Summary
Presentato qui è un protocollo per stabilire infarto pontino acuto in un modello di ratto tramite stimolazione elettrica con un singolo impulso.
Abstract
L'infarto pontino è il sottotipo di ictus più comune nella circolazione posteriore, mentre manca un modello di roditore che imita l'infarto pontino. Fornito qui è un protocollo per stabilire con successo un modello di ratto di infarto pontino acuto. Vengono utilizzati ratti di circa 250 g, e una sonda con una fazza isolante viene iniettata nei pons utilizzando un apparato stereotassico. Una lesione è prodotta dalla stimolazione elettrica con un singolo impulso. Il punteggio Longa, il punteggio di Berderson e il test di equilibrio del fascio vengono utilizzati per valutare i deficit neurologici. Inoltre, il test somatosensoriale di rimozione adesivo viene utilizzato per determinare la funzione sensomotoria e il test di posizionamento degli arti viene utilizzato per valutare la propriocezione. Le scansioni MRI vengono quindi utilizzate per valutare l'infarto in vivo, e la colorazione TTC viene utilizzata per confermare l'infarto in vitro. Qui, viene identificato un infarto di successo che si trova nella base anterolaterale dei pons rostrali. In conclusione, viene descritto un nuovo metodo per stabilire un modello di ratto infarto pontino acuto.
Introduction
A partire dagli anni '80, il modello di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) indotta dai filamenti in silicone è stato ampiamente utilizzato nella ricerca sull'ictusdi base 1. Sono stati utilizzati anche altri metodi (ad esempio, la sutura di un ramo dell'MCA2 e l'infarto focale indotta fotochimicamente). Questi modelli sono stati definizione modelli di ictus basati su MCA e hanno contribuito notevolmente alle indagini sui meccanismi patofsiologici alla base dell'ictus e delle potenziali terapie. Anche se ci sono limitazioni di questi modelli sperimentali3,4, questi metodi sono stati utilizzati molti laboratori5,6. I modelli di tratto basati su MCA rappresentano un tratto nella circolazione anteriore; tuttavia, pochi rapporti hanno studiato modelli che imitano l'ictus nella circolazione posteriore7.
Ci sono differenze significative tra l'eziologia, i meccanismi, la manifestazione clinica e la prognosi tra i colpi di circolazione anteriore e posteriore8. Pertanto, i risultati derivati dai modelli di tratto di circolazione anteriore non possono essere applicati al tratto di circolazione posteriore. Ad esempio, l'intervallo di tempo di reperfusione per la circolazione anteriore è stato esteso a 6 h, con una piccola porzione di studi che si estende a 24 h sulla base dei risultati dell'imaging9. Tuttavia, la finestra di tempo per la circolazione posteriore può essere più lunga di 24 h, secondo i rapportiprecedenti 10 e le nostre esperienze cliniche. Questa finestra di tempo di reperfusione allungata deve essere ulteriormente studiata e confermata nei modelli sperimentali.
Per quanto riguarda i colpi di circolazione posteriore, l'infarto pontino è il sottotipo più comune, che rappresenta il 7% di tutti i casi di ictus ischemico11,12. Secondo la topografia dell'infarto, gli infarti pontini sono divisi in infarti pontini isolati e non isolati13. Gli infarti pontini isolati sono classificati in tre tipi in base ai meccanismi sottostanti: grande malattia dell'arteria (LAD), malattia del ramo dell'arteria basilare (BABD) e malattia dell'arteria piccola (SAD). La conoscenza dei meccanismi, della manifestazione e della prognosi dell'infarto pontino è stata ricavata da indagini cliniche sui casi14. Tuttavia, un modello di roditore che imita l'infarto pontino è stato meno studiato.
In studi precedenti, è stata esplorata la lesione diffusa del tegmentum del tronco encefalico che coinvolge i pons7. Un gruppo ha tentato di creare un modello di infarto pontino tramite la legatura dell'arteria basilare (BA)15. Un altro gruppo ha usato una sutura monofilamento in nylon 10-0 per legare selettivamente quattro punti della BA prossimale selettivamente16. Questo modello imita LAD, ma la maggior parte degli infarti pontini derivano da BABD e SAD. Inoltre, la legatura selettiva del BA è un intervento chirurgico complicato e ha un alto tasso di mortalità.
Fornito qui è un protocollo dettagliato per un modello di ratto facile da eseguire, facilmente riprodotto e di successo di infarto pontino acuto da stimolazione elettrica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Il protocollo è stato esaminato e approvato dall'Institution Animal Care and Use Committee del Secondo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina di Guangzhou, un'istituzione accreditata da AAALACi. I ratti sono stati forniti dall'Animal Center della Southern Medical University.
1. Animale
- Utilizzare ratti maschi adulti Sprague-Dawley del peso di 250 x 10 g.
- Al momento del trasporto, ospitare i ratti per almeno 1 settimana prima dell'intervento chirurgico in condizioni ambientali controllate con una temperatura ambiente di 25 gradi centigradi, umidità relativa del 65% e 12 h/12 h di luce/scuro ciclo.
- Fornire cibo e acqua al libitum.
2. Istituzione dell'infarto nei pons
- Pesare i ratti prima dell'intervento chirurgico e valutare le prestazioni neurologiche in base ai test comportamentali descritti di seguito (sezione 3).
- Preriscaldare il riscaldamento immediatamente prima dell'anestesia.
- Attaccare il trapano del cranio al supporto sul telaio stereotassico.
- Iniettare intraperitonealmente i ratti con 50 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg di xylazina. Verificare la mancanza di risposta alla dita dei piedi.
- Montare il ratto sul telaio stereotassico in posizione prona. Posizionare le barre dell'orecchio sopra il canale uditivo per fissare la testa. Assicurarsi che il cranio sia mantenuto orizzontale per evitare qualsiasi inclinazione dell'iniezione.
- Mantenere l'anestesia da isoflurane (100% ossigeno, 2,5% isoflurane) tramite un attacco cono naso stereotassico per ratti con porte di ingresso e di uscita. Mantenere la temperatura a 37 gradi centigradi utilizzando un tampone di riscaldamento e monitorare la temperatura durante tutta la procedura.
- Utilizzare l'unguento oculari per prevenire l'essiccazione corneale. Utilizzare le forcepi per pizzicare leggermente le zampe per garantire che non ci sia risposta al dolore.
- Rasa i capelli del cranio con un micro-rasoio. Applicare lo scrub chirurgico di clorexidina in modo circolare a partire dal sito di incisione chirurgica e ruotando verso l'esterno.
- Fare un'incisione midline di 3 cm con un bisturi dalla linea del canthus bilaterale a 0,5 cm dietro la fontanella posteriore, che dovrebbe essere contrassegnata da una penna marker chirurgica.
- Utilizzare un tampone di cotone per rimuovere un sangue.
- Posizionare un pezzo di nastro chirurgico posto su ciascun lato del lembo della pelle per esporre il cuoio capelluto (Figura 1).
- Rimuovere delicatamente i tessuti connettivi dall'osso crano con un tampone di cotone immerso in 0.9% NaCl. Se non rimossi, i tessuti connettivi saranno catturati nel trapano.
- Identificare il bregma. Scegli il punto centrale del bregma come punto di origine e segnalo usando una penna pennarello chirurgico nera a punta fine.
- Posizionare un trapano a 6,0 mm AP, 2,0 mm ML (intervallo da 0,5 a 3,0 mm, figura 2A).
- Eseguire craniotomia (diametro 1 mm) utilizzando un trapano automatico. Procedere con attenzione, perché questo punto è vicino al seno venoso.
- Rimuovere il trapano dal telaio stereotassico.
- Posizionare una sonda da 22 G con una levatura isolata nel telaio stereotassico (Figura 3A). La punta della sonda deve essere posizionata 2 mm sopra l'estremità prossimale della fadera (Figura 3A,B; Figura 2B).
- Assicurarsi che la fadetta entri nel cervello 7 mm (7 mm DV, Figura 2B; Figura 1C).
- Far avanzare la sonda lungo la fava(Figura 1D) fino a quando la punta della sonda è 9 mm sotto la superficie del cervello (Figura 2D).
- Collegare gli elettrodi a uno stimolatore elettrico (Figura 3C). Collegare l'anodo alla sonda come illustrato nella figura 1D. Collegare il catodo ai ratti (di solito all'orecchio dei ratti).
- Accendere lo stimolatore elettrico e impostare i seguenti parametri: larghezza dell'impulso singolo - 4.050 ms; tensione di tensione 50 V; e corrente : 4 mA (Figura 3C). Durante la stimolazione elettrica, il ratto mostrerà tremante. In questo studio, il dispositivo non è stato acceso per i ratti del gruppo di controllo utilizzati per i test comportamentali, la risonanza magnetica e il TTC.
- Lasciare la sonda in posizione per 5 minuti dopo la stimolazione.
- Rimuovere la sonda dal cervello (Figura 1F).
- Utilizzare il cemento osseo per coprire la craniotomia. Lasciare asciugare il cemento prima della sutura della ferita.
- Suturare la ferita con filamenti di sutura in poliammide 4-0. Dopo tre o quattro stiches, legare 2-1-1 nodi chirurgici standard.
- Iniettare i ratti con penicillina (0,25 mL, 80 IU diluito in 4 mL di salina) intraperitonealmente per prevenire l'infezione.
- Iniettare i ratti sottocutaneamente con meloxicam ad una dose di 2 mg/kg e poi ripeterlo ogni 24 h.
- Monitorare i ratti ogni 15 minuti fino a quando completamente sveglio e restituirli alla gabbia con un pad di riscaldamento. Fornire libero accesso al cibo e all'acqua fino al sacrificio.
NOTA: Tutte le procedure devono seguire i principi chirurgici asettici. Prima dell'intervento, indossare un scrub top, maschera chirurgica e guanti sterili dopo uno scrub chirurgico di mani. Mantenere sempre il materiale di sutura sterile all'interno del campo sterile.
3. Test comportamentali
- Punteggio Longa17
- Posizionare i ratti sulla superficie del tavolo.
- Registrare i punteggi come segue: 0 - nessun deficit neurologico; 1 - mancata estensione totale del prepestare contralaterale, un lieve deficit neurologico focale; 2 - girando verso sinistra, un deficit neurologico focale moderato; 3 - caduta a sinistra, un grave deficit focale; 4 - nessun camminare spontaneo e un livello depresso di coscienza.
- Berderson segna18
- Tenere il topo per la coda e lasciare che gli arti anteriori raggiungere per un tavolo. Registrare i punteggi come segue: 0 - entrambi gli arti hanno raggiunto la tabella; 1 - solo un arto raggiunge il tavolo.
- Posizionare l'animale su una superficie ruvida. Registrare i punteggi come segue: 0 - una forte presa sulla superficie ruvida con buona resistenza quando spinto; 1 - una leggera resistenza osservata solo in una zampa; 2 - nessuna resistenza quando spinto in una direzione.
- Collocare il ratto in un'area chiusa (18 in 36 dollari) e permettergli di vagare liberamente. Registrare i punteggi come segue: 0 : camminare per l'intera lunghezza del recinto senza girare; 1 - camminare per tutta la lunghezza del recinto con il cerchio; 2 - non può camminare per tutta la lunghezza del recinto, ma può cerchiare; 3 - non può muoversi molto. Utilizzare la somma dei punteggi di valutazione di ogni attività come punteggio di valutazione finale.
- Test del fasciodi equilibrio 19
- Assicurarsi che l'apparecchio sia costituito da un fascio di 3 cm di larghezza e 70 cm di lunghezza e di 20 cm sopra il pavimento. Posizionare una casella oscurata all'estremità della trave con un ingresso stretto.
- Posizionare un generatore di rumore bianco e una sorgente luminosa all'inizio del fascio. Il rumore e la luce sono stati utilizzati per motivare il ratto ad attraversare il fascio ed entrare nella casella della meta.
- Terminare gli stimoli quando gli animali entrano nella scatola oscurata. Registrare la latenza per raggiungere la casella dell'obiettivo (in secondi) e le prestazioni di hindlimb del ratto quando si attraversa il fascio.
- Registrare i punteggi per ogni performance come segue: 0 - saldi con postura costante; 1 - afferra il lato del fascio; 2 - abbracci fascio e 1 arto cade dal fascio; 3 - abbracci fascio e due arti cadono di fascio, o gira sulla trave dopo >60 s; 4 - tenta di bilanciare sulla trave, ma cade dopo >40 s; 5 - tenta di bilanciare sulla trave, ma cade dopo >20 s; e 6 - cade, nessun tentativo di equilibrio o appendere sulla trave dopo <20 s.
- Rimozione adesivo test somatosensoriale20
- Mettere i ratti in una scatola di plexiglass chiara e consentire loro di esplorare il nuovo ambiente per 2 o 3 minuti.
- Posizionare un'etichetta adesivo di colore verde di 10 mm sulla superficie interna di ogni preafficolta' sopra il pollice e sul polso.
- Riportare i ratti nella scatola di plexiglass.
- Registrare il tempo per il ratto per rimuovere la prima etichetta e tutte le altre etichette, rispettivamente. Lasciare un massimo di 3 min. Il test deve essere condotto 2 volte in allenamento.
- Test di posizionamento degli arti
- Tenere i ratti in posizione orizzontale e prevenire il movimento.
- Una volta che il ratto perde il contatto con la superficie del tavolo (movimento passivo degli arti), applicare stimoli tattili e propriocettivi alla zampa con il bordo del tavolo.
- Valutare il posizionamento della zampa (successo o fallimento) sul bordo del tavolo.
- Registrare i punteggi come segue: 0 - nessun posizionamento; 0,5 - posizionamento incompiuto e/o ritardato; 1 - posizionamento immediato e completo.
4. Conferma infartata tramite risonanza magnetica
- Eseguire la risonanza magnetica 24 h dopo l'intervento chirurgico.
- Anestesizzare il ratto da isoflurane (5% per l'induzione, 1%–1,5% per manutenzione).
- Fissare la testa del ratto in una bobina di matrice di cervello ratto e combinato con una bobina di volume solo trasmissione.
- Posizionare la bobina e il ratto nello scanner MRI. Fissare il ratto all'interno della culla utilizzando le barre dei denti e delle orecchie.
- Mantenere la temperatura corporea a 37 gradi centigradi durante la procedura di scansione MRe utilizzando una giacca termica a circuito chiuso.
- Utilizzare una sequenza pilota per garantire la corretta geometria.
- Raccogliere scansioni ponderate T2 utilizzando una sequenza di eco a rotazione rapida: tempo eco (TE) - 33 ms; tempo di ripetizione (TR) - 8.000 ms; campo di visualizzazione: 30 mm x 30 mm; matrice di acquisizione: 512 x 512; 50 fette; Spessore di 0,4 mm.
- Raccogliere un quattro colpi spin-echo planar imaging scansioni DWI: tempo eco - 30,5 ms; tempo di ripetizione : 8000 ms; matrice : 96 x 96; campo di vista: 25 mm x 25 mm; tre direzioni: x, y, z; Valori B: 0 1.000 s/mm2 e 1.000 s/mm2; 50 fette assiali contigue; Spessore di 0,4 mm.
- Riportare i topi nella gabbia.
5. Conferma infartata con colorazione TTC
- Sacrificare i ratti al punto di tempo secondo il progetto sperimentale. In questo esperimento, abbiamo sacrificato i ratti 24 ore dopo l'intervento chirurgico.
- Preparare una soluzione TTC del 2% prima del sacrificio. Aggiungere 0,2 g di polvere TTC al PBS da 10 mL 0,01 M (pH 7.4). Trasferire la diluizione in un piatto di 10 cm coperto di carta d'argento e preriwarmed a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua.
- Esporre il ratto al 5% isoflurane fino alla perdita di coscienza. Quindi, esporre il ratto a CO2 (20%-30% del volume della gabbia per min) fino a quando la respirazione non si è fermata, quindi mantenere 2 minuti di esposizione a CO2.
- Utilizzare i seguenti segni per confermare la morte: nessun aumento e caduta del torace, nessun battito cardiaco palpabile, scarso colore della membrana mucosa, nessuna risposta al pizzico di piedi, cambiamento di colore o opacità negli occhi.
- Eseguire lussazione cervicale.
- Fissare gli animali registrando le zampe su una piattaforma sterile. Creare un'incisione della linea mediana dalla clavicola all'ipogastrium e un'incisione laterale dallo xifoide a sinistra lungo la gabbia toracica. Fare un taglio nel diaframma anche lungo la gabbia toracica e un'incisione della linea mediana torace per esporre il cuore.
- Collegare la punta di un ago (27 G) a una pompa perfusione contenente 0,01 M PBS a 4 gradi centigradi nel ventricolo sinistro.
NOTA: Far avanzare la punta lungo il bordo sinistro del ventricolo per evitare di entrare nell'atrio. Accendere la pompa di perfusione per assicurarsi che la punta si trova nel ventricolo sinistro e tagliare l'atrio destro. Se il fluido fuoriescono dalla narice, la punta si trova nell'atrio e deve essere regolata o reinserta. - Utilizzare circa 100 mL di 0,01 M PBS, mantenuti a 4 gradi centigradi per la perfusione. Spegnere la pompa di perfusione fino a quando il fegato diventa bianco.
- Decapitare i ratti e sezionare l'intero cervello usando le forbici e le forbici. Rimuovere l'acqua dalla superficie del cervello con carta gonfiante.
- Conservare l'intero cervello a -80 gradi centigradi per 1 min (tagliare le sezioni del cervello è più facile dopo il congelamento).
NOTA: Questo passaggio può essere saltato se le sezioni cerebrali possono essere tagliate bene senza congelamento. - Posizionare il cervello nella matrice con il lato dorsale verso l'alto.
- Identificare il foro nella superficie del cervello come mostrato nella figura 1G e inserire una lama spessa 0,21 mm in acciaio inossidabile. Di solito, la più grande area di infarto è nel piano della sonda; quindi, una lama deve essere inserita in questa regione.
- Inserire le altre lame a un intervallo di 2 mm.
- Rimuovere contemporaneamente le lame, tutto in una volta, dalla matrice e posizionare l'intero cervello con le lame nella soluzione TTC nel piatto. Rimuovere le lame con attenzione.
NOTA: Qui, le sezioni cerebrali non sono state facilmente rimosse dal liquido perché alcuni pia mater residui nella base cranii interferito con la sezionazione. Se alcune sezioni rimangono nella matrice, utilizzare una piccola spatola per trasferirle nel piatto. - Mettere il piatto con la soluzione TTC e le sezioni cerebrali in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
- Controllare il piatto ogni 5 minuti e assicurarsi che nessuna sovrapposizione di sezioni.
- Aggiungere 10 mL di soluzione paraformaldeide del 4% al piatto per terminare la reazione TTC.
- Orientare le sezioni dal rostrale al caudal e scattare foto.
6. Statistiche
- Utilizzare un software di analisi statistica (ad esempio, GraphPad Prism) per eseguire un test t diStudent.
NOTA: tutti i dati sono espressi come media: SE. Le differenze tra i gruppi vengono determinate con i test t diStudent a due code (p < 0,05 definiti come significatività statistica).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sei animali sono stati sottoposti al protocollo chirurgico descritto sopra. Il gruppo di controllo, come illustrato nella Figura 4, consisteva di sei ratti. Le fette di cervello mostrate nella Figura 4 sono state derivate da un ratto per gruppo.
La risonanza magnetica ha mostrato che l'infarto si trovava nella base dei pons (Figura 4A). Dal momento che la sonda è stata iniettata 2 mm a sinistra della linea mediana, l'infarto è stato localizzato lateralmente. Questo infarto imita gli infarti pontini anterolaterali nei pazienti (Figura 4A). Poiché è stata utilizzata una frena isolata, non c'era nessun infarto oltre la punta della sonda, compresa la corteccia, il cervelletto e il midbrain (Figura 4A). Le immagini DWI hanno anche rivelato l'infarto pontino acuto (Figura 4A).
La colorazione TTC è stata utilizzata per confermare l'infarto 24 h post-chirurgia (Figura 4A). Rispetto al gruppo di controllo, il volume di infarto è stato significativamente più elevato (Figura 4B).
I punteggi comportamentali sono stati misurati prima e dopo l'intervento chirurgico. I punteggi per i gruppi di modelli di controllo e infratta prima e dopo l'intervento chirurgico sono presentati nella tabella 1. A causa della mancanza di uno specifico test comportamentale progettato per l'infarto pontino, il punteggio di Longa, il punteggio di Berderson e il test del fascio di equilibrio sono stati utilizzati per valutare i deficit neurologici. Inoltre, il test somatosensoriale di rimozione adesivo per valutare la funzione sensomotoria e il test di posizionamento degli arti per valutare la propriocezione.
Rispetto al gruppo di controllo, i ratti con infarto pontino cerchiato a sinistra (Figura 4A). Si sono verificate differenze significative nel punteggio di Longa (2,67 x 0,52 contro 0,0, p < 0,05, figura 4C), punteggio di Berderson (2,67 x 0,52 vs. 0, p < 0,05, figura 4D ), test di posizionamento degli arti (4,67 x 0,52 vs. 0, p < 0,05, Figura 4D ), test di posizionamento degli arti (4,67 x 0,52 vs. 0, p < 0,05, Figura 4D), test di posizionamento degli arti (4,67 x 0,52 vs. 0,05, Figura 4E), punteggio di prova del bilanciamento del fascio (118,33 x 2,66 contro 10,17 x 1,47, p < 0,05, Figura 4F) e adesivo Punteggio di prova somatosensoriale di rimozione (2,33 x 0,52 contro 12,0 x 0, p < 0,05, Figura 4G) tra ratti con infarto pontino e ratti di gruppo di controllo.
Figura 1: Stabilimento dell'infarto. (A) Un buco fatto nel cranio. (B) La fante viene spostata nel foro. (C) Iniezione della fasa. (D) Iniezione della sonda. (E) L'anodo (freccia rossa) è collegato. (F) La sonda viene rimossa. (G) Foro (freccia rossa) a sinistra nella superficie del cervello. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Figura 2: Posizione della sonda. (A) Diagramma schematico delle posizioni stereotassiche: le frecce puntano alla retrazione dei lembi della pelle, al sito di Bregma e al posizionamento del trapano. (B) Diagramma schematico della sheath e della sonda. (C) Posizione della punta di labiana posta nei pons. (D) Posizione della punta della sonda posta nei pons. (E) Progettazione sperimentale. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Figura 3: Dispositivo che produce lesioni. (A) Separato di sheath e sonda. (B) La sonda nella fa pagina. (C) L'elettrodo blu era un anodo collegato alla sonda caudale; l'elettrodo rosso era catodo. (D) Stimolatore elettrico. (E) Strumenti chirurgici. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Figura 4: Risultati dei rappresentanti. (A) L'infarto è stato valutato dalla risonanza magnetica con sequenza T2 e DWI in vivo ed è stato confermato dalla colorazione TTC in vitro 24 h dopo l'intervento chirurgico. Infarto pontino acuto situato nella destra pons anterolaterale (linea tratteggiata). Il test comportamentale ha mostrato che il ratto girava verso il lato contralaterale della lesione. (B) Il volume dell'infarto. (C) Punteggio lungo. (D) Punteggio Bederson. (E) Test di posizionamento degli arti. (F )Test di camminata del fascio di equilibrio. (G) Rimozione adesivo test somatosensoriale. Le barre rappresentano la media: SD (p < 0,05 rispetto al gruppo di controllo). Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Figura S1: Infarto di Lacunar nei pons. La lunghezza della punta della sonda si sta accorciando. La risonanza magnetica mostra un infarto lacunar nei pons giusti. (A) Immagine T2. (B) Immagine DWI. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
| Ratto NO | Punteggio Longa | Punteggio Berderson | Test del fascio di equilibrio | Test somatosensoriale di rimozione adesivo | Test di posizionamento degli arti | |||||
| Pre | Post-chirurgia | Pre | Post-chirurgia | Pre | Post-chirurgia | Pre | Post-chirurgia | Pre | Post-chirurgia | |
| Infarto pontino 1 | 0 | 3 | 0 | 2 | 0 | 5 | 6 | 120 | 12 | 2 |
| Infarto pontino 2 | 0 | 2 | 0 | 3 | 0 | 4 | 8 | 120 | 12 | 3 |
| Infarto pontino 3 | 0 | 3 | 0 | 3 | 0 | 5 | 8 | 116 | 12 | 2 |
| Infarto pontino 4 | 0 | 3 | 0 | 3 | 0 | 4 | 6 | 120 | 12 | 2 |
| Infarto pontino 5 | 0 | 3 | 0 | 2 | 0 | 5 | 7 | 114 | 12 | 2 |
| Infarto pontino 6 | 0 | 2 | 0 | 3 | 0 | 5 | 7 | 120 | 12 | 3 |
| Controllo 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| Controllo 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 10 | 12 | 12 |
| Controllo 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10 | 8 | 12 | 12 |
| Controllo 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7 | 11 | 12 | 12 |
| Controllo 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 9 | 12 | 12 |
| Controllo 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 12 | 12 | 12 |
Tabella 1: Punteggi comportamentali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il presente studio fornisce un protocollo per la generazione di un modello di ratto infarto pontino acuto. Questo modello può essere utilizzato per la ricerca sulla prognosi e la riabilitazione (compreso il dolore cronico post-ictus) nei pazienti colpiti da ictus pontino.
Ci sono diversi punti di forza di questo metodo. In primo luogo, fornisce un modello di ratto di infarto pontino acuto per studi futuri. Come accennato in precedenza, l'infarto pontino è un sottotipo di ictus comune che ha ricevuto meno attenzione. Un grave difetto della ricerca sull'ictus è stata la mancanza di uno specifico modello di infarto pontino. In secondo luogo, rispetto all'esistente modello di ratto infarto pontino per legatura del BA15,16, questo modello può essere regolato per modificare la posizione e il volume dell'infarto secondo il progetto sperimentale. Ad esempio, la lunghezza della punta può essere modificata in modo che l'infarto si estenda dalla superficie dei pons, come fatto qui.
In alternativa, un infarto lacunar nei pons può essere stabilito accorciando la lunghezza della punta della sonda (Figura supplementare 1). Infarti in diverse posizioni dei pons (cioè, infarto pontino anteromediale) e in diversi piani dei pons (cioè, piani superiori, medi e inferiori) possono anche essere creati secondo il design topografico. In questo modello, è stato scelto l'aereo pontino superiore. In terzo luogo, questo modello è facile da stabilire e possiede un alto tasso di successo. La legatura della BA non può produrre infarto a causa della potenziale circolazione collaterale15, ma questo modello stabilisce l'infarto ad un alto tasso di successo, che è essenziale per modelli di ricerca affidabili.
Esistono alcune limitazioni di questo metodo. In primo luogo, l'infarto in questo modello non è un vero e proprio colpo. L'ictus è il risultato di lesioni vascolari del vaso, disturbo del contenuto sanguigno o disfunzione della regolazione del flusso sanguigno cerebrale. L'infarto è creato da una lesione nei pons che non si verifica spontaneamente. In altre parole, questo modello non può essere utilizzato per risolvere il motivo per cui il tratto si verifica nei pons. In secondo luogo, questo modello richiede attrezzature speciali, come il dispositivo di produzione di lesioni e l'apparato stereotassico.
In conclusione, i risultati dimostrano il successo di questo modello nello stabilire un modello sperimentale di ictus di pons acuti. Sulla base di questo nuovo modello, la conseguente perdita cellulare e la prognosi dell'infarto pontino acuto possono essere ulteriormente studiate e consentire futuri sviluppi terapeutici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dalla National Science Foundation of China (81471181 e 81870933) a Y. Jiang e dalla National Science Foundation of China (n. 81601011), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. da BK20160345) a J. shu e dal Programma Scientifico della Commissione Sanitaria Municipale di Guangzhou (20191A011083) a .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 sucture | Shanghai Jinzhong | Surgical instruments | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgical instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | Wear mask when using the system | |
| Bone cement | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Cured clamp | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| General tissue scissors | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 217181101 | |
| Lesion Making Device | Shanghai Yuyan | Making a lesion | |
| MRI system | Bruker Biospin | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Probe | Anke | Need some modification | |
| Q-tips | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | ||
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| TTC | Sigma-Aldrich | BCBW5177 | For infarction confirmation in vitro |
References
- Zhu, J., et al. Suppression of local inflammation contributes to the neuroprotective effect of ginsenoside Rb1 in rats with cerebral ischemia. Neuroscience. 202, 342-351 (2012).
- Xu, X., et al. MicroRNA-1906, a Novel Regulator of Toll-Like Receptor 4, Ameliorates Ischemic Injury after Experimental Stroke in Mice. Journal of Neuroscience. 37, 10498-10515 (2017).
- McBride, D. W., Zhang, J. H. Precision Stroke Animal Models: the Permanent MCAO Model Should Be the Primary Model, Not Transient MCAO. Translational Stroke Research. , (2017).
- Liu, F., McCullough, L. D. Middle cerebral artery occlusion model in rodents: methods and potential pitfalls. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 464701 (2011).
- Jiang, Y., et al. A new approach with less damage: intranasal delivery of tetracycline-inducible replication-defective herpes simplex virus type-1 vector to brain. Neuroscience. 201, 96-104 (2012).
- Lopez, M. S., Vemuganti, R. Modeling Transient Focal Ischemic Stroke in Rodents by Intraluminal Filament Method of Middle Cerebral Artery Occlusion. Methods in Molecular Biology. 1717, 101-113 (2018).
- Pais-Roldan, P., et al. Multimodal assessment of recovery from coma in a rat model of diffuse brainstem tegmentum injury. NeuroImage. 189, 615-630 (2019).
- Merwick, A., Werring, D.
- Nogueira, R. G., et al. Thrombectomy 6 to 24 Hours after Stroke with a Mismatch between Deficit and Infarct. The New England Journal of Medicine. 378, 11-21 (2018).
- Wilkinson, D. A., et al. Late recanalization of basilar artery occlusion in a previously healthy 17-month-old child. Journal of Neurointerventional Surgery. 10, 17 (2018).
- Huang, R., et al. Stroke Subtypes and Topographic Locations Associated with Neurological Deterioration in Acute Isolated Pontine Infarction. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases: The Official Journal of National Stroke Association. 25, 206-213 (2016).
- Jiang, Y., et al. In-stent restenosis after vertebral artery stenting. International Journal of Cardiology. 187, 430-433 (2015).
- Huang, J., et al. Topographic location of unisolated pontine infarction. BMC Neurology. 19, 186 (2019).
- Banerjee, G., Stone, S. P., Werring, D. J.
- Wojak, J. C., DeCrescito, V., Young, W.
- Namioka, A., et al. Intravenous infusion of mesenchymal stem cells for protection against brainstem infarction in a persistent basilar artery occlusion model in the adult rat. Journal of Neurosurgery. , 1-9 (2018).
- Jiang, Y., et al. Intranasal brain-derived neurotrophic factor protects brain from ischemic insult via modulating local inflammation in rats. Neuroscience. 172, 398-405 (2011).
- Schaar, K. L., Brenneman, M. M., Savitz, S. I. Functional assessments in the rodent stroke model. Experiments in Translational and Stroke. 2, 13 (2010).
- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
- Wen, Z., et al. Optimization of behavioural tests for the prediction of outcomes in mouse models of focal middle cerebral artery occlusion. Brain Research. 1665, 88-94 (2017).
