Summary
植物形態素遺伝子は、再生成遺伝型の遺伝子変換を改善するために使用することができる。ここに記載されているのは、3つの重要な公共トウモロコシ近交線のためのアグロバクテリウム媒介遺伝形質転換(QuickCorn)プロトコルである。
Abstract
ここで実証されたアグロバクテリウム媒介性遺伝子の近交線の形態形成遺伝子ベビーブーム(Bbm)とWuschel2(Wus2)を使用した間近線の詳細なプロトコルである。Bbmは、トウモロコシリン脂質トランスファーゼ遺伝子(Pltp)プロモーターによって調節され、Wus2はトウモロコシオーキシン誘導性(Axig1)プロモーターの制御下にある。これらの形態形成遺伝子を移動DNA(T-DNA)に搭載するアグロバクテリウム株とアグロバクテリウム病原(vir)遺伝子の余分なコピーは、未熟な胚のトウモロコシに感染するために使用されます。体細胞性胚は、感染した胚のスキューテラ上に形成され、除草剤耐性によって選択され、植物に発芽することができる。DNAコンストラクトに組み込まれた熱活性化cre/loxP組換えシステムにより、形質転換プロセスの初期段階でトウモロコシゲノムから形態素遺伝子を除去することができます。このプロトコルを使用して、W22、B73、Mo17に対して、約14%、4%、および4%(感染した100個の感染した胚当たりの独立したトランスジェニック事象の数)の変換頻度をそれぞれ達成することができる。
Introduction
形質転換は、トウモロコシの外来遺伝子発現を評価し、研究と商業目的の両方で遺伝子組み換えトウモロコシラインを生産するための基本的なツールです。高スループット変換へのアクセスは、トウモロコシ分子および細胞生物学研究の必要性の増加を促進することができます1.作物種を遺伝的に変換する能力は、公立および民間の両方の研究所にとって不可欠です。これにより、遺伝子調節メカニズムの基本的な理解と、増え続ける人口を支える地球規模での作物改善の両方が可能になります。
トウモロコシからの未熟な胚が生殖可能なカルスの産生に使用できるという発見は、1975年2年に始まった。この啓示以来、ほとんどのスケーラブルなトウモロコシ変換プロトコルは、再生3の前にカルスの形成と選択を必要としてきました。遺伝的形質転換の過程で、アグロバクテリウム感染または生物的爆撃を受けた未熟胚は、胚発生カルス誘導のために培地上で培養される。誘発されたカリは、選択的培地(例えば、除草剤を含む)で培養され、変換されたカルス片だけが生き残ることができるようになる。これらの除草剤耐性推定トランスジェニックカリは、増量され、植物に再生されます。この方法は有効ですが、プロセスは長く、労働集約的であり、4を完了するのに3ヶ月以上かかることがあります。さらに重要なことに、従来のトウモロコシ変換プロトコルははるかに大きな制限を有し、すなわち、限られた数のトウモロコシ遺伝子型のみが5,6に変換できる。
Lowe et al.7,8は、変換プロセスの期間を大幅に短縮するだけでなく、変換可能な遺伝子型のリストを拡張した "QuickCorn" 変換方法を以前に報告しました。クイックコーン法は、赤対数転写因子ベビーブーム(BBM)9およびWUS(WUS)10のトウモロコシオルソログ(Zm-BbmおよびZm-Wus2)を利用する。形質転換ベクター系に組み込まれると、これらの遺伝子は、胚発生成長を刺激するために相乗的に働く7。
この作品で説明したQuickCornプロトコルはジョーンズら11のプロトコルに基づいており、Lowe etal7,8によって報告された方法のさらなる改善であった。本研究では、バイナリベクトル構造PHP81430(図1)とアクセサリープラスミドPHP7153912を有するアグロバクテリウム株LBA4404(Thy-)を変換に使用している。PHP81430のT-DNAには、以下の分子成分が含まれています。(1)形質転換選択的マーカー遺伝子Hra発現カセット。このトウモロコシのフラ(Zm-Hra)遺伝子は、スルホニル尿素およびイミダゾリノン類などのALS阻害除草剤に耐性のあるアセトルラクターゼ(ALS)遺伝子を13、14に変更した。Zm-Hra遺伝子はソルガムALSプロモーター8およびジャガイモプロテイナーゼ阻害剤II(ピンII)ターミネータ15によって調節される。T-DNAには、(2)形質スクリーンマーカー遺伝子ZsGreenを有する発現カセットも含まれる。この緑色蛍光タンパク質遺伝子ZsGreenはゾアンサスspサンゴ礁16から、ソルガムユビキチンプロモーター/イントロンおよび米ユビキチンターミネーターによって調節される。
また、T-DNAには(3)形態素性遺伝子Bbm発現カセットが含まれる。Bbmは、胚発生9、17に関連する転写因子である。Bbmは、トウモロコシリン脂質トランスファーーゼタンパク質(Pltp)プロモーター8および米T28ターミネーター18によって調節される。Zm−Pltpは、胚スキュテラー上皮、絹毛、および葉子会社細胞(ガード細胞に隣接する)において強い発現を有する遺伝子であり、生殖器官における低発現、および根8における発現がない。また、(4)形態素遺伝子Wus2発現カセットを含有する。Wus2は、尖部メリステム19の維持に関連する別の転写因子である。Zm-Wus2は、トウモロコシオーキシン誘導性プロモーター(Zm-Axig1)20およびトウモロコシIn2-1ターミネーター21の制御下にある。最後に、T-DNAは(5)cre-loxP再結合系を含む。 また、cre recombinase遺伝子22は、トウモロコシ熱ショックタンパク質17.7(Hsp17.7)23プロモーター及びポテトピンIIターミネーターの制御下にある。2つのloxP部位(同じ向き)24はZsGreen、cre、BbmおよびWus2を含む4つの遺伝子発現カセットを隣接する。
形態形成遺伝子の存在は植物の成熟とその後の子孫には望まれていないため、熱誘発性cre-loxP組み換えシステムがT-DNAに組み込まれ、正常なカルスの再生と植物の発達を可能にするためにトウモロコシゲノムから形態形成遺伝子を除去しました。熱処理の際、CREタンパク質の発現は、Hra選択遺伝子を除くすべての遺伝子のトランス遺伝子を除去する。成功した形質転換体は除草剤耐性であるべきであるが、ZsGreen-陰性である。形質転換頻度をさらに高めるために、アグロバクテリウム株はまた、アグロバクテリウム病原(vir)遺伝子12の余分なコピーを有する追加の付属プラスミド(PHP71539)を収容する。
QuickCornメソッドは、変換中にカルス誘導ステップを伴わないため、従来のトウモロコシ変換プロトコルとは異なります。アグロバクテリウム感染後の最初の週に、体細胞胚は感染した未熟な胚のスキュテーラー上皮に発生する。その後、胚は胚の成熟と芽形成を促すホルモンを持つ培地に移される。体細胞胚を急速に成熟/撃つ形成媒体に移すため、トウモロコシの形質転換に以前に使用されていた伝統的なカルス段階をスキップし、T0植物8の直接生成を可能にする。以前に公開されたトウモロコシ変換法6と比較して、QuickCorn法はより速く、より効率的で、より少ない遺伝子型依存である。この方法を使用して、根付いた植物は、通常、従来のプロトコルで必要とされる3ヶ月以上ではなく、わずか5〜7週間で土壌に移す準備ができています。この記事の目的は、この方法の詳細な説明とデモンストレーションを提供し、ほとんどの学術機関で一般的に見られる実験室の設定で簡単に複製できるようにすることです。
Protocol
1. 成長メディアの準備
- このプロトコルの正確な成長媒体のレシピについては、表1を参照してください。
- 1 L の媒体を準備するには、撹拌プレートに 2 L ビーカーを置き、中に攪拌バーを配置します。
- ビーカーに900mLの蒸留水を入れ、撹拌プレートをオンにします。攪拌バーは中速で回転する必要があります。
- すべての粉末成分を計量し、ビーカーに溶解します。
- 液体成分があれば全部測定し、ビーカーに加えます。
- 蒸留水を使用して最終体積を1 Lにします。
- pHを測定し、レシピの仕様に合わせて調整します。
- 液体成長培地を配合する場合、寒天は添加されない。フィルター滅菌装置を真空ポンプに取り付け、液体成長培地をフィルターに注ぎます。ポンプの電源を入れ、すべての液体が引き抜かれるまで待ちます。コンテナにキャップを置き、ラベルを貼ります。
- 固体成長培地を配合する場合、pHが調整された後、ボトルまたはフラスコに直接寒天を加える。
- 1L液体成長培地を2Lのエルレンマイヤーフラスコに注ぎ、または2つの1 Lオートクレーブ可能なボトル(それぞれ500mL)に分けます。2本のボトルを使用する場合は、寒天を分割し、ボトルに直接追加します。
- フラスコをアルミ箔2層のような通気性カバーで覆い、蒸気が逃げ出すことを可能にする。ボトルを使用する場合は、ねじ蓋を上に緩くキャップします。
- オートクレーブ 121 °Cで 25 分
- オートクレーブ後、オートクレーブから成長培地を取り出し、55〜60°Cに冷却します(55°Cに設定された水浴でこれを容易にすることができます)。プレートを注ぐのが便利になるまで、成長培地を数時間液体状態に保ちます。
- 冷却したら、すべての後殺菌添加剤(表1を参照)を加え、完全に混ぜます。
- すべての成分が添加された後、層流フードで選択した容器に指定されたボリュームを注ぎます。
- 成長培地は、所望のペトリ皿に手動でまたは液体分配装置を使用して注がすことができる。手動で注ぐ場合は、取り扱いが容易なように、オートクレーブされた媒体の大きなボリュームを小さな無菌ビーカー(500 mL)に移すことをお勧めします。
- 成長培地を冷却し、固めます。
- 成長培地は、固体になると一度使用できるようになり、蓋付きプレートのスタックとして無菌流布で一晩少し乾燥した翌日に使用するのが最善です。一晩乾燥した後、プラスチック製の袖にプレートを移し、緩い端の上に折り畳み、テープの小さなビットでこれを所定の位置に保ちます。これにより、過度の乾燥を防止します。媒体は、1ヶ月まで、涼しく、暗く、清潔な環境(4-16°C)に保存することができます。
2. ドナー植物の成長と未熟な耳の収穫
- 土壌のない基質を含む1.5ガロン(5.9 L)ポットの温室で、一般に入手可能な近交生(すなわち、B73、Mo17、またはW22)を栽培します。日中は平均気温が25.5°C、夜間は20°Cの16/8(昼/夜)の写真期間を使用してください。
- 植物は必要に応じて水を入れ、土壌ミックスに組み込むか、植えた後に表面に添加することができる制御放出肥料(15-9-12のN-P-K)で受精されます。
- 通常、耳が出現するまでに種子発芽後約70〜90日かかります。耳の芽が現れると、制御されていない受粉が起こるのを防ぐためにシュートバッグでそれらを覆います。
- シルクが出現してから約2〜3日後に花粉が出る場合は、70%エタノールで殺菌したはさみを使って切ります。シルクを切り、殻の葉の端から約2.5cm下に殻を切り、シルクが現れます。受粉は翌日に実行できます。各耳の間のはさみを再消しにしてください。
- カッセルからアンサーが出てきたら、茎の周りのバッグの付け根にカッセルバッグと非スキッドペーパークリップでカッセルを覆います。
- 翌朝、植物をそっと曲げてバッグをタップして花粉の放出を促します。
- 粉花が逃げるのを防ぐために、カッセルバッグを取り外し、袋の上を折ります。それは一般的に、それが使用される1日前に(死んだ花粉と小屋のアンサーの蓄積を避けるために)使用される1日前に袋に入れるのが最善です。新鮮な花粉は、約3〜5日間、カッセルから収集することができます。カッセルの基部にある内側の小花からアンサーが現れると、そのカッセルは翌日に実行可能な花粉を生成しない可能性が高くなります。
- 同じ植物(セルフ)または同じ近親交配(シビング)の別の植物からの花粉を使用してください。
- イヤーバッグを取り出すか、バッグの端を切ってシルクを露出させ、カッセルバッグから花粉をシルクに素早く注ぎます。
- すぐにカッセルバッグで耳を覆い、それを固定するために茎の周りに袋のベースをホチキス止めします。これは、物理的にクロス受粉を防ぐために、受粉時に異なる遺伝子型の開花植物から植物を分離するのに役立つかもしれません。未熟な耳が収穫する準備ができるまで、耳にカッセルバッグを置いておいてください。
- 受粉後9〜12日、胚サイズの画面耳。受粉袋を茎の上にスライドさせて耳を露出させます。静かに殻を引っ張って、耳の円周の約3分の1から4分の1、耳の下の距離の約3分の1にカーネルを露出します。先端付近のカーネルは、平均胚サイズを表すものではありません。
- メスを使用して、サイズと色の他のカーネルの大半に似ている単一のカーネルのキャップをスライスします。
- 手順 4.6 で説明されているように、胚を除去するには、(定規付きの) へらを使用します。ヘラまたはデジタルキャリパーの作り付けの定規を使用して、胚の長さを測定します。胚が1.5〜2.0mmの間にある場合は、耳を収穫する。1.3mm程度の場合、耳は1日の後半に収穫できる可能性があり、7〜8時間程度で再びチェックすることができます。
3. アグロバクテリウム懸濁液培養の感染準備
注: PHP81430 (図 1)と PHP7153912を含むアグロバクテリウム株 LBA4404(Thy-) は、グリセロールストックとして -80 °C で保存されます。これらの材料は、物質移転契約を通じてコルテバ・アグリサイエンスから得ることができます。LBA4404(Thy-)は、成長培地に供給されるチミジンを必要とする栄養性株です。オーキソトロフアグロ株の主な有用性は、バイオ封じ込めの目的のためである。それは、アグロの過剰増殖を減らす追加の利点を持っています。栄養栄養性アグロ株は、補助チミジンなしでは成長しません。それにもかかわらず、チミジンは(おそらく)培養中の植物組織を死ぬことによって供給することができる。従って、栄養性アグロを完全に制御するために培地中に抗生物質を提供する必要が依然として存在する。しかし、チミジンの不在時に栄養圧性株の成長が損なわれるため、制御が容易になる。
- 感染日の4日前に、50mg/Lチミジン、50mg/Lゲンタマイシン、および50mg/Lスペクチノマイシン(表1)を有するYPプレート上の細菌をストリークすることによって、グリセロールストックから「母」プレートを開始する。「母」プレートを20°Cのインキュベーターで3日間インキュベートする。
- 感染実験の1日前に、「母」プレートから1〜5個のコロニーを選択し、「母」プレートから新しいYPプレート(チミジン、ゲンタマイシン、スペクチノマイシンを含む)に細菌をストリークすることによって、「働く」プレートを準備します。表 1を参照してください。
- 毎日の「作業」プレートを連続した象限でストリークし、連続的に希釈された象限にちょうどストリークされた領域を通ってループ1xを実行し、連続的に希釈された象限を形成するために繰り返します。27 °Cのインキュベーターで一晩「作業」プレートをインキュベートします。
- 胚解剖(ステップ4.8)を完了した後、ループまたは同様のツールを使用して、細菌の増殖がコロニーの薄い筋として見える「働く」プレートの領域からアグロバクテリウムを収集します。
注:細菌の成長の密な芝生とプレートの領域を避けてください。アグロバクテリウムの成長は既に密集した地域で減少し始めている可能性が高く、目に見えるコロニーを持つ地域では細菌が感染に対して適切な成長段階にある。 - 回収した細菌を700A液体培地の10mLを含む50mLチューブに懸濁させる(表1)。細菌培養を完全に中断させる渦。
- 波長550nmで光密度を測定します。OD が 0.35 ~0.45 の間になるまで音量を調整し、0.4 が最適値になります。
注: OD が 0.45 より大きい場合は、700A の液体媒体を追加します。ODが0.35より低い場合、懸濁培養でより多くのアグロコロニーを接種する。
4. 胚の解剖、感染、共培養
- 変換実験に適した耳を選択します。これらは良い種子セットを持っている必要があり、1.5〜2.0ミリメートルの範囲の胚を持っている必要があります。彼らは通常、受粉後9〜12日の間に収穫されます。収穫された耳は新鮮な使用または4°Cで1〜4日間保存することができますが、応答の質は最初の日を超えて長時間の貯蔵で徐々に低下する可能性があります。
- 殻と絹を取り除きます。ハンドルを耳のベースまたは上部に挿入します。ハンドルは鉗子、ドライバー等のペアにすることができます。
- 耳を大きな容器(例えば、ハンドルを上向きに2Lビーカー)に入れ、容器に消毒液を充填します。消毒液は、20%の商業的漂白剤(1.65%次亜塩素酸ナトリウム)および界面活性剤Tween 20の数滴の1.8 Lである。
- 層流ベンチ内の耳を殺菌します。20分後、漂白剤溶液を空にし、無菌蒸留水の寛大な量を使用して耳3x(それぞれ5分)をすすいでください。水を取り除き、耳を数分間乾燥させます。
注:耳を漂白剤溶液に20分間完全に沈めておくことが重要です。時折漂白剤溶液の周りに耳を慎重に動かして気泡を取り除きます。 - 700A液体培地で満たされた2mLマイクロ遠心チューブを準備します。このチューブは、未熟な胚を収集するために使用されます。
- 耳を取り、無菌メスを使用して、胚乳を露出するカーネルクラウンの上部1〜2ミリメートルを削除します。マイクロヘラを使用して未熟な接合性胚(IZE)を除去します。このイゼープは、カーネル内、耳の先端に面した側、およびコブへのアタッチメントの近くに配置されます。ヘラを使用して、胚から最も遠い前の前皮の内精子に挿入し、その後、穏やかに上向きにねじって内精子を取り除き、胚を除去することを可能にする(図2)。
- ヘラを使用して、700A液体培地を含むチューブに胚を移す。最大100個の胚が収集されるまでこれを続けます。次のステップに進む前に、複数のチューブを充填(100個の胚/チューブ)することができます。この時点で、アグロバクテリウム懸濁液を調製する必要があります(ステップ3.5を参照)。
- 1 mLピペットで胚管から700A液体培地を取り出す。新鮮な700A培地を加えて胚を洗浄し、その培地も取り除きます。
- アグロバクテリウム懸濁液の1 mLとボルテックスを30sまたは反転チューブ12x-15xに低い設定(3/10)で加えます。このチューブをベンチで5分間水平に休ませてください。
- 5分後、胚のチューブ全体を、アグロバクテリウム懸濁液を562V共培養培地のプレートに移す(表1)。これは、ベンチにプレートを置き、プレートにチューブの内容物を素早く注ぐことによって達成することができます。プレートをそっと旋回して胚を分配し、1 mLピペットを使用してアグロバクテリウム懸濁液を取り除きます。
- 胚がスクステラム(丸い)側を上向きにして配置されていることを確認してください。必要に応じて、虫眼鏡または解剖スコープを使用します。プレートをプラスチック製の箱(19 cm x 28 cm x 5.1 cm)に入れ、暗闇の中で21°Cで16-18時間一晩プレートをインキュベートします。パラフィンフィルムまたはベントテープを使用した個々のプレートラッピングは必要ありません。
- 一晩共培養した後、感染した胚を、スクテルム側を上に移動し、休止培地605T(表1)に移動する。プレートあたり約30個の胚を配置します。暗い時に26-28 °Cでプレートをインキュベートします。
- 4〜10日間のインキュベート(7日間が好ましい)。このとき、体細胞性胚の発達は、接合性スクステラムの表面上で観察することができる(図3)。
5. 選択、熱処理、再生
- 休息期間の後、熱は胚に衝撃を与える。胚のプレートを入れた箱を、相対湿度70%の45°Cインキュベーターに2時間入れます。次いで、箱を45°Cインキュベーターから取り出し、1〜2時間の26-28°Cの暗いインキュベーターに入れる。
注:インキュベーターで湿度70%を達成できない場合は、箱の底にオートクレーブペーパータオルの二重層を追加し、箱の中の湿度を維持するためにオートクレーブ水で浸します。ペーパータオルの上の箱にプレートを戻し、45°Cに置く前に蓋を密封します。温度と湿度を監視するために小型のデジタル湿度計/温度計を使用してください。 - 0.05 mg/L イマザピルを選択的な薬剤として含む静止媒体(13329A)に熱処理されたIZEsを静止培地(13329A)に移す(表1)。転送する場合は、細かい先端鉗子または外科用はさみを使用して、存在する場合は、コレオプタイルを取り除きます。
- 過密を避けるために、プレートあたり10〜15個の胚を配置します。26°Cの暗いインキュベーターで2週間この培地に胚を保管してください。
- 胚を根付き培地(13158;13158;)表1)1-2週間。プレートあたり8個を置き、27 °Cでライトルームまたはライトチャンバー(16日/8泊、20-150 μmol/m2/s)にインキュベートします。
- 植物レットが発達するにつれて、芽と活発な根の両方を含むより強い植物レットを根付け培地の新しいプレートに置き、プレートごとに1つの植物を配置する。これにより、より強い植物レットの成長が可能になります。ライトルームまたはライトチャンバーにプレートを別の7〜14日間置きます。
メモ:植物レットに関連付けられているカルスを慎重に取り除き、メディアとの接触が良好であることを確認します。 - 植物がより活発になるにつれて、根を発する媒体から植物を取り出し、水道水で根をすすいで寒天を取り除きます。
- 個々の植物を2イン2(〜19cm2)の鉢内に3個移植し、あらかじめ湿潤した無地の基質を含む。鍋をトレイ(27 cm x 54 cm)に排水孔で置き、プラスチック製の湿度ドームで平らに覆います。この順応ステップは、上のセクション2(ステップ2.1)に記載の成長条件を有する成長チャンバーまたは温室のいずれかで達成することができる。
温室への移植とT1種子の生産
- 植物を1日2倍にチェックしてください。必要に応じて水。植物が乾燥したり、水やり過ぎされていないことを確認してください。わずかに乾燥した基質を維持することは根の成長を促す。
注:湿度ドームは、移植後4-7日を除去することができます。植物は、移植のストレスから土壌に目に見えて回復するまで、これらの小さな鉢で栽培する必要があります。これには約9〜14日かかります。 - 1.5 gal(5.9 L)ポットに全て無地のプラグとプラントレットを移植します。土壌が触れると乾燥していると感じたときに温室と水に維持します。
- N-P-K 15-9-12の制御放出肥料をポットに加え、基板ミックスに組み込んだり、表面に塗布することができます。
- 植物から耳の芽が出始めるときは、シュートバッグを使用して耳の芽を覆います。新しいシルクが袋を取り外さずに観察できるように、半透明のバッグを使用してください。シュートバッグは、制御された受粉が発生することを可能にします。常にトランスジェニック・タッセを袋に入れるのが重要です。
- シルクが出現した後(1〜2日)、出現したシルクを均一な長さにトリミングします。これは、殻の葉の上部の下に約2.5センチメートルになります。70%エタノールで殺菌された清潔なはさみのペアを使用してください。シルクをトリミングすることで、受粉が起こるために翌日に均一な房が発達する。
- トウモロコシの遺伝子型の大半の場合、受粉の最適な時間は、タッセやシルクの出現の2〜3日後です。
- 同じ植物(自己受粉されている場合)または同じ近交の野生タイプ(交差または交差している場合)のいずれかから花粉を収集します。
- 粉花粉を袋袋に入れ、T0植物の絹の房に塗ります。花粉が野生型(非トランスジェニック)植物の場合は、花粉を無地の茶色のカッセルバッグに入れます。花粉がトランスジェニック植物由来の場合は、花粉を緑色の縞模様の袋に入れ、花粉がトランスジェニックであることを示す。
- 受粉の詳細については、手順 2.5 から 2.10 に従います。
- 受粉後約2週間、耳からカッセルバッグを取り出し、ドライダウンを開始します。乾燥を助けるために、受粉後21〜25日後に植物に水をやめてください。また、種子を露出するために、殻の葉を引き戻すことができます。この実習は、カビを防ぐのにも役立ちます。
- 受粉後約45日後、種子を収穫し、4〜12°Cの低温貯蔵に貯蔵する。
Representative Results
ここで実証されたのは、トウモロコシ遺伝学の分野で重要であった3つの公共トウモロコシ近交系(B73、Mo17、およびW22)のアグロバクテリウム媒介遺伝変換のためのステップバイステップのプロトコルです。3つの近親線の変換は、従来のトウモロコシ変換プロトコル5を使用して達成できませんでした。図1と図2は、ここで使用される構成材料と出発材料をそれぞれ示しています。耳は一般的に受粉後9-12日後に収穫される。1.5 ~ 2.0 mm の範囲の長さの IZ は、このプロトコルの変換に最適なエクスプラントです (図 2)。
感染から8日後、ZsGreen-発現体細胞胚を蛍光顕微鏡のGFPチャネルで可視化した(図3)。感染したIZEsは、感染後8日後に熱処理を行った(ステップ5.1および5.2)。この治療は、2つのロクスプ部位の間に挟まれたBbm、Wus2、cre、及びZsGreen発現カセットを摘出するCREリコンビナーゼの発現を誘導した(図1)。 熱処理された組織は、形態素遺伝子除去後の形質転換組織の選択のために除草剤イマザピルを含む芽形成培地上で培養した。
イマザピルに耐性であった成熟胚または芽を有する増殖組織は、感染後3〜4週間前後で観察された(図4)。いくつかのイマザピル耐性組織はZsGreenに対して陰性であり、これらの組織でcre-媒介切除が起こりそうな可能性が示唆されている(図4)。組織を発根培地と光インキュベーションに移動した後、撃ち子が発達し始めた(図5)。よく発達した根を持つ健康で活発な成長の芽を収穫した(図5)。いくつかの組織は、複数の芽を持っているように見えました (図 5E,F,G).このタイプの「草むし」再生は、同一の遺伝子導入パターンを有するクローン植物に起因し得る。これらの植物を遺伝子型化するには分子生物学的分析が必要である。
3つのパブリック近親交配ラインはすべて、このプロトコルとこの作業で使用される構造を使用してうまく反応しました。W22は、イマザピル耐性芽の最も高い頻度を産生し、頻度は約14%(感染した100個の未熟胚あたり約14個のトランスジェニック芽)を有する。B73とMo17の両方が約4%のトランスジェニック芽を生成しました。これらの周波数は、形態形成遺伝子を運ぶ植物とCRE媒介性切除によって除去された形態形成遺伝子を有する植物の両方を含むすべてのトランスジェニック芽を示す。
図1:バイナリプラスミドPHP81430のT-DNA領域の概略図RB = 右 T-DNA 境界;loxP = CREリコンビナーゼターゲットサイト;Axig1プロ:Wus2 = トウモロコシオーキシン誘導プロモーター (Zm-Axig1) + Zm-Wus2 + トウモロコシIn2-1ターミネーター;Pltpプロ:Zm-Bbm = トウモロコシリン脂質トランスファーゼタンパク質 (Zm-Pltp) プロモーター + Zm-Bbm + 米T28ターミネーター (Os-T28);Hsppro:cre = トウモロコシ熱ショックタンパク質 17.7 プロモーター (Zm-Hsp17.7) + cre recombinase遺伝子 + ポテトプロテイナーゼ阻害剤 II (pinII) ターミネーター;ウビプロ:ZsGreen = ソルガムユビキチンプロモーター/イントロン (Sb-Ubi) + 緑色蛍光タンパク質ZsGreen遺伝子 + 米ユビキチンターミネーター (オス-Ubi);フラカセット = ソルガムアセトルラクターゼ合成酵素 (Sb-Als) プロモーター + トウモロコシフラ (Zm-Hra) 遺伝子 + pinIIターミネーター;LB = 左 T-DNA 境界;colE1,プラスミドの複製起源 ColE125;スペックR=菌選択のためのTn21からのスペクチノマイシン耐性遺伝子aadA1 26;Rep A,B,C =アグロバクテリウム・リゾゲネス27のpRiA4からの複製起源.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:出発資料B73耳は12日後の受粉後に収穫しました (A).B73 (B) 、 Mo17 (C) 、 W22 (D) の未熟な胚この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:感染後1週間の安静培地の組織発達胚(感染後8日)を蛍光顕微鏡下で(GFPフィルター)、Mo17(A)およびW22(B)の体細胞胚を発現するGFPを示す。明視野下で組織(B73)を開発する(C)およびGFPフィルター(D)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:選択を伴う成熟培地の組織の発達W22成熟プレート (A)明視野(B)およびGFPフィルター(C)の下で組織(Mo17、感染後15日間)を発症する。明視野(D)およびGFPフィルター(E)の下で組織(Mo17、感染後28日間)を発症する。矢印は、GFP発現を欠いている組織を再生することを指し、熱誘発CREタンパク質活性の後のloxP部位間のZsGreen遺伝子の切除を示唆している。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:根付きメディアの組織の発達W22 (A) 、 B73 (B) 、および Mo17 (C,D) のシュートB73 (E) と W22 (F,G) の複数のシュート (草の再生) を伴うイベント。B73(H)と W22 (I) のルーツを持つシュートこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表 1: トウモロコシ変換のためのメディアコンポジションこの表を表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
Discussion
トウモロコシ変換のための伝統的なプロトコルは、未熟な接合性胚を単離してトランスジェニックカルス組織を生成するというパラダイムに従い、これは肥沃な植物4、6に再生される。これは効果的ですが、カルスベースのプロトコルは時間がかかり、組織培養プロセスが植物を生産するのに最大3ヶ月かかることがよくあります。ここで提示された方法が重要なのは、コールスフリーで効率的で迅速であり、約半分の時間枠でT0植物の再生を可能にすることです。また、遺伝子型依存性が低いように見えるので、ほとんどの公的に入手可能な近親交配8,11に有効です。
すべての手順を効果的に実行する必要がありますが、成長メディアの正しい準備が不可欠です。成長培地成分は、植物材料が化学物質の適切な濃度を受け取ることを確実にするために、前と後の両方のオートクレーブの正しい段階で添加する必要があります。これは、抗生物質のような敏感な化合物が分解しないことを保証します。また、プロトコルに示すように、各段階で植物材料を正しい成長培地に配置することも重要です。適切な成長媒体に材料を置かないと、物質的な死を引き起こす可能性があります。さらに、あまりにも多くの胚を置くか、プレート上の組織を開発することは避けるべきです。2倍の組織片を置くことは、化学物質やペトリ皿(さらにはインキュベータースペース)のコストを節約することができますが、過密プレート内の組織の成長は深刻に阻害される可能性があります。感染を行う間、アグロバクテリウム懸濁液の光学密度が適切であることを保証すべきである。細菌懸濁液密度が低すぎると、適切な感染が起こらない可能性があります。
出発材料の品質は、変換プロトコルの成功に不可欠です。胚解剖に使用される耳は健康でなければならず、それらを産生する植物は健康であることを意味する。彼らはまた、適切な種子セットを所有し、害虫や無病でなければなりません。また、古いアグロバクテリウムは使用しないでください。「母」プレートは生後2週間以下でなければなりません。この時点で、新しい実験を開始するために、新しい「母」プレートをストリークする必要があります。
この方法は、より少ない遺伝子型依存であることが示されているが、すべての行が等しく成功するとは考えられない。使用されているコンストラクトに基づく成功の違いだけでなく、ライン間の変動が依然として存在する可能性があります。未熟な胚を扱う場合、耳から耳への変動も避けられないので、理想的には複数の耳を使ってこれを考慮する必要があります。この研究では、近交配W22が最高のパフォーマンスを発揮し、〜14%以上の変換頻度で、次いでB73とMo17(各約4%)が続いた。Loweら8は、B73およびMo17変換のためのクイックコーンプロトコルを使用して報告した。この作業では、変換周波数はB73の場合は9%から50%、Mo17では15%~35%の範囲でした。
この研究で観察されたB73およびMo17の低い変換周波数の1つの可能性は、季節的な耳の品質変動に起因する可能性がある。Loweら8のこの作品との違いは、ここで異なるベクトル構築物が使用された点です。ロウの研究では、形態素遺伝子は形質転換された植物から取り除かれたのではなく、後の段階で発達的に沈黙した。この研究では、形態素遺伝子は感染後8日後に除去された。B73とMo17は、体細胞胚の発生のためにBbm / Wus2のより長い存在を必要とする可能性があります。
この方法を用いて、非トランスジェニックエスケープ植物、多量体挿入、および非興奮性トランスジーンを得る可能性がある。これらの植物は顕著に異なる表現型を有しないので、PCRによる検出は、植物がトランスジェニックであるかどうかを判断するために必要とされます。これを達成するために、切除領域内のPCRプライマーおよび切除領域に隣接するプライマーを採用することができる。複数の独立した形質転換は、同じ未熟な胚から植物を産生することもできるので、全独立形変容体の回復速度の決定は困難である。私たちの基準は、植物を生産した各未熟胚から1つの植物をサンプリングし、これを感染した胚の数で割ることに基づいて形質転換率を計算することでした。この方法は、プラントレットとして回収された独立したイベントの実際の数をほぼ確実に過小評価しています。同じ胚からの独立した事象間の差別は、トランスジーンの周りの境界領域をシーケンシングする必要があり、これはほとんどのアプリケーションにとって非常に高価で時間がかかります。ただし、これらのデータが役立つ場合もあります。
この組織培養変換の方法は非常に有効であることが証明されていますが、問題は依然として発生する可能性があります。植物材料が応答しない場合、特定の近交線に問題がある可能性があり、成長培地組成やサブカルリングのタイミングなどの変数が調整を必要とすることを示唆している。元のベクトルが変更された場合、もう一つの変数は、適切なベクトル設計と正確なベクトル構築です。いくつかのラインは他のものよりも敏感であり、イマザピルの濃度は正常に形質転換された植物を達成するために調整する必要があるかもしれないので、イマザピル感受性にも問題があるかもしれません。
過去30年間で、トウモロコシ組織培養および形質転換プロトコルは変化し、進歩してきました。この短縮されたプロトコルは、この進行をさらに進めると考えられています。この方法は、従来の方法よりも時間がかからず、学術的な設定に有効です。また、高度な訓練を受けたオペレータを要求しないため、従来の方法と比較して広範囲に分布することがより適しています。今後、この方法はゲノム工学などの新しい技術と組み合わせることができます。
Disclosures
アリシア・マスターズ、ウィリアム・ゴードン・カム、トッド・ジョーンズは、この記事で使用されているB73、Mo17、およびW22のプロトコルとトウモロコシの耳を提供したコルテバ・アグリサイエンスの従業員です。著者のミンジョン・カン、モーガン・マッコー、ジェイコブ・ゾブリスト、カン・ワンは何も開示していない。
Acknowledgments
私たちは、トウモロコシの未熟な耳を提供してくれたコルテバ温室チーム、メディアを作るための支援を提供するためのコルテバメディア準備ラボ、アグロバクテリウム構造の助けを求めてコルテバからニンワン、アイオワ州立大学のキューサブ・リーに支援を提供してくれたことに感謝します。このプロジェクトは、国立科学財団植物ゲノム研究プログラムがK.W.に1725122と1917138を与え、予測植物フェノミクス研究研修プログラム(国立科学財団グラントDGE-1545453)からJ.Z #IOW04341.に部分的に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4-D | Millipore Sigma | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (BAP) | Millipore Sigma | B3408 | |
| Acetosyringone | Millipore Sigma | D134406 | |
| Agar | Millipore Sigma | A7921 | |
| Aluminum foil | To cover the flask | ||
| Ammonium Sulfate | Millipore Sigma | A4418 | |
| Analytical balance | To weigh small quantities of chemicals | ||
| Autocalve | Primus (Omaha, NE) | PSS5-K | To autoclave media and tools |
| Bacterial culture loop (10 µl) | Fisher scientific | 22-363-597 | Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid |
| Bactoagar | BD bioscience | 214030 | |
| Beakers (1 L, 2 L, 4 L) | To mix the chemicals for media | ||
| Benomyl | Millipore Sigma | #45339 | |
| Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite) | Clorox | For seed sterilization | |
| Boric Acid | Millipore Sigma | B6768 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | |
| Carbenicillin | Millipore Sigma | C3416 | |
| Casein Hydrolysate | Phytotech | C184 | |
| Cefotaxime | Phytotech | C380 | |
| Conical tube (50 mL) | Fisher scientific | 06-443-19 | Contain liquid medium and Agro suspension |
| Cuvette (Semi-micro) | Fisher scientific | 14955127 | To hold liquid for measuring OD |
| Dicamba | Phytotech | D159 | |
| Digital hygrometer | Checking temperature and humidity for heat treatment | ||
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Millipore Sigma | 324503 | |
| Eppendorf tube (2.0 mL) | ThermoFischer Scientific | AM12475 | |
| Eriksson's Vitamins | Phytotech | E330 | 1000x in liquid |
| Ethanol (70%) | Sterilizing tools and surfaces | ||
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | F8263 | |
| Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12 | ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH) | A903206 | Fertilizer |
| Flask (2 L) | Pyrex | 10-090E | To autoclave media and tools |
| Flats (Standard 1020, open w/holes, 11"W x 21.37"L x 2.44"D) | Hummert International (Earth City, Mo) | 11300000 | Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome |
| Forceps (fine-tipped and large) | Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders | ||
| Gentamicin | Gold Biotechnologies | G-400 | |
| Glass bottle (1 L) | Pyrex | 06-414-1D | To autoclave medium |
| Graduated cylinder | To adjust volume of media | ||
| Imazapyr | Millipore Sigma | 37877 | |
| Incubator, 20 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection |
| Incubator, 27 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow co-cultivation plate and maize embryo culture |
| Incubator, 45 °C | Heat shock treatment | ||
| Insert TO Standard, pots | Hummert International (Earth City, Mo) | 11030000 | For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome |
| Laminar flow hood | Maintains sterile conditions | ||
| L-proline | Phytotech | P698 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | M1880 | |
| Maize inbred seed B73 | U.S National Plant Germplasm | id=47638 | |
| Maize inbred seed Mo17 | U.S National Plant Germplasm | id=15785 | |
| Maize inbred seed W22 | U.S National Plant Germplasm | id=61755 | |
| Manganese Sulfate Monohydrate | Millipore Sigma | M7899 | |
| Milli-Q Water purification systems | Millipore sigma | MILLIQ | For tissue culture grade water |
| MS Basal Medium | Millipore Sigma | M5519 | |
| MS Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | M5524 | |
| N6 Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | C1416 | |
| Paperclips, non-skid | Holding on tassel bags | ||
| Peptone | BD bioscience | 211677 | |
| Petri dish (100x15 mm) | Fisher scientific | FB0875713 | For bacteria culture medium |
| Petri dish (100x25 mm) | Fisher scientific | FB0875711 | For the plant tissue culture medium |
| pH meter | Fisher scientific | AB150 | To adjust pH of media |
| Pipette (1 mL) | ThermoFischer Scientific | 4641100N | |
| Plastic Boxes | The Container Store | 10048430 | For tissue culture storage and incubation |
| Plastic humidy dome (Humi-Dome) | Hummert International (Earth City, Mo) | 14385100 | Plastic cover for soil flat |
| Potassium Iodide | Millipore Sigma | 793582 | |
| Potassium Nitrate | Millipore Sigma | P8291 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Millipore Sigma | P5655 | |
| Scale | To weigh chemicals for media | ||
| Scalpel Blade (No. 11, 4 cm) | Thermo Scientific | 3120030 | remove the top of the kernel crowns for embryo dissection |
| Scalpel handle | Holding scalpel blades | ||
| Schenk & Hildebrandt Vitamin (S&H vitamin) | Phytotech | S826 | 100x powder |
| Scissors | Cutting ear shoots | ||
| Shoot bag (Canvasback- semi-transparent) | Seedburo (Des Plaines, IL) | S26 | Semi-transparent bag to cover ear shoots |
| Silver Nitrate | Millipore Sigma | S7276 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate | Millipore Sigma | M1651 | |
| Soiless substrate LC1 | SunGro Horticulture (Agawam, Ma) | #521 | For growing maize plants |
| Spatula (Double Ended Micro-Tapered) | Fischer Scientific | 2140110 | Dissecting embryos from kernels |
| Spatula (with spoon) | Fisher scientific | 14-375-10 | To measure chemicals for media |
| Spectinomycin | Millipore Sigma | S4014 | |
| Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis) | Thermo Scientific | 840-300000 | Measure OD of Agro suspension |
| Stirring bar | Fisher scientific | 14-513-67 | To mix media |
| Stirring hotplates | To mix media | ||
| Syringe (without needle, 60 mL) | Fisher scientific | 14-823-43 | For filter sterilization |
| Syringe filter (0.22 µm) | Fisher scientific | 09-720-004 | For filter sterilization |
| Tassel bag (Canvasback- brown) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514 | Bag to cover tassels of non-transgenic plants |
| Tassel bag (Canvasback-green stripe) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514G | Bag to cover tassels of transgenic plants |
| Thiamine HCl | Phytotech | T390 | |
| Thidiazuron | Phytotech | T888 | |
| Thymidine | Millipore Sigma | T1895 | |
| Timentin | Phytotech | T869 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | Cas #9005-64-5 | surfactant |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI0236 | Homogenizes liquids (Agro suspension) |
| Water bath (large - Precision model 186) | Fisher scientific | any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 °C | Keeps autoclaved media at optimal temperature |
| Weigh dish | Fisher scientific | 08-732-112 | To measure chemicals for media |
| Weighing paper | Fisher scientific | 09-898-12A | To measure chemicals for media |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP14222 | |
| Zeatin | Millipore Sigma | Z0164 |
References
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