Summary
Denne rapport beskriver screening af forskellige rengøringsmidler til forberedelse af den visuelle GPCR, rhodopsin, og dens kompleks med mini-Go. Biokemiske metoder, der karakteriserer kompleksets kvalitet på forskellige stadier under rensningen, påvises. Denne protokol kan generaliseres til andre membran protein komplekser for deres fremtidige strukturelle undersøgelser.
Abstract
Nøglen til bestemmelse af krystalstrukturer af membranproteinkomplekser er kvaliteten af prøven før krystallisering. Valget af vaskemiddel er især kritisk, fordi det påvirker både kompleksets stabilitet og monodispersitet. Vi har for nylig bestemt krystal struktur af en aktiv tilstand af kvæg rhodopsin koblet til en manipuleret G protein, mini-Go, på 3,1 Å opløsning. Her beskriver vi proceduren for optimering af præparatet af rhodopsin-mini-Go-komplekset. Dark-state rhodopsin blev fremstillet i klassiske og neopentylglycol (NPG) rengøringsmidler, efterfulgt af kompleks dannelse med mini-Go under lyseksponering. Stabiliteten af rhodopsin blev vurderet ved ultraviolet-synlig (UV-VIS) spektroskopi, som overvåger rekonstitution i rhodopsin af den lysfølsomme ligand, 9-cis retinal. Automatiseret størrelsesudelukkelseskromatografi (SEC) blev brugt til at karakterisere monodispersiteten afo rhodopsin og rhodopsin-mini-G o-komplekset. SDS-polyacrylamid elektroforese (SDS-PAGE) bekræftede dannelsen af komplekset ved at identificere en 1:1 molære forhold mellem rhodopsin og mini-Go efter farvning gelmed Coomassie blå. Efter krydsvalidering af alle disse analytiske data eliminerede vi uegnede rengøringsmidler og fortsatte med det bedste kandidatvaskemiddel til storstilet forberedelse og krystallisering. Et yderligere problem opstod fra heterogenitetnen af N-glycosylation. Heterologt udtrykt rhodopsin blev observeret på SDS-PAGE at have to forskellige N-glycosylated populationer, som sandsynligvis ville have hindret krystallogenese. Derfor blev forskellige deglycosylation enzymer testet, og endoglycosidase F1 (EndoF1) produceret rhodopsin med en enkelt art af N-glycosylation. Med denne strategiske pipeline til karakterisering af proteinkvalitet blev forberedelsen af rhodopsin-mini-Go-komplekset optimeret til at levere krystalstrukturen. Dette var kun den tredje krystal struktur af en GPCR-G protein signalering kompleks. Denne fremgangsmåde kan også generaliseres for andre membranproteiner og deres komplekser for at lette prøveforberedelse og strukturbestemmelse.
Introduction
Bestemmelse krystal strukturer af membran proteiner og deres komplekser har altid været udfordrende på grund af vanskeligheder med at opnå godt diffracting krystaller. I modsætning til opløselige proteiner udgør integrerede membranproteiner en hydrofob kerne, der spænder over cellemembranen. For at fjerne membranproteiner fra cellemembranen til vandig buffer skal der anvendes rengøringsmidler til at danne en vaskemiddelproteinmicelle, hvorved lipiderne omkring membranproteiners hydrofobe kerne erstattes. Membranproteiners stabilitet, aktivitet og integritet afhænger direkte afvaskemidlet1'kemiske og strukturelle egenskaber , og vaskemidlets egenskaber bestemmer også micelles størrelse. En stor vaskemiddel micelle kan okkludere de hydrofile overflader af en lille membran protein, og dermed forhindre krystallisering på grund af manglen på krystal kontakter, når du bruger damp diffusion metode. En lille vaskemiddel micelle er fordelagtig tii i krystallografi, men korte kæde vaskemidler er normalt hårdere og derfor føre til destabilisering og aggregering af membranproteinet. Derfor, før krystallisering, en ekstra vaskemiddel screening procedure er uundværlig, typisk rettet mod kortere rengøringsmidler, der stadig opretholde protein stabilitet.
G proteinkoblede receptorer (GPCR' er) er integrerede membranproteiner, der indeholder syv transmembrane a-helices. GPCRs findes i to hovedstater, enten en inaktiv tilstand stabiliseret af inverse agonister eller antagonister, eller en aktiv tilstand bundet til en agonist og stabiliseret af et G-protein, selv om det er sandsynligt, at et væld af sub-stater eksisterer mellem disse to yderpunkter. Struktur bestemmelse af GPCRs oprindeligt fokuseret på inaktive stater bundet til inverse agonister og antagonister på grund af deres højere stabilitet end aktive stater2. Når GPCRs aktiveres ved agonistbinding, er receptorerne meget dynamiske, og en kløft danner forbigående på receptorens cytoplasmatiske ansigt for G-proteinkobling. Det menes, at denne dynamik er grunden til agonist-bundet GPCRs er ofte mere ustabil end den inaktive tilstand. Derfor bliver det vigtigt at screene for vaskemidler, der er egnede til den undersøgte receptors konformationstilstand, fordi det er sandsynligt, at mildere rengøringsmidler vil være nødvendige for at studere en aktiv tilstand sammenlignet med en inaktiv tilstand.
I denne rapport bruger vi den visuelle GPCR, bovin rhodopsin3, og dens kompleks med mini-Go protein4,5 til vaskemiddel screening eksperimenter, der repræsenterer den inaktive tilstand og aktiv tilstand, henholdsvis. Screeningen af vaskemiddel fokuserede på de klassiske alkyl maltoside- og glucosiderengøringsmidler og neopentylglycol (NPG) rengøringsmidler. I denne sammenhæng er et klassisk vaskemiddel bygget af en sukkerhovedgruppe og en alkylkæde, mens vaskemidler af NPG-typen indeholder to identiske klassiske vaskemidler, der smeltes af et kvaterarisk kulstof i grænsefladen mellem sukker- og alkylkæderne6,7,8.
En eksperimentel arbejdsgang blev designet ud fra rensning af rhodopsin i forskellige rengøringsmidler, efterfulgt af dannelse af rhodopsin-mini-Go kompleks og slutter med karakterisering af komplekset ved hjælp af flere metoder (Figur 1). For den inaktive tilstand af rhodopsin, rekonstitution af den lysfølsomme ligand 9-cis retinal blev overvåget af ultraviolet-synlige (UV-VIS) spektroskopi. Spektret afslører den fysisk-kemiske tilstand af retinal og er tegn på dens miljø i retinal bindende lomme af rhodopsin. Størrelseseksklometografi (SEC) blev anvendt til at vurdere monodispersitet af renset rhodopsino samt dannelse af rhodopsin-mini-G o-komplekset. Som SEC differentierer protein molekyler efter deres størrelse og form, aggregerede protein population kan identificeres som de eluere i tomrummet volumen. For at bekræfte kompleks dannelse, fraktioner fra SEC blev vurderet af natrium dodecyl sulfat-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) for at bekræfte tilstedeværelsen af både rhodopsin og mini-Go.
En anden faktor, der skal overvejes, er posttranslationelle modifikationer (PTM) på membranproteinerne. PTM såsom N-glycosylation er ofte observeret på eukaryote membran proteiner produceret i pattedyr og insekt celle ekspressionssystemer. En begrænset N-glycosylation stamme af den menneskelige embryonale nyre 293 (HEK293) celler blev udviklet ved sletning af genet kodning N-acetylglucosaminyltransferase I (GnTI), hvilket resulterer i homogen N-glycosylation af GlcNAc2Man5 på konsensus stedet Asn-X-Ser/Thr. Selvom N-glycosylation kan forebygges ved at mutere en aminosyrerester på konsensusstedet, kan dette også ændre proteinets funktion eller effektiviteten af foldning. I bovin rhodopsin fører mutationen af den N-glycosylated rest Asn15 til forkert foldning og reduceret G-proteinaktivering9,10. Den rhodopsin, der anvendes i denne rapport, blev udtrykt i cellen HEK 293 GnTI-mangelfuld. Men, SDS-PAGE viste tilstedeværelsen af to arter af rhodopsin. Denne heterogenitet kunne forhindre krystaldannelse og derfor deglycosylation ved hjælp af peptid-N-glycosidase F (PNGase F) og endoglycosidase F1 (Endo F1) blev testet. Det deglycosylated produkt var kendetegnet ved SDS-PAGE og flydende kromatografi-masse spektrometri (LC-MS) til at identificere niveauet af glycosylation og dens homogenitet.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol til screening af vaskemiddel er detaljeret for 30 g HEK293 cellepellet som udgangsmateriale.
1. Materialer, kemikalier og reagenser
BEMÆRK: Alle opløsninger fremstilles ved hjælp af reagenser af analytisk kvalitet og ultrarent vand, som renses af deioniseret vand for at opnå en resistivitet på 18,2 MΩ∙cm ved 25 °C.
- Løsninger til bufferlager
- 10x fosfat buffered saltvand (10x PBS).
- Forbered HEPES buffer: 1 M, titreret til pH 7,5 med NaOH.
- Forbered 5 M NaCl.
- Klargør 2 M MgCl2.
BEMÆRK: Alle stamopløsninger føres gennem et filter på 0,22 μm for at opretholde deres sterilitet.
- Løsninger til vaskemiddel
- Forbered dodecyl maltoside (DDM), 10% (w/v).
- Forbered decyl maltoside (DM), 10% (w/v).
- Forbered 6-cyclohexyl-hexyl maltoside (Cymal-6), 10% (w/ v).
- Forbered 5-cyclohexyl-pentyl maltoside (Cymal-5), 10% (w / v).
- Forbered nonyl glucoside (C9G), 10% (w/v).
- Forbered lauryl maltose neopentyl glycol (LMNG), 5% (w/ v).
- Forbered decyl maltose neopentyl glycol (DMNG), 10% (w / v).
- Forbered cymal-6 neopentylglycol (C6NG), 10% (w/v).
- Forbered cymal-5 neopentyl glycol (C5NG), 10% (w/ v).
- Forbered octylglucose neopentyl glycol (OGNG), 10% (w/v).
BEMÆRK: For 10% vaskemiddelstamopløsning opløses 1 g vaskemiddelpulver i ultrarent vand med skånsom rokkende og justerderefter det endelige volumen til 10 ml. Opløsning af vaskemiddelbestand skal opbevares ved -20 °C til langtidsopbevaring og på is under arbejdet.
FORSIGTIG: Vaskemidler på flaske anbefales normalt at opbevare ved -20 °C fryser. Flaskerne med vaskepulver skal opvarmes til stuetemperatur, før de åbnes. Vaskemiddelpulver er hygroskopisk, så temperatureklibation vil forhindre dannelse af kondens, der vil våd vaskemidlet.
- Andre kemikalier og reagenser
- Forbered 1D4 immunaffinity agarose harpiks: 10 ml af 50% gylle.
BEMÆRK: De 1D4 immunaffinity agarose er agarose perler forbundet med monoklonale Rho1D4 antistof, som binder de sidste 9 aminosyrer af kvæg rhodopsin TETSQVAPA som epitop. Den 1D4 immunaffinity agarose virker som affinitet rensning materiale til at fange proteiner, der indeholder en C-terminal 1D4 sekvens. Dette rensningsmateriale kan fremstilles9,,11 eller købes. - Der fremstilles 9-cis retinal opløsning: 1 mM, opløst i 100% ethanol.
BEMÆRK: Undgå lyseksponering for retinal under klargøring og opbevaring. - Der fremstilles 1D4-peptid (sekvens TETSQVAPA): 800 μM, opløst i vand.
- Forbered 1D4 immunaffinity agarose harpiks: 10 ml af 50% gylle.
- Buffere
BEMÆRK: Alle buffere blandes fra stamopløsningerne til den ønskede koncentration. Alle buffere nedkøles til 4 °C før brug.- Forbered buffer A: PBS, 0,04% DDM.
- Klargør buffer B: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,04% DDM.
- Klargør Buffer C: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl og vaskemiddel i deres arbejdskoncentration, der er anført i tabel 1.
- Klargør buffer D: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM naCl.
- Klargør Elueringsbuffer: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 80 μM 1D4 peptid og vaskemiddel i deres arbejdskoncentration.
- Forbered SEC buffer: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,025% DDM; gennem et 0,22 μm filter.
- Opløsningsmiddel til LC-MS
- Opløsningsmiddel A: acetonitril indeholdende 0,1% myresyre.
- Opløsningsmiddel B: Ultrarent vand indeholdende 0,1% myresyre.
- Opløsningsmiddel C: iso-propanol.
2. Cellemembranopløselighed og proteinekstraktion
- Tø 30 g HEK293 GnTI- cellepellet, der udtrykker bovin rhodopsin mutant N2C/M257Y/D282C3,,9 til stuetemperatur, tilsæt 120 ml 1x PBS buffer indeholdende proteasehæmmer cocktail og homogenisere ved hjælp af en Dounce homogenizer eller en elektrisk homogenisator (13.000 rpm for 30 s). Den homogeniserede celleophængopsamles i et bægerglas, og lydstyrken justeres til 150 ml.
BEMÆRK: 30 g cellepellet svarer til 3 L cellekultur ved 2 x 106 celle/ml-tæthed. - Tilsæt forsigtigt 10% DDM til de homogeniserede celler for at give en endelig koncentration på 1,25%. Rør på is i 1 time.
- Cellelysatet centrifugeres ved 4 °C og 150.000 x g i 45 minutter for at fjerne det uopløselige snavs.
- Supernatanten overføres til en 500 ml flaske, og 10 ml af 1D4-immunaffinitetagaroseharpiksen overføres (50% gylle). Opløsningscellelysat og harpiks blandes forsigtigt i 4 timer eller natten over ved 4 °C.
- Læg lysat/harpiksblandingen i en åben kolonne for at opsamle harpiksen.
- Harpiksen vaskes med 10 kolonnevolumener (CV) af vaskebuffer A.
BEMÆRK: Kolonnelydstyrken er lydstyrken for den pakkede (100 %) agaroseharpiks, der anvendes. I dette tilfælde er 1 CV 5 ml. - Resuspender harpiksen med 2 CV buffer A.
FORSIGTIG: Fra trin 2.8 og fremefter er trin, der skal udføres under svagt rødt lys, mærket med "[Mørk]" i begyndelsen af beskrivelsen. - [Mørk] 9-cis retinal til den resuspenderede harpiks til den endelige koncentration på 50 μM. Bland forsigtigt ved 4 °C i 4-16 timer i mørke.
BEMÆRK: En kortere inkubationstid kan føre til ufuldstændig rekonstitution af retinal. - [Mørk] Fjern flow gennem fra kolonnen. Vask harpiks med 20 CV Buffer A, efterfulgt af 15 CV Buffer B.
- [Mørk] Resuspender harpiksen i 2 CV Buffer B, og divider derefter harpikssuspensionen ligeligt til 10 10 ml bortskaffelseskolonner.
- [Mørk] Strømmen fjernes fra kolonnen, og genopslæmden i 1 ml Buffer C. Inkuber i 1 time ved 4 °C.
- [Mørk] Gentag trin 2.11.
- [Mørk] Fjern flowet fra kolonnen, og resuspender derefter harpiksen i 0,8 ml elueringsbuffer for hver kolonne. Bland forsigtigt i 2 timer.
- [Mørk] Opsaml eluering fra kolonnen i et 2 ml rør.
- [Mørk] Resuspender harpiksen i 0,7 ml Elution Buffer for hver kolonne. Bland forsigtigt i 1 time.
- [Mørk] Opsaml eluering fra kolonnen i samme rør.
3. UV-VIS spektroskopi
- Klargør spektrofotometeret til at dække måleområdet 250-650 nm. Optag baseline ved hjælp af vand eller Elueringbuffer.
- [Mørk] Læg det eluerede protein på kvartscuvetten. Mål proteinprøvens spektrum.
- [Mørk] Belyse proteinet direkte i kuvetten i 2 minutter med lys passeret gennem et 495 nm langpasfilter.
- Mål spektret af den belyste prøve.
- Udfør den samme måling for alle proteinprøver renset i de øvrige 9 rengøringsmidler, både mørke og oplyste tilstande.
- Afbilde kurverne (absorbans versus bølgelængde) i X-Y-punktdiagrammet.
4. Automatiseret størrelsesudelukkelseskromatografi af rhodopsin og rhodopsin-mini-Go kompleks
- [Mørk] Proteinet koncentreres til 100 μL ved centrifugering ved hjælp af en centrifugeringskoncentrator med en molekylvægtsafskæring (MWCO) på 30 kDa ved 4 °C. Overkoncentrerede prøver kan fortyndes ved hjælp af flowet fra koncentratoren eller buffer C. For at bestemme koncentrationen af proteinprøven måles absorbansved 280 nm ved hjælp af et spektrofotometer.
BEMÆRK: Fra trin 4.2 og fremefter kræver forsøget ikke et mørkt miljø, og derfor kan prøverne fremstilles under normalt lys. - Der fremstilles 100 μL rhodopsin ved 0,7 mg/ml for hver vaskemiddeltilstand.
- Der fremstilles 100 μL rhodopsin (0,7 mg/ml) og mini-Go4,,12 (0,2 mg/ml) for hver vaskemiddeltilstand. Supplere blandingen med 1 mM MgCl2. Belyse blandingen med lys fra en 495 nm long-pass filter og inkubere i 30 min.
- Monter en 24 ml gelfiltreringskolonne med et fraktioneringsområde på 10-600 kDa af et kugleprotein på en væskekromatografirenser. Kolonnen med SEC-buffer en ekvilibreret.
BEMÆRK: Renseren for flydende kromatografi er udstyret med en autosampler, en bølgelængdedetektor og en fraktionsopsamler. - Prøverne overføres til autosamplerhætteglasne, og de anbringes i prøvebakken. Program før en metodefil for at automatisere SEK-sekvensering af sek. Absorbansen registreres ved 280 nm og 380 nm.
- Topfraktioneraf rhodopsin og rhodopsin-mini-G-kompleks indsamles ved retentionsvolumen ca. 12,9 ml.o
- Analysér de venstre rhodopsinprøver fra trin 4.2 og de maksimale fraktioner af rhodopsin-mini-Go-kompleks på 4-12% SDS-denatureringsgradientgeler med Coomassie blå farvning.
- Elueringskromatogrammet afbildes (A280 eller A380 i forhold til retentionsvolumen).
5. Deglycosylation og LC-MS undersøgelse
- Til LC-MS-undersøgelsen må rhodopsinprøven kun anvendes, der er renset i LMNG-vaskemiddel.
- Der fremstilles en 200 μL blanding af rhodopsin ved 1 mg/ml og PNGase F13 ved 0,01 mg/ml. Bland godt og inkuber ved 4 °C natten over.
- Der fremstilles en 200 μL blanding af rhodopsin ved 1 mg/ml og Endo F113 ved 0,01 mg/ml. Bland godt og inkuber ved 4 °C natten over.
- Analysér fordøjelsesresultatet ved SDS-PAGE og Coomassie blå farvning.
- Koncentrat ubehandlede og Endo F1-behandlede rhodopsinprøver og underkastes SEC-rensning i buffer D.
BEMÆRK: Dette er for at forberede prøven med minimal mængde vaskemiddel til LC-MS-undersøgelse. Buffer D indeholder ikke noget vaskemiddel, men på grund af den langsomme off-rate af LMNG fra en membran protein14, rhodopsin vil ikke samle. - Opsaml spidsfraktionen ved retentionsvolumen på ca. 12,9 ml. Koncentrat til 1 mg/ml ved hjælp af en centrifugeringskoncentrator (MWCO 30 kDa).
- 10 μg af proteinet indsprøjtes i en Reprosil 200 C18-AQ kolonne, og kolonnen udrevs ved hjælp af den lineære gradientmetode med opløsningsmiddelsammensætningen og indstillingerne i tabel 2. Flowet er opdelt til 25% for massespektrometer og 75% for UV-detektion.
Representative Results
Den eksperimentelle arbejdsgang for forberedelse og analyse af prøver er sammenfattet i figur 1. Ved hjælp af åbne kolonner til små affinitetrensning gav os mulighed for at forberede prøver i mange forskellige vaskemiddel forhold parallelt (Figur 1A). En sådan mindre rensningsopsætning gav tilstrækkeligt protein til yderligere analyser ved hjælp af UV-VIS-spektroskopi, SEC og SDS-PAGE (Figur 1B-C).
UV-VIS spektroskopi afslørede rhodopsin stabilitet
Retinalreredosinens stabilitet blev vurderet ved optisk absorbans (figur 2). I mørke tilstand er 9-cis retinal kovalent forbundet med Lys296 som en protonated Schiff base. Efter belysning, er 9-cis retinal isomerized til all-trans isoform og Schiff base link er deprotonated. Den protonerede 9-cis retinal giver en absorptionstop ved 488 nm, mens deprotonerede all-trans retinal har et højdepunkt på 380 nm. UV-VIS-spektreaf rhodopsin i DDM viste den typiske absorption af 9-cis retinal-bundet og lysaktiveret rhodopsin, hvor en blå forskydning på 108 nm med nogenlunde samme optiske tæthed blev tydeligt observeret(Figur 2A, øverste venstre panel). Når rhodopsin er destabiliseret, og derefter den bindende lomme til retinale ændringer, hvilket resulterer i retinal deprotonation og muligvis dissociation. Hvis dette sker, og så spektret viser bidrag fra deprotonation samt den frie form af retinal15. Derfor har vi bestemt effektiviteten af retinal rekonstitution i rhodopsin ved absorbansforholdet mellem proteinet (280 nm) og retinal (488 nm for protonated 9-cis retinal, 380 nm for deprotonated all-trans retinal) (Figur 2B). Rhodopsinprøver, der er renset i de klassiske rengøringsmidler (DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5, C9G), viser samme optiske profil. De prøver, der er renset i NPG-vaske- og rengøringsmidlerne (LMNG, DMNG, Cymal-6NG, Cymal-5NG), viser imidlertid optiske profiler, der tyder på et suboptimalt bindingsmiljø for retinal med undtagelse af OGNG-prøven, som gav den samme optiske profil som DDM-prøven.
Størrelsesudelukkelseskromatografi viste prøvens renhed og proteinmonodispersitet.
SEC er et effektivt og robust analyseværktøj til vurdering af proteinprøver under forberedelse og screening. Det validerer prøvens renhed fra det tidligere rensningstrin samt proteinmolekylernes monodispersitet. For rhodopsin og mini-Go-komplekset blev prøvekvaliteten fortolket ud fra absorptionskurverne ved 280 nm og 380 nm (figur 3A). De 280 nm spor viste tilstedeværelsen af protein, og 380 nm spor viste tilstedeværelsen af retinal. Eventuelle signaler, der vises i tomrummet (ca. 8 ml ved brug af denne kolonne) blev tilskrevet proteinaggregater. Resultaterne viste derfor, at prøver fremstillet i de klassiske vaske- og rengøringsmidler var i monospredningstilstand bortset fra C9G, hvor en del af den samlede mængde forekom. I modsætning hertil indeholdt prøver, der blev fremstillet ved hjælp af vaske- og rengøringsmidler af NPG-typen, langt flere aggregater end C9G-prøven. LMNG og Cymal-6NG førte til den mest samlede dannelse, men der blev observeret færre aggregater i DMNG og Cymal-5NG. Undtagelsen var OGNG, som viste en lignende profil som DDM. Proteinaggregater, der eluerer ved tomrummet, havde også dårligere retinal belægning, som det fremgår af Forholdet A280/A380, der var steget i forhold til toppen ved retentionsvolumenet på ~12,9 ml svarende til 135 kDa. En anden funktion, vi observerede, var, at både rhodopsin og rhodopsin-mini-Go elueret omkring samme retentionsvolumen (Figur 3B). Dette er ikke overraskende, fordi den tilsyneladende molekylvægt af vaskemiddel-bundet rhodopsin var 120 kDa og rhodopsin-mini-Go 144 kDa. Vi kunne derfor ikke fastslå kompleks dannelse blot fra SEC data, så SDS-PAGE blev brugt til yderligere at analysere SEC-renset prøve.
SDS-PAGE bekræftet kompleks dannelse
SDS-PAGE er en standardmetode til identifikation af proteinkomponenterne i en prøve. Koncentreret rhodopsin (før SEC rensning) blev analyseret af SDS-PAGE for at bekræfte dens renhed, og viste to bånd nær 37 kDa og et smurt bånd over 50 kDa (Figur 4A). De nederste to bånd blev senere bekræftet at have forskellige N-glycosylation stater. Båndet over 50 kDa blev fortolket som aggregerede rhodopsin oligomers induceret af SDS-PAGE prøve buffer, fordi disse aggregater ikke blev observeret i SEC eller andre påvisningsmetoder. Da SEC-data ikke kunne bekræfte kompleks dannelse, blev SEC-eluerede fraktioner fra rhodopsin-mini-Go-prøver analyseret ved hjælp af SDS-PAGE. SDS-PAGE viste proteinbånd af både rhodopsin og mini-Go under alle vaskemiddelforholdene, hvilket tyder på, at komplekset blev dannet uanset valget af vaskemiddel (figur 4B).
LC-MS spektrometri identificeret N-glycosylation mønster i rhodopsin
Rhodopsin prøver fra både affinitet rensning og SEC viste to proteinbands, der migrerede med en tilsyneladende molekylvægt på omkring 37 kDa på en SDS-PAGE gel, som ikke kunne adskilles af SEC, når du bruger en 24-ml kolonne. Forskellige mønstre af N-glycosylation på heterologt udtrykt rhodopsin fra HEK 293 GnTI- celler var den mest sandsynlige forklaring. Derfor blev to enzymer, PNGase F og Endo F1, testet for deres evne til at deglycosylate rhodopsin. Fra SDS-PAGE data, reducerede Endo F1 molekylvægten af begge proteinbånd i et enkelt produkt, mens PNGase F fordøjelsen stadig gav to populationer (Figur 5A). De ufordøjede og Endo F1-behandlede prøver blev analyseret ved hjælp af LC-MS spektrometri til at identificere masserne af forskellige arter. Dataene viste, at rhodopsin produceret i HEK 293 GnTI- celler indeholdt enten en eller to N-glycaner, med en forskel i masse på 1014±1 Da. Endo F1-behandlet rhodopsin ikke indeholdt nogen N-glycaner og havde en masseforskel på 2027± 1 Da sammenlignet med rhodopsin indeholdende to N-glycaner. Disse resultater er i overensstemmelse med fraværet af enzymet N-acetylglucosaminyltransferase I i den cellelinje, der anvendes til at udtrykke rhodopsin, hvilket resulterer i, at alle N-glycaner har strukturen GlcNAc2Man5, (masse 1014 Da).
Figur 1: Prøveforberedelse og karakterisering til vaskemiddelscreeningseksperiment. (A) Fremstilling af rhodopsinprøver i forskellige vaske- og rengøringsmidler under rensning. bB) Metoder, der anvendes i protokollen: UV-VIS-spektroskopi, størrelsesudelukkelseskromatografi (SEK), SDS-PAGE og flydende kromatografi-massespektrometri (LC-MS). (C) Eksperimentel arbejdsgang for karakterisering af rhodopsin, rhodopsin-mini-Goog deglycosylation produkt af rhodopsin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: UV-VIS-spektroskopi af rhodopsin. (A) UV-VIS-spektre af rhodopsin. Spektre af den mørke tilstand, 9-cis retinal-bundet rhodopsin er vist i blå kurver. Efter belysning, 9-cis retinal er deprotonated og isomerizes i all-trans retinal, og spektre af belyst rhodopsin er vist som røde kurver. Den kemiske struktur af hvert vaskemiddel er vist som en indsat. (B) Forholdet mellem A280/A488 (blå bjælke) og A280/A380 (rød bjælke) viser stabiliteten af rhodopsin i henholdsvis mørk tilstand og lystilstand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Størrelsesudelukkelseskromatografiprofiler af rhodopsin og rhodopsin–mini-Go kompleks renset i 10 forskellige vaske- og rengøringsmidler. A Det højre panel repræsenterer SEC profiler af prøver renset i NPG type rengøringsmidler. Standardmarkørproteinernes profil vises som overlejring sammen med DDM-prøven. Fortolkningen af topprofilerne vises for DMNG, med det ideelle scenarie (ingen aggregater) set for DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 og OGNG. (B) DEN forstørrede profil af OGNG-prøven i retentionsvolumenet på 12-14 ml. Alle prøver blev analyseret ved hjælp af en Superdex200 Increase 10/300 GL kolonne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: SDS-PAGE analyse af rhodopsin og rhodopsin/mini-Go kompleks. (A) Rhodopsinprøver renset i vaske- og rengøringsmidler. Det smurte bånd på over 50 kDa tilskrives de aggregerede rhodopsinoligomerer, der induceres af SDS-PAGE-prøvebufferen. (B) SEC-rensede prøver af rhodopsin/mini-Go kompleks. Rhodopsin med 1 og 2 N-glycan og mini-Go er afbildet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Identifikation af glycosylation i rhodopsin. (A) SDS-PAGE analyse af deglycosylated rhodopsin ved hjælp af PNGase F og Endo F1. (B) LC-MS spektre af rhodopsin uden (øverste panel) og med deglycosylation af Endo F1 (nederste panel). Til forberedelse af rhodopsin-mini-Go-komplekset til krystallisering valgte vi Endo F1 over PNGase F, fordi Endo F1 leverede en enkelt homogen art af rhodopsin. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Vaskemiddel | Arbejdskoncentration (%) | Kritisk micellekoncentration (%) |
| DDM | 0.025 | 0.0087 |
| Dm | 0.12 | 0.087 |
| Cymal-6 delte et | 0.05 | 0.028 |
| Cymal-5 delte et | 0.2 | 0.12 |
| C9G (C9G) | 0.5 | 0.2 |
| LMNG (LMNG) | 0.01 | 0.001 |
| DMNG (DMNG) | 0.01 | 0.0034 |
| Cymal-6NG delte et et | 0.015 | Ikke tilgængelig; skal være lavere end 0,056 |
| Cymal-5NG delte et | 0.02 | 0.0056 |
| OGNG (OGNG) | 0.15 | 0.058 |
Tabel 1: Koncentrationaf p-middel med buffer C.
| Tid (min) | Opløsningsmiddel A (%) | Opløsningsmiddel B (%) | Opløsningsmiddel C (%) | Strømningshastighed (ml/min. |
| 0 | 0 | 95 | 5 | 0.5 |
| 1 | 0 | 95 | 5 | 0.5 |
| 5 | 20 | 75 | 5 | 0.6 |
| 25 | 85 | 10 | 5 | 0.6 |
| 26 | 90 | 5 | 5 | 0.6 |
| 30 | 90 | 5 | 5 | 0.6 |
Tabel 2: Parametre for kolonneeluering.
Discussion
Succesen med proteinkrystallisering er stærkt afhængig af proteinprøven, især membranproteiner og deres komplekser på grund af komplikationforårsaget af rengøringsmidler. Denne rapport demonstrerer screening af vaske- og rengøringsmidler og evaluering af prøvekvaliteten for GPCR-mini-G-proteinsignalkomplekser. En række forskellige metoder er blevet udbredt til at studere den biokemiske egenskab af membranproteiner, for eksempel termostabilitetsanalyse ved hjælp af fluorescerende farvestoffer16,17, bindende analyse til påvisning af kompleks dannelse ved at måle ændringen i tryptofanfluorescenssignal18 eller resonansenergioverførsel med biosensorer19. Men de kemiske miljøer, der anvendes i disse metoder er helt forskellige fra dem til fremstilling af en krystallisering prøve, enten proteiner er på en tusind gange lavere koncentration for fluorescens-baseret måling, eller proteiner er indlejret i lipid tolag eller i en fast vaskemiddel tilstand. I denne protokol er de anvendte metoder også standardiseret i storstilet prøveforberedelse før krystallisering. Derfor kan de optimerede parametre nemt overføres til krystalliseringsskalaforberedelse uden yderligere større screening og optimering.
Formålet med denne protokol er at optimere præparatet af et stabilt og homogent GPCR-mini-G-proteinkompleks til krystallisering af dampdiffusion og konstruktionsbestemmelse ved røntgenkrystallografi. Protokollen integrerer et sæt metoder til kvalitativt at vurdere virkningen af vaskemiddel og deglycosylation under udarbejdelsen af rhodopsin-mini-Go kompleks. Rhodopsin ved inaktiv tilstand og lysaktiveret tilstand, der er bundet til og uden transducinpeptid, er blevet krystalliseret, når det renses i vaske- og rengøringsmidlerne octyl glucoside (C8G)20,21,22 og C9G23,24. Da rhodopsin-mini-Go o-komplekset, der er renset i C8G og C9G, ikke gav krystaller (data, der ikke blev vist), undersøgte vi derefter en bredere vifte af andre vaske- og rengøringsmidler ved hjælp af den beskrevne strategi (figur 1). Ved at drage fordel af lysfølsomheden af rhodopsin, kunne vi meget vel følge rekonstitution af retinal ved bølgelængder andre end 280 nm. I både UV-VIS spektroskopi og SEC, vi opdaget retinal på enten 380 nm eller 488 nm. Men de fleste membranproteiner har ikke en så praktisk chromophore at følge funktionalitet under rensning. Andre muligheder ville være at gøre en ligand påviselig ved at tilføje en letpåviselig chromophore eller ved hjælp af radioligand-binding og termiske skift analyser25.
Rhodopsin har en molekylvægt på 40 kDa. På grund af massen af vaskemiddel det binder, dens tilsyneladende molekylvægt på SEC er omkring 120 kDa. Det er derfor ingen overraskelse, at bindingen af mini-Go (24 kDa) ikke var let opdaget på SEC, da dette ville nødvendiggøre differentiering af proteiner med tilsyneladende masser af 120 kDa og 144 kDa. Analyse af SEC fraktioner ved SDS-PAGE blev derfor brugt til at bekræfte prøven renhed og kompleks dannelse. Selv hvis SEC profiler viser et klart skift ved kompleks dannelse, anbefales det stadig at udføre SDS-PAGE analyse for at bekræfte den komplekse dannelse med korrekte bindende partnere i stedet for andre co-renset protein forurenende stoffer.
Både rhodopsin og mini-Go blev renset i milligram mængder, som gjorde det muligt at anvende lav følsomhed påvisning af komplekserne, såsom UV-VIS absorption under SEC og Commassie Blue farvning af SDS-PAGE geler. Hvis prøverne er begrænsede, bør der anvendes mere følsom detektion, såsom en LC-renser udstyret med en fluorescensdetektor til sporing af tryptofansignaler fra proteinet (280 nm excitation, 350 nm emission) og sølvfarvning for SDS-PAGE geler. En anden fremgangsmåde ville være at smelte et fluorescerende protein, såsom grøn fluorescens protein (GFP) til protein af interesse, som også ville gøre det muligt påvisning selv under proteinudtryk26, men det bør fjernes før krystallisering.
Det er vigtigt at sikre, at det rensede protein også er fri for heterogenitet som følge af variable PTM'er. I det tilfælde, der er beskrevet her, blev de to populationer af rhodopsin observeret på SDS-PAGE geler karakteriseret som havende enten en eller to N-glycaner. Variabel ændring af et protein vil potentielt forhindre dannelsen af velspredende krystaller, så vi derfor deglycosylated rhodopsin. Den endoglycosidase Endo F1 var den mest effekt endoglycosidase testet og behandling førte til en enkelt art af ulysglyceret receptor, mens PNGase F kun delvist fjernet glycaner på rhodopsin og resulterede i en blanding af rhodopsin fuldt ulyksiveret eller med en N-anglycerig forblev. Rhodopsin uden deglycosylase behandling er blevet med succes krystalliseret3,27,28, og N-glycan på rhodopsin Asn15 er vigtigt at danne krystal kontakt i disse tilfælde. I tilfælde af rhodopsin-mini-Go,er det nødvendigt at fjerne N-glycaner af Endo F1 at opnå krystaller. Der er ingen standardiseret regel til at deglycosylate proteiner af interesse før krystallisering, men fjernelse af heterogene PTMs bør overvejes, når proteiner undlader at krystallisere efter omfattende krystallisering forsøg.
De data og metoder, der er beskrevet her guidede os til at vælge OGNG som den mest foretrukne vaskemiddel til krystallisering af rhodopsin-mini-Go kompleks på grund af sin lille micelle størrelse og dets evne til at stabilisere komplekset. Vi brugte også Endo F1 til at sikre, at renset rhodopsin var en homogen art. Krystaller blev efterfølgende opnået, og vi bestemmes krystal struktur til ~ 3,1 Å4, som kun var den tredje krystal struktur af en GPCR-G protein signalering kompleks14,29.
For membranproteiner, der er bundet med og uden partnerprotein, bør de betragtes som to forskellige proteiner. Et protein i forskellige funktionelle tilstande har forskellige konformiteter og er på forskellige energiniveauer. Det anbefales derfor at optimere forberedelsesprotokollen for hver funktionel tilstand, da parameteren for inaktiv tilstand muligvis ikke kan overføres fuldt ud til den aktiverede tilstand. Også, for ikke at nævne ændringen i protein egenskab kompliceret ved at binde en partner protein. Protokollen bruger metoder, der er standardiseret til fremstilling af en krystalliseringsprøve til at forberede inaktivt membranprotein i forskellige vaske- og rengøringsmidler, efterfulgt af proteinaktivering og kompleks dannelse, og til at karakterisere proteinkvaliteten. Således kan denne protokol let generaliseres til andre membranproteiner og deres komplekser til strukturelle undersøgelser med mindre ændringer.
Disclosures
CGT er konsulent og medlem af Det Videnskabelige Rådgivende Udvalg for Sosei Heptares. Alle de andre forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker prof. Dr. Gebhard F. X. Schertler for hans langsigtede støtte i dette projekt, Dr. Roger JP Dawson og Hoffmann La Roche for støtte i cellekultur. Dette arbejde blev sponsoreret af Swiss National Science Foundation (tilskud 210030_153145 og 310030B_173335 til GFXS), og finansiering til CGT fra Det Europæiske Forskningsråd (EMPSI, 339995) og Medical Research Council (MRC U105197215). FP anerkender ETH Zürich gennem Det Nationale Center for Kompetence inden for Forskning Molekylær Ultrahurtig Videnskab og Teknologi (NCCR MUST) og ETH Femtosecond og Attosecond Science and Technology (ETH FAST) programmer. FP, JM, AB og CJT anerkender langsigtet finansiel støtte fra Paul Scherrer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
| 9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
| C9G | Anatrace | N324 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
| Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
| Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
| Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
| Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
| DDM | Anatrace | D310 | |
| DM | Anatrace | D322 | |
| DMNG | Anatrace | NG322 | |
| Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
| Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
| FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
| HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
| LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | - | |
| LMNG | Anatrace | NG310 | |
| Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
| Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
| NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
| OGNG | Anatrace | NG311 | |
| PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
| Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
| Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
| Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
| ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
| UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
| Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | - |
References
- Tate, C. G. Practical considerations of membrane protein instability during purification and crystallisation. Methods in Molecular Biology. 601, Clifton, N.J. 187-203 (2010).
- Lebon, G., Bennett, K., Jazayeri, A., Tate, C. G. Thermostabilisation of an agonist-bound conformation of the human adenosine A(2A) receptor. Journal of Molecular Biology. 409 (3), 298-310 (2011).
- Deupi, X., et al. Stabilized G protein binding site in the structure of constitutively active metarhodopsin-II. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (1), 119-124 (2012).
- Tsai, C. -J., et al. Crystal structure of rhodopsin in complex with a mini-G o sheds light on the principles of G protein selectivity. Science Advances. 4 (9), (2018).
- Carpenter, B., Tate, C. G. Engineering a minimal G protein to facilitate crystallisation of G protein-coupled receptors in their active conformation. Protein Engineering Design and Selection. 29 (12), 583-594 (2016).
- Chae, P. S., et al. Maltose-neopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization, stabilization and crystallization of membrane proteins. Nature Methods. 7 (12), 1003-1008 (2010).
- Loll, P. J. Membrane proteins, detergents and crystals: what is the state of the art. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (12), 1576-1583 (2014).
- Chae, P. S., et al. Glucose-neopentyl glycol (GNG) amphiphiles for membrane protein study. Chemical communications. 49 (23), Cambridge, England. 2287-2289 (2013).
- Standfuss, J., Xie, G., Edwards, P. C., Burghammer, M., Oprian, D. D., Schertler, G. F. X. Crystal structure of a thermally stable rhodopsin mutant. Journal of Molecular Biology. 372 (5), 1179-1188 (2007).
- Kaushal, S., Ridge, K. D., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: the role of asparagine-linked glycosylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (9), 4024-4028 (1994).
- Molday, L. L., Molday, R. S. 1D4: a versatile epitope tag for the purification and characterization of expressed membrane and soluble proteins. Methods in Molecular Biology. 1177 (604), Clifton, N.J. 1-15 (2014).
- Carpenter, B., Tate, C. G. Expression and Purification of Mini G Proteins from Escherichia coli. Bio-Protocol. 7 (8), (2017).
- Grueninger-Leitch, F., D'Arcy, A., D'Arcy, B., Chène, C. Deglycosylation of proteins for crystallization using recombinant fusion protein glycosidases. Protein Science. 5 (12), 2617-2622 (1996).
- Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
- Loginova, M. Y., Rostovtseva, Y. V., Feldman, T. B., Ostrovsky, M. A. Light damaging action of all-trans-retinal and its derivatives on rhodopsin molecules in the photoreceptor membrane. Biochemistry (Moscow). 73 (2), 130-138 (2008).
- Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale Fluorescent Thermal Stability Assay for Membrane Proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
- Sonoda, Y., et al. Benchmarking Membrane Protein Detergent Stability for Improving Throughput of High-Resolution X-ray Structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
- Maeda, S., et al. Crystallization scale preparation of a stable GPCR signaling complex between constitutively active rhodopsin and G-protein. PloS One. 9 (6), 98714 (2014).
- Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
- Singhal, A., Guo, Y., Matkovic, M., Schertler, G., Deupi, X., Yan, E. C. Y. Structural role of the T 94 I rhodopsin mutation in congenital stationary night blindness. EMBO Report. 17 (10), 1-10 (2016).
- Choe, H. -W., et al. Crystal structure of metarhodopsin II. Nature. 471 (7340), 651-655 (2011).
- Mattle, D., et al. Ligand channel in pharmacologically stabilized rhodopsin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3640-3645 (2018).
- Okada, T., Fujiyoshi, Y., Silow, M., Navarro, J., Landau, E. M., Shichida, Y. Functional role of internal water molecules in rhodopsin revealed by X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 5982-5987 (2002).
- Blankenship, E., Vahedi-Faridi, A., Lodowski, D. T. The High-Resolution Structure of Activated Opsin Reveals a Conserved Solvent Network in the Transmembrane Region Essential for Activation. Structure. 23 (12), 2358-2364 (2015).
- Magnani, F., et al. A mutagenesis and screening strategy to generate optimally thermostabilized membrane proteins for structural studies. Nature Protocols. 11 (8), 1554-1571 (2016).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), London, England: 1993 673-681 (2006).
- Standfuss, J., et al. The structural basis of agonist-induced activation in constitutively active rhodopsin. Nature. 471 (7340), 656-660 (2011).
- Singhal, A., et al. Insights into congenital stationary night blindness based on the structure of G90D rhodopsin. EMBO reports. 14 (6), 520-526 (2013).
- Carpenter, B., Nehmé, R., Warne, T., Leslie, A. G. W., Tate, C. G. Structure of the adenosine A(2A) receptor bound to an engineered G protein. Nature. 536 (7614), 104-107 (2016).
