Summary
Denne arbejdsgang beskriver ydeevnen af tids- og omkostningseffektiv berigelse af flere proteinændringer efter oversættelser (PTM)samtidig til kvantitativ global proteomisk analyse. Protokollen udnytter peptid-niveau PTM berigelse med flere konjugerede antistoffer, efterfulgt af data-uafhængige erhvervelse massespektrometri analyse for at få biologisk indsigt i PTM krydstale.
Abstract
Undersøgelse af flere post-translationelle ændringer (PTMs) af proteiner er et afgørende skridt til at forstå PTM krydstale og få mere holistisk indsigt i protein funktion. På trods af betydningen af multi-PTM berigelse undersøgelser, få undersøgelser undersøge mere end én PTM ad gangen, dels på grund af udgifter, tid og store proteinmængder, der kræves for at udføre flere globale proteomiske analyse af PTM' er. Den "one-pot" affinitetberigelse, der er beskrevet i denne protokol, overvinder disse hindringer ved at tillade samtidig identifikation og kvantificering af peptider med lysinrester indeholdende eddikeog korttidsopblandingPT'er med lave mængder prøve Input. Protokollen indebærer forberedelse af protein lysat fra muselever af SIRT5 knockout mus, udførelse af trypsin fordøjelse, berigelse for PTMs, og udførelse n af massespektrometrisk analyse ved hjælp af en data-uafhængig erhvervelse (DIA) workflow. Da denne arbejdsgang gør det muligt at tilsaøse to PTMs fra samme prøve samtidig, giver den et praktisk redskab til at studere PTM krydstale uden at kræve store mængder prøver, og det reducerer i høj grad den tid, der kræves til prøveforberedelse, data erhvervelse og analyse. DIA-komponenten i arbejdsprocessen indeholder omfattende PTM-specifikke oplysninger. Dette er især vigtigt, når man studerer PTM site lokalisering, som DIA giver omfattende sæt af fragment ioner, der kan beregningsmæssigt dechifreres at skelne mellem forskellige PTM lokalisering isoformer.
Introduction
Et utal af post-translationelle ændringer dynamisk regulere proteiner og veje gennem virkninger på aktiviteten1, signalering2, og omsætning3,4. F.eks. aktiveres eller deaktiveres proteinkinaser ved tilsætning af fosfatgrupper5, og histoneacetylation og andre ændringer giver en mekanisme til at ændre kromatinstrukturen og fungere som transskriptionelle reguleringsmekanismer6,7. I de senere år har der været dokumentation for , at flere PTM'er arbejder i fællesskab eller konkurrerer om at regulere proteinfunktion eller aktivitet8,9,10,11. Derfor forståelse PTM krydstale er et nyt behov i PTM forskning. De fleste tilgængelige proteomiske arbejdsgange til at identificere og kvantificere PTM-websteder fokuserer dog på enkelte ændringer i stedet for samspillet mellem flere ændringer. Den beskrevne arbejdsgang korrelerer specifikke proteinmodifikation "hot-spots" og lysinrester, der er modificeret af flere forskellige PTMs.
Der er et stigende behov i det videnskabelige samfund for gennemførlige metoder til at studere flere PTMs samtidig12. De fleste metoder til globalt at identificere og kvantificere lokaliteterne for flere typer PTM 'er udfordrende på grund af de høje omkostninger og mængden af væv , der kræves12,13. Ikke alene er multi-PTM berigelse eksperimenter tidskrævende med hensyn til prøve forberedelse, dataindsamling, og dataanalyse, men disse undersøgelser kræver typisk store og ofte uoverkommelige mængder af protein11. Beskrevet her er en protokol for samtidig berigelse og analyse af flere PTMs, som også omhandler flere af disse barrierer og muliggør storstilet PTM profilering og vurdering krydstale mellem forskellige PTMs14. Denne one-pot workflow skitserer en praktisk måde for biomedicinske forskere til globalt profil flere PTMs, identificere co-modificerede peptider, og studere PTM krydstale i en effektiv og omkostningseffektiv måde14,15.
Her er denne metode fremvist ved at undersøge mitokondriel protein acylation, som først blev undersøgt over 50 år siden16. Det koncentrerer sig specifikt om lysin acetylation17 og kortfattetlation18, herunder co-forekomst af disse ændringer på proteiner og endda co-modifikation på peptid niveau. Da undersøgelsen bruger en sirtuin 5 (SIRT5) knockout mus model, blev det valgt at fokusere på berigelse af acetylation og kortfattetlation steder. Denne beslutning blev truffet, fordi korthedslokaliteter er mål for SIRT5 desuccinylase og derfor forventes at udvise betydelig opregulering i KO-mus, hvilket gør dem til de mest relevante PTM'er i dette tilfælde. Begge PTM'er er biologisk relevante som for nylig opsummeret af Carrico et al.19. Generelt, acetylation viser vigtige virkninger på genekspression og stofskifte, og kortfattetlation er blevet rapporteret til at regulere hjertemetabolisme og funktion20.
Den beskrevne protokol kan udføres med en lav mængde proteininputmateriale (f.eks. 1 mg proteinlysat) og reducerer forsøgets samlede varighed ved at reducere den tid, der bruges til prøvebehandling, MS-erhvervelse og dataanalyse. Der findes en arbejdsgangsskemai figur 1. Vi har også brugt endnu lavere mængder udgangsmateriale (ned til 100 μg protein lysat, skalering ned de mængder af perler, der anvendes i overensstemmelse hermed), hvilket som forventet reducerer det samlede udbytte af identificerede acylated peptider; men, Det giver stadig meget værdifulde resultater og kvantificerbare acylated peptider.
Mens såkaldte top-down eller midt-down arbejdsgange typisk ikke bruger proteolytiske fordøjelse tilgange (og dermed opretholde tilslutning af flere PTMs inden for et protein), denne protokol fokuserer på en peptid-baseret affinitet berigelse tilgang til at få ekstra dybde og følsomhed for PTM identifikation og kvantificering (Figur 1). Desuden anvender denne peptid-centreret arbejdsgang moderne massespektrometrimetoder, herunder 1) en kombination af dataafhængig erhvervelse (DDA) til at generere spektralbiblioteker og 2) datauafhængige anskaffelse (DIA) til nøjagtig PTM-kvantificering i en etiketfri arbejdsgang.
DIA-arbejdsgange overvinder prøveudtagning af typiske DDA-scanningsordninger ved at fragmentere alle peptidsignaler inden for det samplede m/z-område21. Denne funktion er også yderst gavnligt med hensyn til lokalisering af webstedet, fordi det er lettere at få oplysninger om, hvilke specifikke fragmentioner der ændres i peptidet. Desuden tillader DIA-arbejdsgange identifikation og kvantificering af mindre PTM-peptidisoformer med identiske forløberioner. DIA metoder kan også bestemme en bestemt PTM site lokalisering i et peptid baseret på specifikke tilsvarende fragment ioner, der er omfattende målt på alle tidspunkter. DDA-tilgange anvender dog ofte "dynamiske udelukkelsesfunktioner", der udelukker flere prøveudtagninger af MS/MS for den samme forløber, og mangler dermed mindre PTM-isoformer.
Den samtidige berigelsesstrategi, der er beskrevet her, er ideel til undersøgelser, der vil drage fordel af den globale profilering og kvantificering af flere PTM'er, undersøge PTM-krydstale og forstå de dynamiske interaktioner mellem posttranslationelle ændringer. Identifikation af flere berigede PTM'er i én kombineret arbejdsgang er beskrevet ved: global, seriel eller parallel berigelse af PTM indeholdende proteolytiske peptider eller alternativt ved analyse af intakte proteiner. I direkte sammenligning med seriel berigelse af acetylation og korthedsopning blev effektiviteten af one-pot-metoden fastslået som meget ens14. Disse alternative protokoller kræver betydelige mængder af udgangsmateriale og tid og kan være uoverkommeligt dyre. I modsætning hertil giver one-pot-protokollen en billig og effektiv metode til berigelse af mere end én PTM med efterfølgende analyse og identifikation.
Mus levervæv er fremstillet af SIRT5 knockout mus og bruges her som udgangsmateriale. Denne protokol kan også udføres for protein lysater fra forskellige væv eller cellekultur eksperimenter. Denne protokol kan anvendes på proteinlysater fremstillet af væv eller cellekulturpiller.
Protocol
Alle forsøg, der er beskrevet i protokollen, følger retningslinjerne fra Buck Institute Institutional Animal Research Committee.
1. Ekstraktion af protein fra homogeniseret væv og fordøjelse med protease
- Forbered lysisbufferen til en endelig koncentration på 8 M urea, 50 mM triethylammoniumbikarbonat (TEAB), 1 μM trichostatin A (TSA), 20 mM nicotinamid, 75 mM natriumchlorid (NaCl), 1x protease/phosphatase inhibitor cocktail (PIC) med HPLC-grade vand.
- Tilsæt en steril stålperle til et 2 ml rør kompatibel med en perlemølle homogenisator, og placer derefter vævsstykket (ært størrelse) i røret. Tilsæt lysis buffer (500 μL) og vortex kort for at sikre bufferen dækker vævsstykket (tilsæt mere lysisbuffer, hvis det er nødvendigt). Placer rør på forkølet adapter sæt, der sikrer, at rørene er afbalanceret mellem homogenisatorens to adaptere.
- Prøverne homogeniseres 2x ved 25 Hz i 3 min hver ved 4 °C. Hvis vævet ikke er fuldstændig homogeniseret, skal rørene spindes kortvarigt og overføres den homogeniserede lysat til et friskmærket 1,5 ml rør. Derefter tilføje yderligere lysis buffer til de resterende væv stykke, og gentag homogenisering 2x ved 25 Hz i 3 min hver. To runder af homogenisering er typisk tilstrækkelige til at bryde op vævet.
- Fjern metalperlen med en pincet. Mellem hver prøve skylles pinceten med HPLC-grade vand, HPLC-grade methanol og HPLC-grade vand igen.
- Kombiner de homogeniserede lysates, hvis to runder af homogenisering blev anvendt og sonikere prøver med en ultralydator i 10 cyklusser ved 30 s on/30 s off og 4 °C ved høj effekt.
- De homogeniserede lysater centrifugeres ved 14.000 x g i 10 min ved 4 °C for at rydde lysatet. Overfør supernatanten (ryddet lysat) til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør, så der undgås fedtlag, der kan sidde oven på supernatantet og snavs i bunden af røret.
- Udfør en bicinchoninsyre (BCA) analyse til at måle proteinkoncentrationen af den ryddede lysat med en ordentlig fortynding (f.eks. 1:20 og/eller 1:200). Ifølge BCA resultater, aliquot 1 mg protein fra hver prøve.
- Reducer proteiner i 4,5 mM dithiothreitol (DTT) ved 37 °C i 30 min med omrøring ved 1.400 omdrejninger i minuttet. Efterfølgende alkylate proteiner i 10 mM iodoacetamid (IAA) med inkubation i mørke (sted i skuffe eller skab) ved stuetemperatur (RT) i 30 min.
BEMÆRK: Der kan anvendes alternative reagenser, f.eks. - Der tilsættes 50 mM TEAB til prøverne for at fortynde urinstofkoncentrationen til under 2 M. Punkt 1 μL af prøven på et pH-papir for at sikre, at pH-værdien af den fortyndede prøve er mellem 7,0-8,5. Tilsæt trypsin til hver prøve ved et forhold på 1:50 (trypsin-til-protein, wt/wt) og fordøje proteinet med omrøring ved 37 °C natten over (ca. 14-16 h).
- Forstryg fordøjerne med 10% formic syre for at nå 1% formic syre den næste dag. Vortex og spin kort. Punkt 1 μL af prøven på pH-strimler for at sikre, at fordøjet er pH = 2-3. Centrifugeprøver ved 1.800 x g i 15 min ved RT for at pelletere uopløseligt materiale.
2. Afsaltning af ikke-berigede proteolytiske peptider via storstilet fast faseekstraktion
- Anskaffe patroner, der indeholder C18 harpiks, der kan binde op til 10 mg protein. Monter disse patroner ind i et vakuumapparat for at bruge vakuumsugning, der kan trække væsken gennem patronen under hvert af følgende trin. Angiv en patron for hver peptidprøve.
- Tilsæt 800 μL 80% acetonitril (ACN) i 0,2% formic syre til patroner med 19,8% vand og brug vakuumsugning til at trække væsken igennem. Gentag dette trin 1x, undgå tørring af patronerne helt.
- Ligevægtspatroner ved tilsætning af 800 μL 0,2% myresyre i vand med vakuumsugning for at trække hele lydstyrken gennem filteret. Gentag denne 2x. Læg peptider på patronerne med vakuumsugning. Vask peptider 2x med 800 μL 0,2% myresyre i vand under vakuumsugning.
- Arranger 1,5 ml mikrocentrifugerør under hver patron for at indsamle peptideeeidet i det sidste trin. Under vakuumsugeelute peptider fra patroner, først med 800 μL 80% ACN i 0,2% formic syre og 19,8% vand, derefter med 400 μL af samme opløsning. Drysaltede peptidprøver tørres helt i en vakuumkoncentrator (2-3 timer).
3. Samtidig berigelse af K-acetylerede og K-succinylated peptider med immunaffinitet perler
- Resuspenderes de tørrede peptider i 1,4 ml kold 1x immunaffinitetsrensningsbuffer (IAP). Vortex at blande og sikre en pH på ~ 7. Centrifugeprøver ved 10.000 x g i 10 min ved 4 °C. En lille pellet kan forekomme.
- Sæt peptider til side på is, mens du forbereder antistof-perler. Til et rør af K-acetyl og rør af K-succinyl antistofperlegylle (volumen: 100 μL gylle pr. rør), tilsættes 1 ml kold 1x fosfatbuffere (PBS) og blandes ved pipettering. Overfør hele opløsningen til et nyt 1,5 ml rør, og spin i en miniaturecentrifuge i 30 s på RT.
- Aspirere PBS, passe på at undgå at indsugning off nogen perler. Gentag vask 3x ved at vaske igen med 1 ml koldt 1x PBS, centrifugering for 30 s på RT og indsugning fra PBS.
- Genophæng perlerne i ca. 440 μL PBS. En fjerdedel af antallet af perler i hvert PTM-rør (100 μL, leveret af producenten) anvendes til enpotberigelse (ca. 62,5 μg af hvert immobiliseret antistof til både K-acetyl- og K-kortfattede antistofperler). Pipetterperlerne flere gange for at blande godt. Fjern 100 μL acetyllysinantistofperler, og overføres til ét rør med 200 μL forskæringsspidser, så masterblandingen forbliver ensartet blandet.
- Gør det samme med de kortfattede lysinantistofperler ved at fjerne 100 μL succinyllysinantistofperler til røret for at nå lige dele af acetyllysinantistoffet og det kortfattede-lysinantistof i hvert rør. Spin ned for 30 s i en miniature centrifuge og aspirate off medier med gel loader tip (perler vil blive hvid).
BEMÆRK: Hvert rør skal have en lignende perlepellet i bunden. - Pipette resuspended peptid direkte på de vaskede perler. Vær omhyggelig med at undgå pellets (tilsæt hurtigt for at undgå udtørring af perlerne). Inkuber peptiderne med perler ved 4 °C natten over med omrøring.
4. Elution af peptider bundet til antistof perler
- Anstil peptidprøverne ved 2.000 x g for 30 s ved 4 °C. Fjern supernatanten, der indeholder ubundne peptider, og gem til fremtidige eksperimenter, hvis det ønskes. Tilføj 1 ml kold 1x IAP buffer til perlerne til at vaske og blande ved at vende 5x. Drej ved 2.000 x g for 30 s ved 4 °C. Aspirere fra IAP-opløsningen og gentag IAP-vasketrin 1x i alt to vaske.
- Tilsæt 1 ml koldt HPLC-vand til perlerne og blandes ved at vende 5x. Drej ved 2.000 x g for 30 s ved 4 °C. Aspirate fra vandet. Gentag vandvasktrinnet to gange for i alt tre vasker. Drej en ekstra tid ved 2.000 x g for 30 s ved 4 °C for at opsamle resterende vand i bunden af røret. Aspirate off eventuelle ekstra vand, der kan have indsamlet med flad-tippet gel lastning tips. Vær omhyggelig med at undgå at aspirere perlerne.
- Der tilsættes 55 μL 0,15% trifluoreddikesyre i vand til perlerne. Inkuber perlerne i 10 minutter på RT, mens lejlighedsvis trykke på bunden af røret til at blande. Spin perlerne på RT i 30 s i en miniature centrifuge. Fjern de elutedpeptider og der er afsat ved hjælp af en flad-tippet gel-loading tip.
- Tilsæt 45 μL 0,15% trifluoreddikesyre i vand til perlerne. Inkubere i 10 minutter på RT, mens trykke på bunden af røret lejlighedsvis at blande. Spin perlerne på RT i 30 s i en miniature centrifuge. Fjern den anden elution ved hjælp af en flad-tippet gel-loading tip og kombinere med den første elution.
- Spin de kombinerede elutedpeptider ved 12.000 x g i 5 minutter på RT for at pille eventuelle perler, der fremfører. Prøven opløsning til peptider overføres til et nyt 500 μL-rør.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
5. Afsaltning af berigede peptider
BEMÆRK: Prøvernes pH-værdi skal være mindre end 4 for optimal binding til spidsen, der indeholder C18 harpiks. Brug en 10 μL pipettespids, der indeholder 0,6 μL C18 harpiks og en 10 μL pipette til at styre spidsen.
- Forfugt C18-spidsen ved at pipettere 10 μL acetonitril i spidsen. Dispenser acetonitril til affald. Gentag dette trin to gange mere.
- Hæld spidsen i ligevægt ved at vaske 3x med 10 μL 0,2 % myresyre i vand. Udlad opløsningen til affald efter hver ligevægt.
- Læg peptider fra prøven på spidsen ved kontinuerligt at pipettere og dispensere beriget peptidprøve med spidsen. Pipette op og ned gentagne gange mindst 20x og dispensere den resterende opløsning fra spidsen.
- Den spids, der indeholder bundet peptid, vaskes med 10 μL 0,2 % myresyre i vand. Udbår opløsning til affald. Gentag dette trin 9x.
- Elute peptider i et nyt rør ved hjælp af 10 μL af en eluion buffer indeholdende 0,2% myresyre, 50% acetonitril, og 49,8% vand. Pipette og udlad gentagne gange opløsningen på 10 μL i det nye rør 15x. Dette trin gentages med yderligere 10 μL elueringsbuffer, der gentagne gange pipetterer i samme rør som den foregående eluering.
- Tørre peptider helt i vakuumkoncentrator (ca. 20 min). Resuspenderes de tørrede peptider i passende volumen på 0,2% myresyre i vand.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
6. Dataindsamling ved hjælp af DDA og DIA
BEMÆRK: Analysér prøverne med DDA- og DIA LC-MS/MS-metoder, som kan justeres afhængigt af det tilgængelige massespektrometriske instrument. Her blev prøverne analyseret ved hjælp af et nano-LC 2D HPLC-system koblet til et massespektrometer med høj opløsning.
- Brug et HPLC-system kombineret med et chipbaseret platform HPLC-system, der er direkte forbundet med et massespektrometer (mange LC-MS-konfigurationer og -systemer kan også bruges).
- Analyse af prøver ved hjælp af omvendt fase HPLC-ESI-MS/MS
- Efter injektionen overføres peptidblandingerne til en C18-chip før kolonne og afsalter peptiderne ved at vaske med mobil fase A ved 2 μL/min i 10 min. Derefter overføres peptiderne til en analytisk kolonne og elute med en strømningshastighed på 300 nL/min med en 2-3 h gradient ved hjælp af mobile fase A og B. Brug specifikt en lineær gradient fra 5% mobil fase B til 35% mobil fase B over 80 min.
- Derefter rampe den mobile fase B til 80% over 5 min, derefter holde på 80% B i 8 min før han vender tilbage til 5% B for en 25 min re-equilibration.
- Byg en MS-instrumentmetode til DDA, og definer følgende instrumentscanningseksperimenter
- Eksperiment 1: MS1 forløber ion scanning fra m/z 400-1.500 (akkumuleringstid på 250 ms). Indstil intensitetsgrænsen for at udløse MS/MS-scanninger for ioner af opladningstilstande 2-5 til 200 optællinger. Indstil den dynamiske udelukkelse af prækursorier til 60 s.
- Eksperiment 2: MS/MS-produktionscanning med et MS2-scanningsområde fra m/z 100-1.500 (akkumuleringstid på 100 ms pr. 30-produktscanning pr. cyklus). Indstil kollisionsenergien til CES = 5, og vælg derefter "højfølsomhedsproduktionsscanningstilstanden".
BEMÆRK: DDA-metoden vil erhverve MS/MS spektre for de 30 mest udbredte forløberioner efter hver undersøgelse MS1-scanning pr. cyklus, og den samlede cyklustid vil være ~ 3,3 s. DDA-opkøb vil blive brugt til at bygge spektrale biblioteker som beskrevet i afsnit 7.
- Opbygning af en MS-instrumentmetode til DIA og definition af følgende instrumentscanningseksperimenter.
- Eksperiment 1: udfør MS1 forløber ionscanning fra m/z 400-1.250 (akkumuleringstid på 250 ms).
- Eksperiment 2: Udfør MS/MS-produktionscanninger for 64 variable SWATH-segmenter med et MS2-scanningsområde fra m/z 100-1.500 (akkumuleringstid på 45 ms pr. hver 64-produktionsscanning pr. cyklus). Indstil kollisionsenergien til CES = 10, og vælg derefter "højfølsomhedsproduktionsscanningstilstanden".
- Brug den 64 variable vindue DIA / SWATH erhvervelse strategi som beskrevet af Schilling et al.22 for at opnå label-fri kvantificering med en samlet cyklus tid på ~ 3,2 s. Kort, i denne erhvervelse, i stedet for Q1 quadrupole sender en smal masse område igennem til kollisionscellen, et bredere vindue af variabel vinduebredde (5 -90 m / z) er bestået i trinvise trin over hele masseområdet (m / z 400 -1.250 med 64 SWATH segmenter, hver med en 45 ms akkumulering tid, hvilket giver en cyklus tid på 3,2 s, som omfatter en MS1 scanning med en akkumuleringstid på 250 ms).
BEMÆRK: Den variable vinduesbredde justeres i henhold til kompleksiteten af den typiske MS1 ionstrøm, der observeres inden for et bestemt m/z-område ved hjælp af en variabel vinduesberegneralgoritme22 (mere smalle vinduer vælges i "travle" m/z-områder, brede vinduer i m/z-områder med få eluerende forløberioner). På andre MS-instrumentplatforme kan der gennemføres andre DIA-vinduesstrategier.
7. Dataanalyse
BEMÆRK: Nogle dataanalyseindstillinger bør ændres og skræddersys til det specifikke eksperiment. F.eks. afhænger den udvalgte proteindatabase (FASTA-fil) af de arter, hvorfra prøven blev fremstillet (her Mus musculus). Nedenfor beskrives dataanalysen for museprøver beriget med acetylerede og succinylated peptider.
- Brug en MS-databasesøgemaskine til at analysere DDA-anskaffelser. Opret en databasesøgemaskinemetode på følgende måde:
- For eksempelbeskrivelsesparametre: vælg "Identifikation" under eksempeltype, vælg "Iodoacetic Acid" under "Cystein alkylation", vælg "Trypsin" under "Fordøjelsen" (under forudsætning af C-terminalspaltning ved lysin og arginin), vælg "TripleTOF 6600" under instrument under Særlige faktorer, markér Acetylation-vægt og Succinylation-berigelse, og vælg Mus muskulakulus under Arter.
- For specifikke behandlingsparametre: vælg "Biologiske ændringer" under ID Focus, vælg "SwissProt" under Database, markér "Grundigt ID" under Søgeindsats, vælg "0,05 (10 %)" under "Opdaget proteintærskel", og markér "Kør false discovery rate analysis" under "Resultatkvalitet". Gem søgemaskinemetoden, og send massespektrometriske råfiler til behandling af databasesøgemaskinen ved hjælp af den genererede metode.
BEMÆRK: I en iterativ proces kalibreres alle MS- og MS/MS-scanninger automatisk af søgemaskinen baseret på indledende anmærkninger og resultater.
- Klik på "Export Peptide Summary" ved afslutningen af søgningen og filtrere alle peptid identifikation resultater med en "tillid tærskel" på 99 i et regneark software (f.eks Excel; falsk opdagelse sats [FDR] på 1%).
- Iregnearksfilen" Peptidresumé " filtreres der for alle peptider, der indeholder PTM-anmærkningen "acetylation" og "kortfattetisering" i ændringskolonnen for at generere en resultatrapport, der udelukkende præsenterer de acylated peptider og deres tilsvarende proteiner.
- Hvis du vil bygge MS/MS-spektralbiblioteker til viderebehandling af DIA-råfilen og yderligere relativ kvantificering, skal du åbne DIA Kvantitativ analysesoftware. Vælg fanen "Bibliotek", klik derefter på "Generer Spektralbibliotek" fra "Database Søgemaskine" og åbn en Database Search Engine FDR-rapport (filen *FDR.xlsx), som automatisk blev genereret som en del af dda-råfildatabasesøgeprocessen. Klik derefter på "næste" og vælg "LibrarySettings Schema" og "næste". Vælg "Uniprot_mouse_proteome" som database, og klik derefter på "næste" og "goa_mouse" som genanmærkningsfilen (ontologi). Endelig skal du klikke på "afslut", og spektralbiblioteket genereres.
BEMÆRK: Oplysninger om de acetilerede og kortfattede peptider fra DDA-rådatafilerne, forløberionsscanninger fra MS1 og fragmenteringsscanninger fra MS2 vil blive inkluderet i spektralbibliotekerne (dette omfatter opbevaringstid, MS/MS-fragmenteringsmønster osv.). - Brug DIA kvantitativ proteomics analyse software til at udføre relativ kvantificering af acetylation og kortfattetlation niveauer og skabe regneark af kandidat PTM-holdige peptider, der kan bruges til yderligere dataanalyse.
- Hvis du vil analysere og kvantificere PTM-holdige peptider, skal du bruge skabelonanalyseskemaet. Skabelonskemaet er tilgængeligt i softwaren ved at vælge indstillingen "Indstillingsperspektiv" | "DIA-analyse" | "BGS PTMs" (enten signifikanteller sparsom, afhængigt af forsøget).
BEMÆRK: I stedet for at bruge BGS PTM-analyseskabelonen i DIA Kvantitativ analysesoftware kan alle PTM-specifikke indstillinger også konfigureres manuelt efter disse instruktioner: 1) under "identifikation", vælg "PTM lokalisering" (sandsynlighedcut = 0,75); 2) i "kvantificering", vælg "mindre peptid gruppering" | "modificeret sekvens"; og 3) under "post-analyse" skal du vælge "differentialabundancegruppering" | "mindre gruppe" (kvantificeringsindstillinger). Disse indstillinger vil aktivere PTM lokaliseringfunktion, således at modificerede peptider er opført som individuelle poster og differentialanalyse udføres på peptid niveau. - Hvis du vil starte kvantificeringsanalysen, skal du markere fanen "Pipeline" og derefter klikke på "Konfigurer en DIA-analyse fra fil", åbne MS DIA-råfilerne af interesse for relativ kvantificering. Vælg "Tildel Spektralbibliotek" og vælg det bibliotek, der er bygget ovenfor, klik på "indlæs" | "næste". Vælg analyseskemaet "BGS PTMs", og klik på "næste". Vælg den relevante database FASTA-fil "Uniprot_mouse_proteome" | "næste". Definer betingelsesopsætningen, som tildeler de forskellige betingelser til eksemplerne, og klik på "næste". Vælg "goa_mouse" som genanmærkningsfilen (ontologi), og klik på "næste". Gennemse analyseoversigten (oversigt over eksperimentopsætningen) og vælg "outputmappe" | "afslut". Endelig skal du klikke på "Kør pipeline" for at udføre den etiketfri kvantitative analyse.
BEMÆRK: Statistiske moduler i DIA Kvantitativ Analyse Software udfører automatisk FDR-analyse, genererer varmekort og vulkanplots, der sammenligner de forskellige betingelser, genererer lister over identificerede og kvantificerede peptider og proteiner og giver Q-værdier sammen med relative fold ændringer sammenligne forskellige betingelser.
- Hvis du vil analysere og kvantificere PTM-holdige peptider, skal du bruge skabelonanalyseskemaet. Skabelonskemaet er tilgængeligt i softwaren ved at vælge indstillingen "Indstillingsperspektiv" | "DIA-analyse" | "BGS PTMs" (enten signifikanteller sparsom, afhængigt af forsøget).
- Alternativt kan du bruge software til fjernelse af DIA-datasæt til behandling af data og udføre statistisk analyse efter eksport af de udtrukne spidsområder til acetylation og kortgørelsessteder.
8. Data visualisering af modificerede peptider og vurdering af PTM site lokalisering
- Hvis du vil åbne en genereret DIAKvantitativ analyse, skal du vælge fanen "Analyse" efterfulgt af "indlæs det kvantitative analysesoftwareeksperiment" (fra et gemt eksperiment, der åbner et *. SNE-fil). Gå til *. SNE-resultatfil, og vælg "åbn".
- I venstre panel skal du klikke på pilen til venstre for den tredje rå data *.wiff fil fra toppen for at udvide og visualisere alle 64 SWATH segmenter. Klik på pilen til venstre for segmentet [428.7-437.3] for at udvide det specifikke segment og vise de modificerede peptider, der er identificeret for dette masseområde. Klik på det tredoblingsladede peptid KQYGEAFEK[Acetyl]R.
BEMÆRK: Det øverste højre panel viser som standard MS2 XIC, og det nederste panel viser MS1 Isotope Konvolut XIC- Vælg "PTM Lokaliseringsplot" i det øverste panel. Vælg "PTM Lokaliseringsplot" i det nederste panel.
- I PTM Lokalisering Plot, skal du vælge den øverste peptid sekvens "KQYGEAFEK[Acetyl]R", med en samlet PTM lokalisering score på 18,32. Klik på pilen til venstre for at udvide visningen og visualisere bekræftelseog tilbagevisning af ioner. Klik på pilen ved siden af "Confirming Ions", og vælg derefter ionen "y3 [+42]" for at fremhæve den pågældende ion, som bekræfter, at acetylationsstedet er placeret på K2 i peptidsekvensen.
- I PTM Lokalisering Plot vælge den anden peptid sekvens "K [Acetyl] QYGEAFEKR" med en samlet (meget lav) PTM lokalisering score på 1. Klik på pilen til venstre for at udvide visningen og visualisere bekræftelseog tilbagevisning af ioner. Klik på pilen ved siden af "Confirming Ions", derefter på pilen ved siden af "Refuting Ions", og vælg derefter nogle fragmentereioner for at visualisere og vurdere det udtrukne ionkratogram og MS/MS spectra (Figur 5).
BEMÆRK: Den tildelte PTM Lokaliseringsscore og visuel inspektion indikerer, at den korrekte PTM isomer er KQYGEAFEK[Acetyl]R, mens der ikke foreligger eller er minimale beviser for den anden mulige PTM isomer K[Acetyl]QYGEAFEKR.
Representative Results
Figur 1 viser et generelt diagram over arbejdsgangen, herunder høst af vævet fra muselever, ved hjælp af 1 mg protein til nedbrydning af proteinlysat med trypsin, inkuberende peptider med antistofkonjugerede perler, erhvervelse af prøverne på MS og endelig dia/swath-analyse af dataene ved hjælp af forskellige kvantitative proteomics softwarepakker (akademiske og kommercielle).
Figur 2A viser, hvordan arbejdsgangens tidsplan og mængden af prøve og protein kræves sammenlignet med alternative metoder, der i øjeblikket anvendes til multi-PTM-berigningsundersøgelser. Den one-pot metode kan udføres i halvt så meget tid og med halvdelen af antallet af prøver som disse alternative metoder. Sammenlignet med den to enkelt-PTM berigelse metode, en-pot protokol kræver også halvdelen af mængden af protein.
Denne protokol har vist sig at være et gennemførligt og omkostningseffektivt alternativ. Figur 2B viser, at medianvariationskoefficienten for modificerede peptidområder var lavere i one-pot-metoden end i single-PTM- og seriePTM-berigelserne. Figur 2C,D viser, at selv om de sammenlignede ptm-værdien med én pot og enptm-berigelsesmetoder, var der ingen bemærkelsesværdige forskelle mellem korrelationerne mellem kvantificeringer på lokalitetsniveau for de to ændringer. Dette var også tilfældet for peptid-niveau og fragment-niveau korrelationer. Den samme observation for alle tre korrelationer, når man sammenligner one-pot og serial-PTM berigelser. Alle underliggende MS-rådata og behandlede Excel-resultatark, der er knyttet til en nylig rapport fra Basisty et al.14, er tilgængelige og kan downloades fra MassIVE (MSV00081906) og ProteomeXchange (PXD008640).
Generelt er de antistoffer, der anvendes i denne undersøgelse, blandinger af uafhængigt genererede kloner og dermed give bredere Særtræk.
Eksperimentelle resultater dokumenterer muligheden for at opdage og vurdere PTM krydstale. Figur 3 viser data fra en vellykket berigelse og illustrerer et eksempel for et peptid, der indeholder flere og forskellige acylmodifikationer, der visualiserer PTM krydstale. Figur 3A viser et peptid, der acetylateres på den ene lysinrester og er kortfattet på den anden side, og figur 3B viser det samme peptid, der er kortfattet ved begge lysiner. Dette viser, at den samme lysinrester kan ændres med begge acylationsgrupper, og der er mulighed for krydstale på dette sted. Figur 4 viser antallet af lysinrester, der blev identificeret som beskrevet i punkt 7.1-7.3 til at bære begge ændringer, der også peger mod mulige PTM krydstale.
Som figur 5 viser, giver behandling af DIA PTM-datasæt med kvantitativ proteomics software os mulighed for at lokalisere, hvilke specifikke lysinrester der ændres. Dette er et begreb kendt som site lokalisering, som er et vigtigt skridt for enhver analyse for bestemmelse af mulige PTM krydstale. Figur 5 viser to potentielle isoformer sammen med bekræftelses- og tilbagevisningsionerne for hver, der kan visualiseres og vurderes som beskrevet i afsnit 8.1-8.3 (specifikt trin 8.3.2 og 8.3.3). På grundlag af disse oplysninger kunne vi trygt identificere, hvilken af de to isoformer der var til stede i den oprindelige prøve. MS/MS-spektret af den bekræftede isoform KQYGEAFEKacR viser klart, at y ionerne (y2-y5),der indeholder den acetylerede lysinrester, som skiftede med 42 m/z (en acetylgruppes forøgelsesmasse), bekræftede den specifikke lysinrester i peptidet, der blev ændret.
Figur 1: Typisk arbejdsgang for berigelse af PTM'er med én pot. Væv (her, lever) høstes fra SIRT5 KO og vilde-type (WT) mus, og proteiner er lysed, trypsin-fordøjet i peptider, og afsaltet. Peptider beriges derefter ved immunaffinitet med kombinationer af succinyl- og acetyl-antistofperler. Parallelle MS-arbejdsgange måler både 1) små aliquots af hele lysate proteinudtryksændringer (for proteinnormalisering) og 2) berigede acylholdige peptider til identifikation af acylationswebsted (DDA-MS) og lokalisering af lokaliteter på stedet efterfulgt af kvantificering (DIA-MS). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Sammenligning af arbejdsgangen med én pulje med alternative metoder. (A) Sammenligning af tid, omkostninger og materialer, der kræves til arbejdsgangen med én pulje, serie-PTM-berigelse og to enkelt-PTM-berigelser. (B) Sammenligning af CV'er mellem arbejdsgangen med én gryde, en enkelt PTM-berigelse af acetyllysin og enkelt ptm-berigelse. Spearman korrelationsanalyse sammenligne acyl peptid peak områder opnået fra en-pot arbejdsgang, og single-PTM berigelser: tilsvarende parceller af log2 peak område resultater for (C) acetylation sites og (D) kortfattetlation steder. Regressionsskråninger og korrelationsfaktorer er angivet i de enkelte paneler14. To uafhængige biologiske replikater blev behandlet for hver af betingelserne. Dette tal er blevet ændret fra Basisty et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Krydstale mellem acetylation og kortfarvning af lysinrester. MS/MS spektre af tryptatiske peptider fra mitokondrial 3-ketoacyl-CoA thiolase, der viser den samme aminosyre sekvens, men er blevet ændret ved to lysinrester med forskellige PTMs. (A) MS/MS af peptid AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK ogB) MS/MS af peptid AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK. Dette tal er blevet ændret fra Basisty et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Overlap og krydstale mellem de acetylerede og succinylated lysinrester–specifikke eksempler på proteinkomplekser. (A) Venn-diagram med overlap mellem 2.235 acetylation og 2.173 kortgørelsessteder. Heraf var 943 lokaliteter både acetylerede og succinylated. Lever fra en SIRT5 (de-succinylase) knockout mus blev analyseret, og mange kortfattetlation steder blev identificeret. Faktisk var de mere rigelige end normalt observeret i muselever (modificerede peptider blev filtreret til en Q-værdi på <0,05). (B) Proteinkomplekser, der viser procentdelen af deres underenheder, der indeholder både acetilerede og succinylated sites (fed rød linje repræsenterer betydningen som bestemt af Fishers nøjagtige test). (C) Diagram over ATP syntase kompleks: protein underenheder i rødt skildrer de underenheder, der indeholder både acetylated og succinylated sites. Dette tal er blevet ændret fra Basisty et al.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kvantitative proteomics software dechifrere peptid site lokalisering af PTMs. Baseret på MS/MS fragmentering af peptidet er det muligt at give oplysninger om de specifikke lysinrester, som acetylgruppen ændrer. Dette viser softwareens evne til at tilbyde værdifulde oplysninger om lokalisering af PTM'er. (A) To muligheder for lysinrestermodifikation og LOKALISERING af PTM-stedet: KQYGEAFEKacR (til venstre) og KacQYGEAFEKR (til højre). "Bekræfter" og "tilbagevise" fragment ioner er vist for hver af de potentielle site lokalisering isoformer af peptid. Baseret på disse oplysninger tildeles bekræftelse af scorer og tilbagevise resultater, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af isoform KQYGEAFEKacR i prøven. B) MS/MS-frekvenser svarende til den bekræftede isoform KQYGEAFEKacR, der angiver, at alle y ioner, herunder de acetylerede lysinrester (y2 og højere), bærer en stigningsmasse på +42 m/z, hvilket svarer til acetylændringen. Observerede b-ioner indeholder ikke ændringen. (C)Udvundet ionkromatogramme (XIC) med rigelige topområder som følge af y2 og y3 ioner, som begge udgør acetylationsstedet i det bekræftede isoform KQYGEAFEKacR. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol beskriver en ny teknik til samtidig flere PTM berigelse til mere effektivt at forstå PTM krydstale. Alternative metoder til at nå dette mål har tendens til at være uoverkommeligt tidskrævende og dyre, og de kræver , at store mængder protein lykkes11,13. Denne protokol præsenterer en multi-PTM berigelse workflow, der indebærer inkubation i antistof-konjugerede perler til to PTMs på én gang for at forbedre den samlede effektivitet af forsøget. Denne metode indebærer også anvendelse af DDA til spektral biblioteksgenerering og DIA MS-opkøb til at opdage og kvantificere de tilstedeværende peptider med reduceret interferens fra fragmentioner22,23. Softwareprogrammer, såsom MS database søgemaskiner bruges til at analysere og kvantificere data fra DDA opkøb, mens kvantitative Proteomics Software24 og specifikke DIA kvantitative analyse Software25 er nødvendige for at fortolke de komplekse spektre produceret af DIA opkøb.
Der er flere kritiske trin i denne protokol, som bør følges nøje. Da hovedformålet med protokollen er at berige for flere PTMs samtidigt, antistof-affinitet berigelse trin (afsnit 2) er afgørende for succes eksperimentet. Når du udfører vasker på perlerne, er det nødvendigt at sikre, at ingen af perlerne er indsugning ved et uheld. Det er også nødvendigt at sikre, at urinstofkoncentrationen er fortyndet til 1 M før fordøjelsen med trypsin (trin 1.8). Selv om 8 M urea er påkrævet tidligere i protokollen for protein opløselighed, urea koncentrationer over 1 M vil hæmme trypsin's enzymatiske aktivitet. Desuden er det vigtigt konsekvent at kontrollere prøvens pH-pc i hele protokollen. Dette er især vigtigt før fordøjelsen. Hvis prøvens pH-pH og trypsinopløsningen ikke neutraliseres korrekt før inkubationen, kan det resultere i en ineffektiv fordøjelse, hvor mange spaltningssteder kan gå glip af, hvilket resulterer i færre peptididentifikationer.
Et par ændringer af protokollen kan være nyttige, når du forbereder prøver. For et protein lysate indkøbt fra 1 mg udgangsmateriale, en fjerdedel af antistof perler ne i hvert PTM scanningsrør kan bruges som et omkostningseffektivt alternativ. En større mængde udgangsmateriale kan bruges til bedre resultater, så længe mængden af anvendte antistofperler øges forholdsmæssigt. En anden ændring, der kan forbedre arbejdsgangen er at fordøje prøver med en anden protease ud over trypsin. Denne ændring ville resultere i større variation i peptider kløvet, hvilket giver øget dækning af proteinrester. Selvom det ikke er nødvendigt, anbefales det, at trypsin være et af de enzymer, der anvendes til PTM analyse på grund af sin høje kavalergang specificitet26.
En begrænsning af denne protokol er, at de ptms, der undersøges , skal have lignende kemifor at blive beriget samtidig14. Procedurerne for de forskellige antistofkonjugerede perler skal være ens, idet lignende opløsningsmidler og opløsninger, herunder lignende elueringsbetingelser, og helst fra samme leverandør. Af denne grund, den metode, der er skitseret her konsekvent bruger acetylation og kortfattetlation som et eksempel, som begge bruger antistof-konjugerede perler (Cell Signaling Technology, Inc). Selv om denne metode teoretisk set kan anvendes på et vilkårligt antal PTM'er, vil der være behov for yderligere undersøgelser for at vurdere protokollens nøjagtige begrænsning i denne henseende. Da dette er en antistofbaseret berigelsesmetode, kan metoden desuden kun give en relativ kvantificering af PTM-steder.
Sammenlignet med eksisterende multi-PTM berigelse metoder, denne arbejdsgang er et mere realistisk og omkostningseffektivt alternativ. Ud fra dette eksperiment blev det bemærket, at effekten af denne metode er meget godt sammenlignet med alternative metoder, såsom individuelle eller serielle berigelser. Figur 2B viser , at median-CV'et for modificerede peptidpeakområder faktisk blev nedsat i onepotmetoden sammenlignet med enkelt-PTM-berigelser og seriePTM-berigelser13. Vi analyserede yderligere de eksperimentelle resultater, der vurderede kvantificeringer på site-niveau for acetylation eller korthedsopning. Desuden viste Spearman-korrelationsanalysen (figur 2C,D),at enpotptionsberigelsen udførte på samme måde som arbejdsgangene for enkelt-PTM-berigelse. Dette var også tilfældet for peptid- og fragment-niveau korrelationer. Den samme observation for alle tre korrelationer, når man sammenligner en pot med seriel PTM berigelse.
Denne protokol giver forskerne mulighed for at gøre fascinerende biologisk indsigt i PTM krydstale på en hurtig og omkostningseffektiv måde. DIA-komponenten i arbejdsgangen giver forskerne mulighed for at forstå mere om PTMs, da det giver oplysninger om lokalisering af webstedet og overvinder udfordringer såsom lav belægning af PTM'er. Prækursorer har tendens til at blive udelukket med DDA, hvilket er særlig vigtigt, når man studerer PTMs, da belægningen på stedet ofte er lav til det punkt, hvor disse peptider ikke bliver udvalgt til MS/MS, men stadig indeholder vigtige oplysninger. Der kan udføres opfølgende forsøg for at vurdere den øvre grænse for, hvor mange PTM'er der kan beriges samtidigved hjælp af denne metode. En fremtidig forbedring af denne arbejdsgang kan omfatte udvikling af mere avancerede softwareplatforme for yderligere at automatisere analysen af lokalisering af webstedet og PTM-webstedsbelægning.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender støtten fra NIH's delte instrumenteringslegat til TripleTOF-systemet på Buck Institute (1S10 OD016281). Dette arbejde blev også støttet af National Institute of Allergy and Infectious Disease (R01 AI108255 til B.S.) og National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R24 DK085610 to Eric Verdin; R01 DK090242 til Eric Goetzman). X.X. blev støttet af et tilskud fra National Institutes of Health (NIH grant T32GM8806, til Judith Campisi og Lisa Ellerby), NB blev støttet af en postdoc stipendium fra Glenn Foundation for Medical Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
| Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
| Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
| C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
| C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
| Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
| Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
| Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
| Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
| mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
| Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
| PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
| mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
| Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
| Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
| Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
| ProteinPilot 5.0 - 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
| PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
| PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
| Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
| Skyline - 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
| Spectronaut - 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
| Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
| TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
| TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
| Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
| Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
| Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
| ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |
References
- Christensen, D. G., et al. Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions. Frontiers in Microbiology. 10, 1604 (2019).
- Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. Post-translational modifications in signal integration. Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).
- Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases. Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).
- Swaney, D. L., et al. Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation. Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).
- Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).
- Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms. Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).
- Mocciaro, A., Rape, M. Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control. Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).
- Lopez-Otin, C., Hunter, T. The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer. Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).
- Du, Z., et al. DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination. Science Signalling. 3 (146), (2010).
- McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach. Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).
- Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).
- Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).
- Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment. Proteomics. 18 (17), e1800123 (2018).
- Wang, G., et al. Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation. Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
- Rardin, M. J., et al. Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).
- Rardin, M. J., et al. SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks. Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).
- Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications. Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).
- Sadhukhan, S., et al. Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).
- Collins, B. C., et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature Communications. 8 (1), 291 (2017).
- Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers. Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).
- Meyer, J. G., Schilling, B. Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques. Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Sticker, A., Martens, L., Clement, L. Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about. Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
