Summary
I arbetsflödet beskrivs prestanda för tids- och kostnadseffektiv berikning av flera proteinändringar efter translationella (PTM) samtidigt för kvantitativ global proteomanalys. Protokollet använder peptid-nivå PTM anrikning med flera konjugerade antikroppar, följt av dataoberoende förvärv massa pektrometri analys för att få biologiska insikter i PTM överhörning.
Abstract
Studera flera post-translationella modifieringar (PTM) av proteiner är ett viktigt steg för att förstå PTM överhörning och få mer holistiska insikter i proteinfunktion. Trots vikten av multi-PTM anrikning studier, få studier undersöka mer än en PTM i taget, delvis på grund av kostnader, tid och stora proteinmängder som krävs för att utföra flera globala proteomiska analys av PTM. Den an-pot" affinitet srikulation som beskrivs i detta protokoll övervinner dessa hinder genom att tillåta samtidig identifiering och kvantifiering av peptider med lysinrester som innehåller acetylation och koncishet PTMs med låga mängder prov Input. Protokollet innebär beredning av proteinlysa från muslever av SIRT5 knockout möss, prestanda trypsin matsmältning, berikning för PTMs, och prestanda av massa spektrometrisk analys med hjälp av en dataoberoende förvärv (DIA) arbetsflöde. Eftersom det här arbetsflödet gör det möjligt att berika två PTM-produkter från samma prov samtidigt, ger det ett praktiskt verktyg för att studera PTM-överhörning utan att kräva stora mängder prover, och det minskar avsevärt den tid som krävs för provberedning, data förvärv och analys. Dia-komponenten i arbetsflödet ger omfattande PTM-specifik information. Detta är särskilt viktigt vid studier av PTM webbplats lokalisering, som DIA ger omfattande uppsättningar av fragmentjoner som kan beräknas beräkningsmässigt att skilja mellan olika PTM lokalisering isoforms.
Introduction
En myriad av post-translationella ändringar reglerar dynamiskt proteiner och vägar genom effekter på aktiviteten1,signalerar2, och omsättning3,4. Till exempel aktiveras eller inaktiveras proteinkinaser genom tillsats av fosfatgrupper5, och histonacetylation och andra ändringar ger en mekanism för att ändra kromatinstrukturen och fungera som transkriptionella regleringsmekanismer6,7. Under de senaste åren har bevis monterats att flera PTM-grupper arbetar i samförstånd eller konkurrera r att reglera proteinfunktion eller aktivitet8,9,10,11. Därför är förståelse PTM överhörning ett växande behov i PTM forskning. De flesta tillgängliga proteomiska arbetsflöden för att identifiera och kvantifiera PTM-webbplatser fokuserar dock på enstaka ändringar, snarare än samspelet mellan flera ändringar. Det beskrivna arbetsflödet korrelerar specifika proteinmodifiering "hot-spots" och lysinrester som modifieras av flera olika PTM.
Det finns ett växande behov i det vetenskapliga samfundet för genomförbara metoder för att studera flera PTM samtidigt12. De flesta metoder för att globalt identifiera och kvantifiera platserna för flera typer av PTM är utmanande på grund av de höga kostnader och mängden vävnad som krävs12,13. Inte bara är multi-PTM anrikning experiment tidskrävande när det gäller provberedning, datainsamling och dataanalys, men dessa studier kräver vanligtvis stora och ofta oöverkomliga mängder protein11. Beskrivs här är ett protokoll för samtidig anrikning och analys av flera PTM, som också behandlar flera av dessa hinder och möjliggör storskalig PTM profilering och bedömning mellanhörning mellan olika PTMs14. Detta en-pot arbetsflöde beskriver ett praktiskt sätt för biomedicinska forskare att globalt profil flera PTMs, identifiera co-modifierade peptider, och studera PTM överhörning på ett effektivt och kostnadseffektivt sätt14,15.
Här visas denna metod upp genom att undersöka mitokondriell proteinaylering, som först studerades för över 50 år sedan16. Det koncentrerar sig specifikt på lysinacetylation17 och koncisering18, inklusive samförekomst av dessa ändringar på proteiner och även co-modifiering på peptidnivå. Eftersom studien använder en sirtuin 5 (SIRT5) knockout mus modell, valdes det att fokusera på anrikning av acetylation och koncisathet platser. Detta beslut fattades eftersom koncistningplatser är måltavlor för SIRT5 desuccinylase och förväntas därför visa betydande uppreglering hos KO-möss, vilket gör dem till de mest relevanta PTM i detta fall. Båda PTM är biologiskt relevanta som nyligen sammanfattas av Carrico et al.19. I allmänhet visar acetylation viktiga effekter på genuttryck och metabolism, och koncistivhet har rapporterats för att reglera hjärtmetabolism och funktion20.
Det beskrivna protokollet kan utföras med en låg mängd proteiningångsmaterial (t.ex. 1 mg proteinlysning) och minskar experimentets totala varaktighet genom att minska den tid som ägnas åt provbehandling, MS-förvärv och dataanalys. Ett arbetsflödeschema finns i figur 1. Vi har också använt ännu lägre mängder utgångsmaterial (ner till 100 μg proteinlysa, skala ner mängden pärlor som används därefter), vilket som väntat minskar den totala avkastningen av identifierade acylated peptider; Det ger dock fortfarande mycket värdefulla resultat och kvantifierbara acylated peptider.
Medan så kallade uppifrån och ned eller mitten-down arbetsflöden vanligtvis inte använder proteolytiska matsmältningmetoder (och därmed upprätthålla anslutningen av flera PTMs inom ett protein), fokuserar detta protokoll på en peptid-baserad affinity anrikning strategi för att få extra djup och känslighet för PTM identifiering och kvantifiering(figur 1). Dessutom använder detta peptid-centrerad arbetsflöde moderna masspektrometri metoder, inklusive 1) en kombination av databeroende förvärv (DDA) för att generera spektrala bibliotek, och 2) dataoberoende förvärv (DIA) för korrekt PTM kvantifiering i ett etikettfritt arbetsflöde.
DIA arbetsflöden övervinna provtagning stochasticity av typiska DDA scan system genom att omfattande fragmentera alla peptid signaler inom samplade m / z intervall21. Denna funktion är också mycket fördelaktigt när det gäller webbplats lokalisering, eftersom det är lättare att få information om vilka specifika fragmentjoner ändras inom peptid. Dessutom gör DIA-arbetsflöden identifiering och kvantifiering av mindre PTM-peptidisoformer med identiska prekursorjoner. DIA-metoder kan också bestämma en specifik PTM-platslokalisering inom en peptid baserat på specifika motsvarande fragmentjoner som mäts utförligt hela tiden. DDA-metoder använder dock ofta "dynamisk uteslutning" funktioner som utesluter flera provtagningar av MS/MS för samma prekursorjon, vilket saknar mindre PTM-isoformer.
Den samtidiga anrikningsstrategi som beskrivs här är idealisk för studier som kommer att dra nytta av den globala profilering och kvantifiering av flera PTMs, undersöka PTM-överhörning och förstå de dynamiska interaktionerna mellan ändringar efter översättning. Identifiering av flera berikade PTM-företag i ett kombinerat arbetsflöde har beskrivits av: global, seriell eller parallell anrikning av PTM som innehåller proteolytiska peptider, eller alternativt genom analys av intakta proteiner. I direkt jämförelse med seriell anrikning av acetylation och koncisation, effektiviteten i en pott metod infördes som mycket liknande14. Dessa alternativa protokoll kräver betydande mängder utgångsmaterial och tid och kan vara oöverkomligt dyra. Däremot ger en pottprotokollet en billig och effektiv metod för anrikning av mer än en PTM med efterföljande analys och identifiering.
Muslevervävnader erhålls från SIRT5-knockoutmöss och används här som startmaterial. Detta protokoll kan också utföras för proteinlysning från olika vävnader eller cellkulturexperiment. Detta protokoll kan tillämpas på proteinlysa som erhållits från vävnader eller cellkulturpellets.
Protocol
Alla experiment som beskrivs i protokollet följer riktlinjerna från Buck Institute Institutional Animal Research Committee.
1. Extraktion av protein från homogeniserad vävnad och matsmältning med proteas
- Nyligen förbereda lysbufferten till en slutlig koncentration på 8 M urea, 50 mM triethylammonium bikarbonat (TEAB), 1 μM trichostatin A (TSA), 20 mM nikotinamid, 75 mM natriumklorid (NaCl), 1x proteas/phosphatase inhibitor cocktail (PIC) med HPLC-grade vatten.
- Tillsätt en steril stålpärlsa till ett 2 ml-rör kompatibelt med en beadkvarnhomogenisator, placera sedan vävnadsbiten (ärtstorlek) i röret. Tillsätt lysbuffert (500 μL) och virvel kort för att säkerställa att bufferten täcker vävnadsbiten (tillsätt mer lysbuffert, om det behövs). Placera rör på förkylda adapteruppsättningar, se till att rören balanseras mellan homogenisatorens två adaptrar.
- Homogenisera prover 2x vid 25 Hz i 3 min vardera vid 4 °C. Om vävnaden inte är helt homogeniserad, snurra rören kort och överföra den homogeniserade lysate till ett nymärkt 1,5 ml rör. Tillsätt sedan ytterligare lysbuffert till den återstående vävnadsbiten och upprepa homogeniseringen 2x vid 25 Hz i 3 min vardera. Två omgångar av homogenisering är vanligtvis tillräckliga för att bryta upp vävnaden.
- Ta bort metallbead med en pincett. I mellan varje prov, skölj tweezer med HPLC-grade vatten, HPLC-grade metanol och HPLC-kvalitet vatten igen.
- Kombinera homogeniserade lysningar om två omgångar av homogenisering tillämpades och sonicate prover med en ultraljudsljudare för 10 cykler på 30 s på/30 s av och 4 ° C på hög effekt.
- Centrifugera homogeniserade lyssor vid 14 000 x g i 10 min vid 4 °C för att rensa lysate. Överför supernatant (rensas lysate) till en ny 1,5 ml mikrocentrifugrör, undvika fettskikt som kan sitta ovanpå supernatant och skräp i botten av röret.
- Utför en bicinchoninsyra (BCA) analys för att mäta proteinkoncentrationen av den rensade lysate med en ordentlig utspädning (t.ex. 1:20 och/eller 1:200). Enligt BCA resultat, aliquot 1 mg protein från varje prov.
- Minska proteiner i 4,5 mM dithiothreitol (DTT) vid 37 °C i 30 min med agitation vid 1 400 varv/min. Därefter alkylate proteiner i 10 mM iodoacetamide (IAA) med inkubation i mörkret (plats i låda eller skåp) vid rumstemperatur (RT) i 30 min.
OBS: Alternativa reagenser får användas, såsom N-etymaleimid (NEM) i stället för IAA. - Tillsätt 50 mM TEAB i proverna för att späda ut karbionskoncentrationen till under 2 M. Spot 1 μL av provet på ett pH-papper för att säkerställa att pH-provets pH-tal är mellan 7,0–8,5. Tillsätt trypsin till varje prov vid ett förhållande av 1:50 (trypsin-to-protein, wt/wt) och smälta proteinet med agitation vid 37 °C över natten (ca 14-16 h).
- Släck röten med 10% myrsyra för att nå 1% myrsyra nästa dag. Vortex och snurra kort. Punkt 1 μl av provet på pH-remsor för att säkerställa att smältan är pH = 2-3. Centrifugprover vid 1 800 x g i 15 min vid RT för att pelleta olösligt material.
2. Avsaltning av icke-berikade proteolytiska peptider via storskalig fastfasextraktion
- Skaffa patroner som innehåller C18 harts som kan binda upp till 10 mg protein. Montera dessa patroner i en vakuumapparat för att använda vakuumsug som kan dra vätskan genom patronen under vart och ett av följande steg. Ange en patron för varje peptidprov.
- Tillsätt 800 μl 80% acetonitril (ACN) i 0,2 % myrsyra till patroner med 19,8 % vatten och använd vakuumsug för att dra vätskan igenom. Upprepa steg 1x, undvika torkning av patronerna helt.
- Jämviktspatroner genom att tillsätta 800 μL 0,2 % myrsyra i vatten med vakuumsug för att dra hela volymen genom filtret. Upprepa detta 2x. Lasta peptider på patronerna med vakuumsug. Tvätta peptider 2x med 800 μL 0,2% myrsyra i vatten under vakuumsug.
- Ordna 1,5 ml mikrocentrifugrör under varje patron för att samla peptid eluting i det sista steget. Under vakuumsugvatten från patroner, först med 800 μL på 80% ACN i 0,2% myrsyra och 19,8% vatten, sedan med 400 μL av samma lösning. Torka de saltade peptidproverna helt i vakuumkoncentrator (2-3 h).
3. Samtidig berikning av K-acetylated och K-succinylated peptider med immunoaffinity pärlor
- Resuspend torkade peptider i 1,4 ml kall 1x immun-affinitet reification (IAP) buffert. Vortex att blanda och säkerställa ett pH av ~ 7. Centrifugprover vid 10 000 x g i 10 min vid 4 °C. En liten pellet kan förekomma.
- Ställ peptider åt sidan på is en gång du förbereder antikroppspärlor. Till ett rör av K-acetyl och rör av K-succinyl antikroppsbead slam (volym: 100 μL slurry per rör), tillsätt 1 ml kall 1x fosfat-buffrad saltlösning (PBS) och blanda genom rörledningar. Överför hela lösningen till ett nytt 1,5 ml-rör och snurra i en miniatyrcentrifug i 30 s på RT.
- Aspirera PBS, var noga med att undvika att aspirera bort eventuella pärlor. Upprepa tvätt3x genom att tvätta igen med 1 ml kall 1x PBS, centrifugering för 30 s vid RT och spirating av PBS.
- Återsuspenda pärlorna i ca 440 μl PBS. En fjärdedel av antalet pärlor i varje PTM-rör (100 μL, som tillhandahålls av tillverkaren) används för an-pot anrikning (ca 62,5 μg av varje immobiliserad antikroppar för både K-acetyl och K-succinyl antikroppar pärlor). Pipette pärlorna flera gånger för att blanda väl. Ta bort 100 μl acetyllysinantikroppspärlor och överför till ett rör med 200 μL förklippta spetsar, se till att huvudmixen förblir konsekvent välblandad.
- Gör samma sak med de kortfattade antikroppspärlorna genom att ta bort 100 μL av uccinyl-lysinantikroppspärlor till röret för att nå lika delar av acetyllysinantikroppen och koncisa-lysinantikroppen i varje rör. Snurra ner i 30 s i en miniatyr centrifug och aspirera av media med gel lastare spets (pärlor kommer att bli vit).
OBS: Varje rör bör ha en liknande bead pellets i botten. - Pipette den resuspended peptid direkt på tvättade pärlor. Var noga med att undvika eventuella pellets (tillsätt snabbt för att undvika att torka ut pärlorna). Inkubera peptiderna med pärlor vid 4 °C över natten med agitation.
4. Elution av peptider bundna till antikroppar pärlor
- Snurra peptidproverna vid 2 000 x g för 30 s vid 4 °C. Ta bort supernatant en som innehåller obundna peptider och spara för framtida experiment om så önskas. Tillsätt 1 ml kall 1x IAP buffert till pärlorna för att tvätta och blanda genom att invertera 5x. Snurra vid 2 000 x g för 30 s vid 4 °C. Aspirera bort IAP-lösningen och upprepa IAP tvätta steg 1x för totalt två tvättar.
- Tillsätt 1 ml kallt HPLC vatten till pärlorna och blanda genom att invertera 5x. Snurra vid 2 000 x g för 30 s vid 4 °C. Sug er av vattnet. Upprepa vattentvätten steg två gånger för totalt tre tvättar. Snurra ytterligare en tid vid 2 000 x g för 30 s vid 4 °C för att samla eventuellt kvarvarande vatten i rörets botten. Sug av extra vatten som kan ha samlats in med platt-tippade gel laddningstips. Var noga med att undvika att aspirera pärlorna.
- Tillsätt 55 μl 0,15 % trifluoroacettiksyra i vatten till pärlorna. Inkubera pärlorna i 10 min på RT medan ibland knacka på botten av röret för att blanda. Snurra pärlorna på RT i 30 s i en miniatyrcentrifug. Ta bort de eluted peptider och ställ åt sidan med hjälp av en platt-tippade gel-lastning spets.
- Tillsätt 45 μl 0,15 % trifluoroacettiksyra i vatten till pärlorna. Inkubera i 10 min på RT medan du trycker på botten av röret ibland för att blanda. Snurra pärlorna på RT i 30 s i en miniatyrcentrifug. Ta bort den andra elutionen med en platt-tippad gel-loading spets och kombinera med den första elution.
- Snurra de kombinerade eluted peptider på 12.000 x g för 5 min på RT för att pellet några pärlor som bär över. Överför peptiderprovlösningen till ett nytt 500 μL-rör.
Protokollet kan pausas här.
5. Avsaltning av berikade peptider
OBS: Provexemplarets pH ska vara mindre än 4 för optimal bindning till spetsen som innehåller C18-harts. Använd en 10 μL pipettspets som innehåller 0,6 μl C18-harts och en 10 μL pipett för att styra spetsen.
- Förvåt C18-spetsen genom att pipetting 10 μL acetonitrile i spetsen. Fördela acetonitril i avfall. Upprepa det här steget två gånger till.
- Jämvikt spetsen genom att tvätta 3x med 10 μL 0,2% myrsyra i vatten. Fördela lösningen i avfall efter varje jämvikt.
- Ladda peptider från provet på spetsen genom att kontinuerligt pipetting och dispensering berikad peptidprov med spetsen. Pipette upp och ner upprepade gånger minst 20x och dispensera den återstående lösningen från spetsen.
- Tvätta spetsen som innehåller bunden peptid med 10 μL 0,2% myrsyra i vatten. Fördela lösningen i avfall. Upprepa det här steget 9x.
- Elute peptider i ett nytt rör med 10 μL av en elutionbuffert som innehåller 0,2 % myrsyra, 50% acetonitril och 49,8% vatten. Rör och fördela de 10 μl lösningen i det nya röret 15x. Upprepa detta steg med ytterligare 10 μl elutionbuffert, upprepade gånger pipetting i samma rör som den tidigare elution.
- Torra peptider helt i vakuumkoncentrator (ca 20 min). Resuspend torkade peptider i lämplig volym av 0,2% myrsyra i vatten.
Protokollet kan pausas här.
6. Datainsamling med DDA och DIA
OBS: Analysera proverna med DDA- och DIA LC-MS/MS-metoder, som kan justeras beroende på det tillgängliga masspektrometriska instrumentet. Här analyserades proverna med hjälp av ett nano-LC 2D HPLC-system kopplat till en högupplöst masspektrometer.
- Använd ett HPLC-system kombinerat med ett chipbaserat plattformHPLC-system som är direkt anslutet till en masspektrometer (många LC-MS-konfigurationer och -system kan också användas).
- Analys av prover med omvänd fas HPLC-ESI-MS/MS
- Efter injektion, överför peptidblandningarna till ett C18-förkolonnchip och salta peptiderna genom att tvätta med mobil fas A vid 2 μL/min i 10 min. Överför sedan peptiderna till en analytisk kolonn och elute med en flödeshastighet på 300 nL/min med en 2-3 h-övertoning med hjälp av mobila faser A och B. Använd specifikt en linjär lutning från 5 % mobil fas B till 35 % mobil fas B över 80 min.
- Därefter ramp den mobila fasen B till 80% över 5 min, sedan hålla på 80% B för 8 min innan du återvänder till 5% B för en 25 min åter jämvikt.
- Skapa en MS-instrumentmetod för DDA och definiera följande instrumentskanningsexperiment
- Experiment 1: MS1 prekursorjonsskanning från m/z 400-1 500 (ackumuleringstid på 250 ms). Ställ in intensitetströskeln för att utlösa MS/MS-sökningar för joner av laddningstillstånd 2-5 till 200 räknas. Ställ in det dynamiska uteslutandet av prekursorjoner till 60-talet.
- Experiment 2: MS/MS-produktjonskanning med en MS2-skanning scan från m/z 100-1 500 (ackumuleringstid på 100 ms per varje 30-produktjonsökning per cykel). Ställ in kollisionsenergispridningen på CES = 5 och välj sedan "högkänslighetsproduktjonskanningsläge".
DDA-metoden kommer att förvärva MS/MS-spektra för de 30 vanligaste prekursorjonerna efter varje undersökning MS1-skanning per cykel, och den totala cykeltiden kommer att vara ~3,3 s. DDA-förvärv kommer att användas för att bygga spektrala bibliotek enligt beskrivningen i avsnitt 7.
- Bygga en MS-instrumentmetod för DIA och definiera följande instrumentskanningsexperiment.
- Experiment 1: utföra MS1 prekursorjonsskanning från m/z 400-1 250 (ackumuleringstid på 250 ms).
- Experiment 2: utföra MS/MS-produktjonskanningar för 64 variabla SWATH-segment med en MS2-skanningsintervall från m/z 100-1 500 (ackumuleringstid på 45 ms per varje 64-produktjonskanning per cykel). Ställ in kollisionsenergispridningen på CES = 10 och välj sedan "högkänslighetsproduktjonskanningsläge".
- Använd den 64 variabla fönster DIA / SWATH förvärvstrategi som beskrivs av Schilling et al.22 för att få etikettfri kvantifiering med en total cykeltid på ~ 3,2 s. Kort, i detta förvärv, i stället för Q1 quadrupole sänder en smal massa intervall genom kollisioncellen, ett bredare fönster av variabel fönsterbredd (5 -90 m / z) passerar i stegvisa steg över hela massa sortiment (m / z 400 -1.250 med 64 SWATH segment, var och en med en 45 ms ackumulering tid, vilket ger en cykeltid på 3,2 s, vilket inkluderar en MS1 scan med en ackumuleringstid på 250 ms).
OBS: Den variabla fönsterbredden justeras beroende på komplexiteten i den typiska MS1 jonström som observerats inom ett visst m/z-intervall med hjälp av en variabel fönsterkalkylatoralgoritm 22 (smalare fönster väljs i "upptagna" m /z intervall, breda fönster i m / z intervall med få eluting föregångare joner). På andra MS-instrumentplattformar kan andra DIA-fönsterstrategier genomföras.
7. Dataanalys
VISSA dataanalysinställningar bör ändras och anpassas till det specifika experimentet. Till exempel beror den valda proteindatabasen (FASTA-filen) på vilken art provet bereds från (här Mus musculus). Nedan beskrivs dataanalysen för musprover berikade för acetylated och koncisa peptider.
- Använd en MS-databassökmotor för att analysera DDA-förvärv. Skapa en sökmotormetod för databasen enligt följande:
- För provbeskrivningsparametrar: välj "Identifiering" under provtyp, välj "Iodoacetic Acid" under "Cysteinalkylation", välj "Trypsin" under "Digestion" (förutsatt att C-terminalklyvning vid lysin och arginin), välj "TripleTOF 6600" under Instrument, under särskilda faktorer, kontrollera acetylationsbetoning och konrikulationsberikande, och välj Musmuskulus under art.
- För specifika bearbetningsparametrar: välj "Biologiska modifieringar" under ID Focus, välj "SwissProt" under Databas, kontrollera "Grundlig ID" under Sökinsats, välj "0,05 (10%)" under "Upptäckt proteintröskel", och kontrollera " Kör analys avfalsk identifieringshastighet" under "Resultatkvalitet". Spara sökmotormetoden och skicka in masspektrometriska raw-filer för bearbetning av databasens sökmotor med den genererade metoden.
OBS: I en iterativ process kalibreras alla MS- och MS/MS-genomsökningar automatiskt om av sökmotorn baserat på inledande anteckningar och resultat.
- Klicka på "Export Peptide Sammanfattning" efter avslutad sökning och filtrera alla peptid identifiering resultat med en "förtroende tröskel" på 99 i ett kalkylprogram (t.ex. Excel; falsk upptäckt sats [FDR] på 1%).
- I kalkylbladsfilen "Peptid Summary" filtrerar du efter alla peptider som innehåller PTM-anteckningen "acetylation" och "koncistiering" i ändringskolumnen för att generera en resultatrapport för att presentera uteslutande de acyerade peptider och deras motsvarande proteiner.
- För att bygga MS/MS spektrala bibliotek för vidare bearbetning av DIA raw-filen och ytterligare relativ kvantifiering öppnar du DIA Quantitative Analysis Software. Välj fliken "Bibliotek" och klicka sedan på "Generera spektralbibliotek" från "Sökmotorn" och öppna en FDR-rapport för databassökmotorn (filen *FDR.xlsx), som automatiskt genererades som en del av sökprocessen för DDA-databasen. Klicka sedan på "nästa" och välj schemat "LibrarySettings" och "nästa". Välj "Uniprot_mouse_proteome" som databas, klicka sedan på "nästa" och "goa_mouse" som genanteckningsfil (ontology) fil. Slutligen klickar du på "avsluta", och spektralbiblioteket kommer att genereras.
OBS: Information om de acetylated och koncist peptider från DDA rådatafiler, föregångare jon skanningar från MS1, och fragment jon skanningar från MS2 kommer att ingå i spektrala bibliotek (detta inkluderar retention tid, MS / MS fragmentering mönster, etc.). - Använd DIA kvantitativa proteomics analys programvara för att utföra relativ kvantifiering av acetylation och koncistivhet nivåer och skapa kalkylblad av kandidat PTM-innehållande peptider som kan användas för ytterligare dataanalys.
- Om du vill analysera och kvantifiera PTM-innehållande peptider öppnar du DIA Quantitative Analysis Software använder du mallanalysschemat. Mallschemat är tillgängligt i programvaran genom att välja alternativet "Inställningsperspektiv" | "DIA Analys" | "BGS PTMs" (antingen betydande eller gles, beroende på experimentet).
OBS: Istället för att använda BGS PTM analysmall i DIA kvantitativ analys programvara, alla PTM-specifika inställningar kan också manuellt ställas in enligt dessa instruktioner: 1) under "identifiering", välj "PTM lokalisering" (sannolikhet cutoff = 0,75); 2) i "kvantifiering", välj "mindre peptidgruppering" | "modifierad sekvens"; och 3) under "efter analys", välj "differentiellt överflöd gruppering" | "mindre grupp" (kvantifieringsinställningar). Dessa inställningar aktiverar PTM-lokaliseringsfunktionen så att modifierade peptider anges som enskilda poster och differentialanalys utförs på peptidnivå. - Om du vill starta kvantifieringsanalysen väljer du fliken Pipeline "Pipelineoch sedan på "Konfigurera en DIA-analys från fil", öppna MS DIA-raw-filer av intresse för relativ kvantifiering. Välj "Tilldela spektralbibliotek" och välj det bibliotek som har byggts ovan, klicka på "ladda" | "nästa". Välj analysschemat "BGS PTMs" och klicka på "nästa". Välj lämplig databas FASTA-fil "Uniprot_mouse_proteome" | "nästa". Definiera villkorsuppsättningen, som tilldelar de olika villkoren till exemplen och klicka på "nästa". Välj" goa_mouse" som genanteckningsfil (ontology) fil och klicka på "nästa". Granska analysöversikten (sammanfattning av experimentupplägget) och välj "utdatakatalog" | "avsluta". Slutligen klickar du på "Kör Pipeline" för att utföra den etikettfria kvantitativa analysen.
OBS: Statistiska moduler i DIA Quantitative Analysis Software utför automatiskt FDR-analys, genererar värmekartor och vulkantomter som jämför de olika förhållandena, genererar listor över identifierade och kvantifierade peptider och proteiner, och ger Q-värden tillsammans med relativa veckförändringar som jämför olika villkor.
- Om du vill analysera och kvantifiera PTM-innehållande peptider öppnar du DIA Quantitative Analysis Software använder du mallanalysschemat. Mallschemat är tillgängligt i programvaran genom att välja alternativet "Inställningsperspektiv" | "DIA Analys" | "BGS PTMs" (antingen betydande eller gles, beroende på experimentet).
- Alternativt använd programvara för borttagning av DIA-datamängder för bearbetning av data och utföra statistisk analys efter att ha exporterat de extraherade toppområdena för acetylations- och konciseringsplatser.
8. Datavisualisering av modifierade peptider och bedömning av PTM webbplats lokalisering
- Om du vill öppna en genererad DIA Kvantitativ analys väljer du flikenAnalys" följt av "läsa in det kvantitativa analysis software experiment" (från ett sparat experiment som öppnar en *. SNE-fil). Navigera till *. SNE resultatfil och välj "öppna".
- I den vänstra panelen klickar du på pilen till vänster om den tredje rådata *.wiff-filen från toppen för att expandera och visualisera alla 64 SWATH-segment. Klicka på pilen till vänster om segmentet [428.7-437.3] för att expandera det specifika segmentet och visa de modifierade peptider som identifierats för detta massintervall. Klicka på den triply laddade peptid KQYGEAFEK[Acetyl] R.
OBS: Som standard visar den högra övre panelen vanligtvis MS2 XIC och den nedre panelen visar MS1 Isotopkuvert XIC- I den övre panelen väljer du "PTM-lokaliseringsplot". I den nedre panelen väljer du "PTM-lokaliseringsplot".
- I PTM Localization Plot väljer du den övre peptidsekvensen "KQYGEAFEK[Acetyl]R", med en total PTM-lokaliseringspoäng på 18,32. Klicka på pilen till vänster för att expandera vyn och visualisera bekräftande och vederlägga joner. Klicka på pilen bredvid "Bekräfta Nde Ions", välj sedan jonen "y3 [+42]" för att markera just den jonen, som bekräftar att acetylationsplatsen ligger på K2 i peptidsekvensen.
- I PTM Localization Plot välj den andra peptidsekvensen "K[Acetyl]QYGEAFEKR" med en total (mycket låg) PTM lokalisering poäng på 1. Klicka på pilen till vänster för att expandera vyn och visualisera bekräftande och vederlägga joner. Klicka på pilen bredvid "Bekräfta Nde Ions", sedan på pilen bredvid "Refuting Ions", välj sedan några fragmentjoner för att visualisera och bedöma den extraherade jonkromattogram och MS / MS spektra(Figur 5).
OBS: Den tilldelade PTM Lokalisering STa och visuell inspektion visar att rätt PTM isomer är KQYGEAFEK[Acetyl]R, medan det inte finns några eller minimala bevis för den andra möjliga PTM isomer K[Acetyl] QYGEAFEKR.
Representative Results
Figur 1 visar ett allmänt diagram över arbetsflödet, inklusive skörd av vävnaden från muslever, med 1 mg protein för att smälta proteinet lysate med trypsin, inkubering peptider med antikropp-konjugerapärlor, förvärva prover på MS, och slutligen utföra DIA / SWATH analys av data med hjälp av olika kvantitativa proteomics mjukvarupaket (akademiska och kommersiella).
Bild 2A visar hur tidslinjen för arbetsflödet och mängden prov och protein som krävs, jämfört med alternativa metoder som för närvarande används för multi-PTM anrikningstudier. En-pot-metoden kan utföras på hälften så mycket tid och med hälften av antalet prover som dessa alternativa metoder. Jämfört med två single-PTM anrikning metod, en-pot protokollet kräver också hälften av mängden protein.
Detta protokoll har visat sig vara ett genomförbart och kostnadseffektivt alternativ. Figur 2B visar att mediankoefficienten för variation (CV) för modifierade peptidområden var lägre i enpottmetoden än i en-PTM och seriell-PTM-berikande. Figur 2C,D visar att det vid en pottptm och enpottsmetoder för anrikning av ptm och en enda PTM-anrikningsmetoder, inte var anmärkningsvärda skillnader uppenbarade mellan sambanden mellan kvantifieringarna på platsnivå för de två ändringarna. Detta gällde också för peptid-nivå och fragment-nivå korrelationer. Samma iakttagelse som hölls för alla tre korrelationer när man jämför an-pot och seriell-PTM anrikning. Alla underliggande MS rådata och bearbetade Excel resultatblad som är associerade med en färsk rapport från Basisty et al.14 finns tillgängliga och kan laddas ner från MassIVE (MSV00081906) och ProteomeXchange (PXD008640).
I allmänhet, även om antikroppsberikningsstrategier kan visa vissa begränsningar, såsom potentiell epitopocklusion eller begränsad specificitet, är de antikroppar som används i denna studie blandningar av oberoende genererade kloner och ger därmed bredare Särdrag.
Experimentella resultat dokumenterar möjligheten att upptäcka och bedöma PTM-överhörning. Figur 3 visar data från en lyckad berikning och illustrerar ett exempel för en peptid som innehåller flera och olika acyl-ändringar som visualiserar PTM-överhörning. Bild 3A visar en peptid som är acetylated på en lysinrester och koncisat på den andra, och figur 3B visar samma peptid som är kortfattad vid båda lysines. Detta visar att samma lysinrester kan modifieras med både acylationsgrupper, och det finns en möjlighet att korssamtal inträffar på den platsen. I figur 4 visas antalet lysinrester som identifierades enligt avsnitten 7.1-7.3 för att bära båda ändringarna, vilket också pekar mot eventuella PTM-överhörningar.
Som figur 5 visar, bearbetning DIA PTM dataset med kvantitativa proteomics programvara tillåter oss att precisera vilka specifika lysinrester ändras. Detta är ett begrepp som kallas lokalisering av platser, vilket är ett viktigt steg för alla analyser för bestämning av eventuella PTM-överhörning. Figur 5 visar två potentiella isoformer tillsammans med de bekräftande och vederläggajonerna för varje som kan visualiseras och bedömas enligt beskrivningen i avsnitten 8.1-8.3 (särskilt steg 8.3.2 och 8.3.3). Baserat på denna information kunde vi tryggt identifiera vilka av de två isoformerna som fanns i det ursprungliga urvalet. Ms/MS-spektrumet av den bekräftade isoform KQYGEAFEKacR visar tydligt att y jonerna (y2-y5)som innehåller de acetylated lysinrester, som skiftades med 42 m/z (en ökningsmassa av en acetylgrupp), bekräftade de specifika lysinrester i peptid som ändrades.
Bild 1: Typiskt arbetsflöde för anrikning av en pott för PTM. Vävnad (här, lever) skördas från SIRT5 KO och vild-typ (WT) möss, och proteiner är lysed, trypsin-smälta i peptider, och saltade. Peptider berikas sedan av immuntillhörighet med kombinationer av koncisa- och acetyl-antikroppspärlor. Parallella MS-arbetsflöden mäter både 1) små alikvoter av hela lysate proteinuttrycksförändringar (för proteinnormalisering) och 2) berikade acyl-innehållande peptider för identifiering av acylationsstället (DDA-MS) och lokalisering av platser, följt av kvantifiering (DIA-MS). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Jämförelse av arbetsflöde med en pott med alternativa metoder. (A)Jämförelse av tid, kostnader och material som krävs för enpottsarbetsflödet, serial-PTM-anrikning och två anrikning av en enda PTM. (B)Jämförelse av CV mellan enpottsarbetsflödet, enkel acetyl-lysinPTM-anrikning och enkel kortfattad PTM-anrikning. Spearman korrelationsanalys som jämför acyl peptidtoppområden som erhållits från enpottsarbetsflödet och en-PTM-berikande: motsvarande tomter i log2-toppområdets resultat för(C)acetylationsplatser och (D)koncisatningsplatser. Regressionssluttningar och korrelationsfaktorer anges i de enskilda panelerna14. Två oberoende biologiska replikat behandlades för vart och ett av villkoren. Denna siffra har ändrats från Basist et al.14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tvärsnitt mellan acetylation och koncishetmodifiering av lysinrester. MS/MS spektra av tryptic peptider från mitokondriell3-ketoacyl-CoA thiolase som visar samma aminosyra sekvens men har modifierats vid två lysinrester med olika PTMs.(A)MS/MS av peptid AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK och (B)MS/MS av peptid AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK. Denna siffra har ändrats från Basist et al.14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Överlappning och tvärprat mellan de acetylated och koncisa lysinrester-specifika exempel i proteinkomplex. A) Venn diagram som visar överlappning mellan 2.235 acetylation och 2.173 koncisation platser. Av dessa var 943 platser både acetylated och koncist. Lever från en SIRT5 (de-succinylas) knockout mus analyserades, och många koncisa platser identifierades. I själva verket var de mer rikligän normalt observerats i muslever (modifierade peptider filtrerades till ett Q-värde av <0,05). (B)Proteinkomplex som visar procentandelen av deras underenheter som innehåller både acetylated och koncisat platser (fet röd linje representerar den betydelse som bestäms av Fishers exakta test). (C)Diagram över ATP syntas komplex: protein underenheter i rött skildrar underenheter som innehåller både acetylated och koncisat platser. Denna siffra har ändrats från Basist et al.14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Kvantitativproteomics programvara dechiffrerar peptid webbplats lokalisering av PTMs. Baserat på MS/MS fragmentering av peptid, är det möjligt att ge information om de specifika lysinrester acetyl gruppen ändrar. Detta visar programvarans förmåga att erbjuda värdefull information om lokalisering av bankomater. (A)Två möjligheter till lysinrestmodifiering och PTM-lokalisering av platser: KQYGEAFEKacR (vänster) och KacQYGEAFEKR (till höger). "Bekräfta" och "vederlägga" fragmentjoner visas för var och en av de potentiella plats lokalisering isoformer av peptid. Baserat på denna information tilldelas bekräftande poäng och vederläggning av poäng, vilket bekräftar förekomsten av isoform KQYGEAFEKacR i exemplet. B) MS/MS-spektrum som motsvarar den bekräftade isoform KQYGEAFEKacR som anger att alla y joner, inklusive de acetylated lysinrester (y2 och högre) bär en ökningsmassa på +42 m/z, vilket motsvarar acetylmodifieringen. Observerade b joner innehåller inte ändringen. (C)Extraherad jonkromattogram (XIC) med rikliga toppområden till följd av y2 och y3 joner, som båda utgör acetylationsplatsen i den bekräftade isoform KQYGEAFEKacR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta protokoll beskriver en ny teknik för samtidig multipel PTM anrikning för att mer effektivt förstå PTM crosstalk. Alternativa metoder för att nå detta mål tenderar att vara oöverkomligt tidskrävande och dyrt, och de kräver stora mängder protein för att lyckas11,13. Detta protokoll presenterar ett arbetsflöde för anrikning med flera ptm-medel som innebär inkubation i antikroppskonjuperade pärlor för två PTM-tillverkare samtidigt för att förbättra experimentets övergripande effektivitet. Denna metod innebär också användning av DDA för spektralbibliotek generation och DIA MS förvärv för att upptäcka och kvantifiera peptider som finns med minskad inblandning från fragmentjoner22,23. Program, såsom MS databas sökmotorer används för att analysera och kvantifiera data från DDA förvärv, medan kvantitativa proteomics Software24 och specifika DIA kvantitativanalys Software25 är nödvändiga för att tolka den komplexa spektra produceras av DIA förvärv.
Det finns flera kritiska steg i detta protokoll som bör följas noggrant. Eftersom det huvudsakliga målet med protokollet är att berika för flera PTM samtidigt är antikroppsaffinitetsanrikningssteget (avsnitt 2) avgörande för experimentets framgång. När du utför tvättar på pärlorna, är det nödvändigt att se till att ingen av pärlorna är sugs oavsiktligt. Att säkerställa att ureakoncentrationen har spädts ut till 1 M före matsmältningen med trypsin (steg 1.8) är också nödvändigt. Även om 8 M urea krävs tidigare i protokollet för proteinlöslighet, kommer urea koncentrationer över 1 M hämma trypsin s enzymatisk aktivitet. Dessutom är det viktigt att konsekvent kontrollera provets pH-kort i hela protokollet. Detta är särskilt viktigt före matsmältningen. Om pH för provet och trypsin-lösningen inte neutraliseras på lämpligt sätt före inkubationsinkubationen, kan det resultera i en ineffektiv matsmältning där många klyvningsplatser kan missas, vilket resulterar i färre peptididentifieringar.
Några ändringar i protokollet kan vara till hjälp när du förbereder prover. För ett protein som upphandlas från 1 mg utgångsmaterial kan en fjärdedel av antikroppspärlorna som tillhandahålls i varje PTM-skanningsrör användas som ett kostnadseffektivt alternativ. En större mängd utgångsmaterial kan användas för bättre resultat, så länge mängden antikroppar pärlor som används ökar proportionellt. En annan ändring som kan förbättra arbetsflödet är att smälta prover med en annan proteas förutom trypsin. Denna ändring skulle resultera i mer variation i peptider kaverade, vilket ger ökad täckning av proteinrester. Även om det inte är nödvändigt, rekommenderas att trypsin vara en av de enzymer som används för PTM analys på grund av dess höga klyvning specificitet26.
En begränsning av detta protokoll är att de PTMs som studeras måste ha liknande kemister för att berikas samtidigt14. Förfarandena för de olika antikroppskonjuperade pärlorna måste vara likartade, med hjälp av liknande lösningsmedel och lösningar, inklusive liknande elutionvillkor, och helst från samma leverantör. Av denna anledning använder den metod som beskrivs här konsekvent acetylation och koncishet som ett exempel, som båda använder antikroppskonjuperade pärlor (Cell Signaling Technology, Inc). Även om denna metod teoretiskt kan tillämpas på valfritt antal ptm-avgifter, skulle ytterligare studier behövas för att bedöma den exakta begränsningen av protokollet i detta avseende. Eftersom detta är en antikroppsbaserad berikningsmetod kan metoden dessutom endast ge en relativ kvantifiering av PTM-anläggningar.
I jämförelse med befintliga multi-PTM anrikningmetoder är det här arbetsflödet ett mer genomförbart och kostnadseffektivt alternativ. Från detta experiment observerades att effekten av denna metod jämför mycket väl med alternativa metoder, såsom individuella eller seriella anrikningar. Figur 2B visar att median-CV för modifierade peptid toppområden faktiskt minskade i en-pot-metoden jämfört med en-PTM anrikning och seriell-PTM anrikning13. Vi analyserade vidare de experimentella resultaten som bedömde kvantifieringar på platsnivå för acetylation eller koncisation. Dessutom visade Spearman korrelationsanalys(figur 2C,D)att en pott PTM-anrikningen utfördes på samma sätt som arbetsflödena för en PTM-anrikning. Detta gällde även för konkorrelationer på peptid- och fragmentnivå. Samma observation som hölls för alla tre korrelationer när man jämför en pott med seriell-PTM anrikning.
Detta protokoll gör det möjligt för forskare att göra fascinerande biologiska insikter i PTM-överhörning på ett snabbt och kostnadseffektivt sätt. DIA-komponenten i arbetsflödet gör det möjligt för forskare att förstå mer om PTM, eftersom det ger information om lokalisering av webbplatser och övervinner utmaningar som låg platsbeläggning av PTMs. Prekursorjoner tenderar att uteslutas med DDA, vilket är särskilt viktigt när man studerar PTM, eftersom platsbeläggningen ofta är låg till den punkt där dessa peptider inte blir utvalda för MS/MS men fortfarande innehåller viktig information. Uppföljningsexperiment kan utföras för att bedöma den övre gränsen för hur många PTM-skivor som kan berikas samtidigt med den här metoden. En framtida förbättring av detta arbetsflöde kan omfatta utveckling av mer avancerade mjukvaruplattformar för att ytterligare automatisera analysen av lokalisering av webbplats och BELÄGGNING AV PTM-webbplatser.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner stödet från NIH delade instrumenteringsbidrag för TripleTOF-systemet vid Buck Institute (1S10 OD016281). Detta arbete stöddes också av National Institute of Allergy and Infectious Disease (R01 AI108255 till B.S.) och National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R24 DK085610 till Eric Verdin; R01 DK090242 till Eric Goetzman). X.X. stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (NIH bevilja T32GM8806, till Judith Campisi och Lisa Ellerby), NB stöddes av en postdoktoral gemenskap från Glenn Foundation for Medical Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
| Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
| Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
| C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
| C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
| Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
| Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
| Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
| Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
| mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
| Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
| PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
| mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
| Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
| Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
| Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
| ProteinPilot 5.0 - 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
| PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
| PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
| Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
| Skyline - 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
| Spectronaut - 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
| Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
| TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
| TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
| Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
| Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
| Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
| ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |
References
- Christensen, D. G., et al. Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions. Frontiers in Microbiology. 10, 1604 (2019).
- Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. Post-translational modifications in signal integration. Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).
- Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases. Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).
- Swaney, D. L., et al. Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation. Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).
- Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).
- Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms. Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).
- Mocciaro, A., Rape, M. Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control. Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).
- Lopez-Otin, C., Hunter, T. The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer. Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).
- Du, Z., et al. DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination. Science Signalling. 3 (146), (2010).
- McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach. Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).
- Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).
- Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).
- Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment. Proteomics. 18 (17), e1800123 (2018).
- Wang, G., et al. Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation. Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
- Rardin, M. J., et al. Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).
- Rardin, M. J., et al. SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks. Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).
- Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications. Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).
- Sadhukhan, S., et al. Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).
- Collins, B. C., et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature Communications. 8 (1), 291 (2017).
- Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers. Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).
- Meyer, J. G., Schilling, B. Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques. Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Sticker, A., Martens, L., Clement, L. Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about. Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
