjenkjennes og knyttes til en unik identifikator.
3. Spor cellene på tvers av alle bilder av bildet ved å navigere til Vis > Analysekontroller > Sporingsalternativer. Angi 5 rammer som maksimalt gap mellom spor, slett objekter som er knyttet til færre enn 600 rammer, og velg Alternativet Lukk hull. Velg Spor binærfiler for å bruke cellesporing på bildet.
4. Når cellene er sporet, sletter du manuelt et objekt som ikke samsvarer med en enkelt celle (for eksempel en klump av celler). Datapunkter bør imidlertid ikke utelukkes fra videre analyse basert på morfologien til kalsiumaktivitetssporet.
5. Velg Vis overlegg > Vis binær objekt-IDi Bilde-ruten. Bla til slutten av bildet (Ramme 901) og velg Rediger > Opprett visning øyeblikksbilde (8bit RGB)> Gjeldende ramme > OK. Dette vil skape et øyeblikksbilde av den siste rammen av bildet med hver celles tilknyttede binære ID synlig. Lagre dette bildet.
6. Eksporter tidsseriedata ved å velge alle objekter etterfulgt av Eksporter data til Excel. Lagre utdata som en CSV-fil.
7. Åpne FISH-bildet. Optimaliser spotgjenkjenning som i trinn 7.1–7.2 ved hjelp av TRITC-kanalen i stedet for FITC-kanalen. Slett eventuelle feilaktig tilordnede binærfiler manuelt, og velg deretter Automatiserte måleresultater > Oppdater måling for å beregne signalintensiteten til hver celle. Eksporter et øyeblikksbilde av bilder og dataved å gjenta trinn 7.5 og 7.6.
8. Opprett et regneark der kolonne A er merket FISH Binary ID og kolonne B er merket Kalsium Binær ID. Åpne bildene som eksporteres i trinn 7.5 og 7.7. For hvert objekt som er identifisert i FISH-bildet (trinn 7.7), registrerer du binær-ID-en i kolonne A. Deretter finner du den tilsvarende cellen i kalsiumbildet (trinn 7.5) og registrerer at binær ID i kolonne B. Celler som ikke kan identifiseres trygt i begge bildene, ikke skal legges til i regnearket.
   MERK: Det kan være nyttig å bruke et bilderedigeringsprogram som Adobe Photoshop eller GIMP-bilderedigeringsprogram for å åpne begge bildene, lage en halvgjennomsiktig og legge den over på partnerbildet for å lettere identifisere og koble de to binære ID-ene knyttet til hver celle.
9. For hver identifisertcelle, samle (enten manuelt eller med et skript) sin tid-serien kalsiumdata (forbundet med kalsium binære ID og eksportert i trinn 7.6) og dens genuttrykksdata (forbundet med FISH Binary ID og eksportert i trinn 7.7).
   MERK: Nedstrøms databehandling og analyse kan innebære å sortere disse dataene i en enkelt datatabell og bruke en rekke analytiske teknikker, inkludert piggtelling, fraktalanalyse og markovisk entropi som tillater etterforskeren å skjelne nye mønstre av kalsiumaktivitet ^17,18.

Representative Results

Et vellykket eksempel på dissosierte celler tilberedt for kalsiumavbildning kan ses i figur 2A. Celler er tett belagt, slik at den maksimale mengden informasjon som skal samles inn fra hvert bilde, men ikke så tett belagt at enkelte celler ikke kan trygt skilles fra hverandre. Fluorescens oppdages for hver definerte celle i løpet av 2 t bildeperioden. Visualisering av et sammensatt plott som inneholder sporene for alle celler registrert i et eksperiment, viser i hvilken grad bulk- eller populasjonsmålinger kan skjule mer nyanserte mønstre av piggatferd (figur 2B). Når de registrerte profilene til individuelle celler er isolert, kan eksempler på uregelmessig spiking aktivitet karakteristisk for nevrale stamceller tydelig identifiseres. I motsetning til modne nevroner viser embryonale nevronale celler uregelmessig, svært variabel og kompleks art av kalsiumaktivitet(figur 2B). For å kvantifisere denne kompleksiteten, er bruk av ulike dataanalysemetoder brukt^17,18, inkludert ulike parametere for å definere en topp (figur 2C).

Vellykket fluorescens i situ hybridisering, inkludert vellykket design og syntese av en antisense mRNA-sonde, kan vurderes ved å sammenligne den eksperimentelle platen mot en bakgrunnskontroll inkubert med en ikke-bindende følelse RNA-kontroll (Figur 3A,B). En positiv sondekontroll kan også utføres ved å behandle en celletype som er kjent for å uttrykke målet mRNA på påviselige nivåer.

Identifisering av samme celle på tvers av kalsium- og FISH-avbildning krever at cellene beholder omtrent samme posisjon under sondehybridisering og prosessering. Hvis platene håndteres grovt eller vasker utføres for kraftig, celler kan løsnes fra plateoverflaten og enten tapt når løsningen kastes eller deponeres på et annet sted på platen, noe som gjør det umulig for dem å bli matchet på tvers av bilder (Figur 4A). Hvis denne forstyrrelsen bare påvirker noen av cellene i synsfeltet, kan det fortsatt være mulig å oppdage og tilordne noen celler i bildet (Figur 4B). Imidlertid er den maksimale mengden data hentet fra et eksperiment der FISH utføres nøye og få celler går tapt eller flyttes mellom bilder (Figur 4C).

Når data er samlet inn for å beskrive både kalsiumaktiviteten og genuttrykket til et rimelig antall celler på utviklingsstadiet(e) av interesse, kan ytterligere analyser utføres for å vurdere sammenhenger mellom disse to funksjonene (figur 1). En rekke beregninger har blitt brukt til å kvantifisere kalsiumaktivitetsmønstre, inkludert topptelling/frekvens, gjennomsnittlig effekt, Hurst eksponent estimering og markovisk entropimåling^17,18. Genuttrykk kan defineres kvantitativt av absolutt fluorescensnivå eller graderes på en binær (ja/nei) skala, avhengig av de eksperimentelle spørsmålene som tas opp.

Resultater fra eksperimenter som samler kalsiumaktivitet med uttrykk for nevrale stamcellemarkørgener viste mange sammenhenger mellom spesifikke mønstre av kalsiumaktivitet og nevrotransmitterfenotyper. På nevrale platestadiet (trinn 14) viser GABAerge celler som uttrykker den hemmende nevronmarkøren gad1.1 kalsiumaktivitet som er mer vanlig og høyere amplitude enn for celler som mangler gad1.1-uttrykk (figur 5A). Videre, mens disse gad1.1-uttrykke nde celler er forbundet med høyere nivåer av høy amplitude spiking, lav amplitude spiking er hyppigere i glutamatergic celler som uttrykker eksitatoriske nevron markør slc17a7.

Figur 1: Skjematisk av eksperimentell arbeidsflyt. Skala bar = 100 μm. Bilder i panel3-5 ble tatt fra Paudel et al. (2019)¹⁷. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Kalsiumbildebehandling og eksempelaktivitetsprofiler. (A) Intracellulær kalsiumaktivitet som rapportert av Fluo4-AM. Hvert 2 h-bilde består av 901 rammer, med ett representativt bilde show her. (B) Sammensatt plott av fluorescens intensitet over tid i alle celler innenfor det avbildede synsfeltet. Sporene indikerer tydelig fotobleking av indikatordye (Fluo4) overtid. Raster plottet øverst til venstre viser representative spor av kalsiumaktivitet etter bruk av en de-trending algoritme utviklet av Eilers og Boelen¹⁹, hvor celler vist her viser variert mønster av spiking atferd. (C) Anvendelse av forskjellige terskler (150% og 200% av baseline, hvor grunnlinjen er gjennomsnittet av avtrendede fluorescerende intensitet) for å definere en topp (grønne og blå piler). Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figur 3: FISH-bildebehandling. (A) FISH utført med en ikke-bindende følelse RNA sonde som en negativ kontroll. Bildeinnstillinger er justert slik at ingen celler vises fluorescerende. Noen synsfelt kan omfatte ikke-celleavfall med litt fluorescens, for eksempel sett øverst til høyre og nederst til høyre i (A); disse kan ignoreres med det formål å bakgrunnsinnstilling. (B) De samme bildeinnstillingene brukes deretter til å bilde en eksperimentell plate (antisense RNA-sonde). Fluorescens under disse forholdene tilsvarer genuttrykk over bakgrunnen. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Bildeoverlegg og samtidig registrering. Skjematiske representasjoner av en prøve avbildet for kalsiumaktivitet (celler representert ved fylte grønne sirkler) og etter FISH (celler representert ved skyggefulle røde sirkler). (A) Celler som har beveget seg betydelig under prøvehåndtering og behandling, kan ikke identifiseres på en pålitelig måte på tvers av de to bildene. (B) Celleavbrudd kan bare påvirke noen celler i synsfeltet. Noen celler kan tydelig identifiseres i begge bildene, mens andre ikke kan trygt matches. (C) Hvis prøvene håndteres nøye, vil de fleste celler forbli uforstyrret og kan identifiseres i begge bildene. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figur 5: Et eksempel på anvendelse av denne metoden, boxplots som viser sammenhenger mellom kalsiumaktivitet og genuttrykk (GABA og Glut for gener gad1.1 og slc17a7 henholdsvis) i neural plate stadium Xenopus laevis. På stadium 14 viser gad1.1-postive celler (GABA) høyere amplitude og mer regelmessig kalsiumaktivitet som definert av (A) Markovian entropy18 og (B)spike teller ved hjelp av terskler 125%, 150%, 200% og 300% av gjennomsnittet av de-trended fluorescerende intensitet (baseline)¹⁷ enn slc17a7 positive celler (Glut). Stjerner indikerer statistisk signifikante forskjeller i henhold til både Bonferroni-korrigert to-prøve Kolmogorov-Smirnov Test (p < 0,05) og Cohens d statistikk for effektstørrelse (n = 5 kulturer og > 100 celler; * 0,2 ≤ |d| < 0,5). Figuren ble trukket tilbake og tilpasset fra datasett hentet fra Paudel et al.¹⁷. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Discussion

Karakteristiske mønstre av kalsiumaktivitet har blitt observert i cellene som utgjør det utviklende nervesystemet, med bestemte typer aktivitet forbundet med forskjellige neurodevelopmentale prosesser. Imidlertid krever ytterligere forståelse av mekanismene som disse informasjonstette aktivitetsmønstrene oversettes til transkripsjonelle svar, informasjon om kalsiumaktivitet og genuttrykk som samles inn med encellede oppløsning. Mens systemer som viser mer stereotypisk kalsiumaktivitet, som modne nevroner, med rimelighet kan sammenlignes på et bulknivå, maskeres de uregelmessige mønstrene som karakteriserer det embryonale nervesystemet lett av mindre presise opptak.

Det eksperimentelle rammeverket som er etablert i denne protokollen, kan enkelt tilpasses et bredt utvalg av celletyper og fluorescerende journalister. Vev som inneholder nesten alle celletyper eller kombinasjonav celletyper kan dissekeres fra en modellorganisme av interesse og belagt for encellede avbildning. I tillegg til å tillate celleidentifikasjon og isolere effekten av celleautonome prosesser, gjør en primær cellekulturtilnærming at eksperimentereren kan definere mediekomponenter etter ønske. For eksempel har eksperimenter som sammenligner aktiviteten til nevronale forløpere i 2 mM Ca^{2 +} løsning blitt utført for å undersøke om forholdet mellom spike frekvens og nevrotransmitter fenotype i embryonale ryggmargen kan rekapituleres uten påvirkning av celle-celle interaksjoner^13,20.

Mens denne protokollen utnytter fluorescerende markør Fluo4-AM for å oppdage intracellulær kalsiumaktivitet, avhengig av utvalgskriteriene, kan brukerne velge andre kommersielt tilgjengelige markører²¹, inkludert genetisk kodede kalsiumindikatorer. På samme måte kan alternative markører brukes til å overvåke dynamiske endringer i konsentrasjonen av en ion av interesse (inkludert K^+,Na⁺og Zn²⁺⁾, membranpotensial eller cellulær pH. Bildeinnstillinger og bildevarighet kan endres etter behov.

Selv om vi korrelerte kalsiumaktivitet og nevronal fenotype som et bestemt program, gjelder denne metoden også for en rekke andre cellulære egenskaper. For eksempel kan fluorescens i situ hybridisering utføres med sonder mot ethvert gen av interesse, inkludert nevronal markør ChAT eller transkripsjonsfaktoren Engrailed, slik at sensitiv påvisning av et passelig panel av mRNA-arter. Disse sondene kan utformes for å være isoform-spesifikke, som støtter ytterligere målspesifisitet hvis ønskelig. Dobbel FISK kan utføres ved hjelp av sonder konjugert til flere to forskjellige fluoropforer, slik at samtidig vurdering av uttrykket av flere gener. Imidlertid er de ekstra vaskene som kreves av denne typen eksperiment forbundet med økt sjanse for celletap eller bevegelse og krever erfaring og delikatesse som skal utføres med hell.

Uavhengig av eventuelle eksperimentspesifikke endringer som er gjort i denne protokollen, er det flere viktige trinn som krever nøye oppmerksomhet. Desseksjoner bør utføres med forsiktighet for å fjerne alt forurensende vev eller cellepopulasjoner; fordi romlig mønster går tapt når eksplantene er dissosiert, vil eventuelle gjenværende celler fra nærliggende vev bli ispedd og umulig å skille fra cellene av interesse. Etter at cellene er belagt, bør prøvene håndteres så forsiktig som mulig for å hindre at celler løsner. Viktigst av alt betyr dette at alle løsningsendringer bør utføres sakte og forsiktig, med pipetten plassert på kanten av platen når oppløsningen fjernes og legges til. Dette vil sikre at cellene trygt kan identifiseres i både kalsium- og FISH-bilder. Hvis celler forstyrres under behandlingen, kan det være umulig å identifisere noen eller alle de tilsvarende cellene mellom de to bildene. Vi anbefaler at du bruker disse oppgavene på siden av forsiktighet med disse oppgavene, slik at bare entydig tilsvarende celler brukes til videre analyse.

Avhengig av det biologiske spørsmålet som tas opp, kan en rekke analysetilnærminger være hensiktsmessige. Kalsiumaktivitet i tidsserien kan behandles og kvantifiseres på en rekke måter, med fleksibilitet i valg av de-trending parametere, analyseberegninger og analyseparametere (for eksempel % av baseline terskelen som brukes til å definere en kalsiumpigg). Sammenhenger mellom kalsiumaktivitet og nivå av genuttrykk kan trekkes ved å analysere genuttrykk som en absolutt eller relativ fluorescensverdi hentet fra FISH-bildet. Alternativt kan sammenhenger mellom kalsiumaktivitet og genuttrykk (tilstedeværelse/fravær) trekkes ved å definere en fluorescensterskel for positivt genuttrykkssignal og tildele "ja" eller "nei" identifikatorer til individuelle celler. Som helhet gir dette eksperimentelle skjemaet en utrolig fleksibel rørledning for innsamling og foreløpig analyse av tidsseriedata i forbindelse med cellesamsvarende genuttrykksdata. Slike eksperimenter vil være avgjørende for bedre å forstå de komplekse relasjonene mellom cellulær dynamikk og transkripsjonelle endringer, som eksemplifisert ved identifisering av kalsiumaktivitetsmønstre karakteristisk for hemmende-fated og eksitatorisk-fated nevronale forløpere i embryonale Xenopus laevis.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Animal Husbandry & Cell Culture
CHORULON (chorionic gonodotropin)	Merck Animal Health
Gentamycin sulfate salt	Millipore Sigma	G1264
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm	Millipore Sigma	CLS3160102
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm	Fisher Scientific	08-772A
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm	Fisher Scientific	08-772F
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	08-772E
Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta	Fisher Scientific	12-565-90
Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL	Fisher Scientific	13-711-7M
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Millipore Sigma	E10521
Collagenase B	Millipore Sigma	11088807001
Dumont #55 Forceps, Dumostar	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 Forceps, Dumostar	Fine Science Tools	11295-00
Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface	Nexcelom Bioscience	CLS5-25D-050
For Calcium Imaging
Fluo-4, AM, cell permeant	Thermo Fisher Scientific	F14201
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	Thermo Fisher Scientific	P6866
For RNA Probe Generation
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222
rATP	Promega	P1132
rCTP	Promega	P1142
rGTP	Promega	P1152
rUTP	Promega	P1162
Digoxigenin-11-UTP	Millipore Sigma	3359247910
Rnase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	N8080119
T3 RNA Polymerase	Promega	P2083
T7 RNA Polymerase	Promega	P2075
SP6 RNA Polymerase	Promega	P1085
RQ1 Rnase-Free Dnase	Promega	M6101
LiCl Precipitation Solution (7.5 M)	Thermo Fisher Scientific	AM9480
For Fluorescence In Situ Hybridization
Acetic Anhydride	Thermo Fisher Scientific	320102
Blocking Reagent	Millipore Sigma	11096176001
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments	Millipore Sigma	11207733910
Cy3 Mono-Reactive NHS Ester	Millipore Sigma	GEPA13105
Solution Components
Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs	Fisher Scientific	AC349610
Calcium chloride dihydrate	Millipore Sigma	C3306
CHAPS hydrate	Millipore Sigma	C3023
Denhardt's Solution (50X)	Thermo Fisher Scientific	750018
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)	Promega	P1171
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate	Fisher Scientific	S311
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Millipore Sigma	E3889
Formamide (Deionized)	Thermo Fisher Scientific	AM9342
Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Millipore Sigma	H3393
HEPES (Ultra Pure)	Thermo Fisher Scientific	11344041
Hydrogen peroxide solution	Millipore Sigma	H1109
L-Cysteine	Millipore Sigma	168149
Magnesium chloride, pure, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC223211000
Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous	Fisher Scientific	AC413480050
Maleic Acid, 99%, ACROS Organics	Fisher Scientific	ACS125231000
MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP308
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9541
Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX	Millipore Sigma	R3629
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Triethanolamine	Millipore Sigma	90279
Tris	Millipore Sigma	GE17-1321-01
TWEEN 20	Millipore Sigma	P9416
Equipment
Laminar Flow Hood	model of choice
Dissecting Microscope	model of choice
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon	TE200
NIS-Elements Imaging Software	Nikon
Shaking Incubator	model of choice
Refrigerated Centrifuge	model of choice
Miscellaneous
Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 μm pore, 500 mL bottle capacity	Millipore Sigma	CLS430769
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22