Demonstrere en lineær sammenhæng mellem vaskulær endotelial vækstfaktor og luteiniserende hormon i nyre cortex ekstrakter
Summary
Præsenteret her er en protokol til at udnytte en kortikale nyre ekstrakt forberedelse og total protein normalisering at demonstrere sammenhængen mellem vaskulær endotelvækstfaktor og luteiniserende hormon i pattedyrs nyre.
Abstract
Vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) hjælper med at kontrollere angiogenese og vaskulær permeabilitet i nyrerne. Nyrelidelser, såsom diabetisk nefropati, er forbundet med VEGF dysregulering i nyrerne. De faktorer, der regulerer VEGF under fysiologisk forhold i nyrerne er ikke godt forstået. Luteiniserende hormon (LH), en Pro-angiogen hormon, hjælper med at regulere fysiologisk VEGF udtryk i reproduktive organer. I betragtning af at LH receptorer findes i nyrerne, vi, på Zietchick Research Institute, hypotese her, at LH også hjælper med at regulere VEGF udtryk i nyrerne samt. For at fremlægge dokumentation, vi har til formål at vise, at LH niveauer er i stand til at forudsige VEGF niveauer i pattedyrs nyre. De fleste VEGF-relaterede undersøgelser, der involverer nyrerne, har brugt lavere orden pattedyr som modeller (dvs. gnavere og kaniner). For at oversætte dette arbejde til den menneskelige krop, blev det besluttet at undersøge forholdet mellem VEGF og LH i højere orden pattedyr (dvs., kvæg og svin modeller). Denne protokol bruger det samlede protein lysat fra nyre cortex. Nøglerne til denne metodes succes omfatter indkøb af nyrer fra slagteri dyrene umiddelbart efter døden samt normalisering af analysand niveauer (i nyre ekstraktet) af total protein. Denne undersøgelse viser med held et signifikant lineært forhold mellem LH og VEGF i både kvæg-og svine nyrerne. Resultaterne er reproducerbare i to forskellige arter. Undersøgelsen giver dokumentation for, at brugen af nyre ekstrakter fra køer og grise er en fremragende, økonomisk og rigelig ressource til studiet af renal fysiologi, især for at undersøge korrelationen mellem VEGF og andre analytter.
Introduction
Vaskulær endotelvækstfaktor A (VEGF-a), hjælper med at regulere angiogenese og vaskulær permeabilitet i nyrerne og andre organer1,2(herefter vil VEGF-a blive omtalt som VEGF). VEGF niveauer i nyrerne er under stram homeostatisk kontrol. Når nyre VEGF niveauer er forhøjet eller deprimeret, kan nyrerne funktionsfejl. For eksempel, inden for 3 uger efter fødslen, mus med podocyte-specifik heterozygosity for VEGF udvikle endotheliosis og blodløse glomeruli (dvs, nyre læsioner set i humant præeklampsi), og slutstadiet nyresvigt forekommer i disse heterozygoter af 3 måneders alderen. Podocyte-specifikke homozygotiske knockouts dør fra hydrops og nyresvigt inden for 1 dag fødsel3,4.
På den anden side, over ekspression af renal VEGF forårsager proteinuri og glomerulær hypertrofi3,4. For eksempel, transgene kaniner, der overekspression af VEGF udviser progressiv proteinuri med øget glomerulær filtrat ions hastigheder i tidlige stadier af nefropati, efterfulgt af nedsat glomerulær filtrat ions hastigheder i senere stadier3. Diabetisk nefropati, en væsentlig årsag til nyresygdom i slutstadiet hos diabetiske voksne, er stærkt forbundet med VEGF dysregulering2,5. En stor del af opmærksomheden er blevet betalt til rollen af hypoksi i inducerende VEGF udtryk under patologiske betingelser5. Men de faktorer, der regulerer VEGF under fysiologisk forhold (både i nyrerne og andre organer) er ikke godt forstået2,6. Identificering af disse faktorer (med undtagelse af ilt), der er involveret i fysiologisk og patologisk VEGF-regulering, er en vigtig virksomhed.
Luteiniserende hormon (LH), en Pro-angiogen hormon, hjælper med at regulere fysiologisk VEGF udtryk i reproduktive organer såsom æggestokkene og testikel7,8. Tidligere undersøgelser har givet dokumentation for, at LH også hjælper med at regulere VEGF i ikke-reproduktive organer, såsom øjnene6,9,10. LH receptorer findes i medulla og cortex af nyrerne11,12. Af note, nyre tubulære epiteliale celler, samt LH receptor, Express VEGF11,12,13,14. Tager disse to observationer sammen, vi hypotese, at LH også hjælper med at regulere VEGF udtryk i nyrerne13,14. At fremlægge dokumentation for dette LH/VEGF forhold, den præsenterede protokol har til formål at vise, at LH niveauer er i stand til at forudsige VEGF niveauer i nyrerne. Mange tidligere VEGF-relaterede undersøgelser, der involverer nyrerne har brugt lavere orden pattedyr modeller (dvs., gnavere og kaniner)2. For at omsætte dette arbejde til det menneskelige legeme, undersøgelsen undersøger forholdet mellem VEGF og LH i højere orden pattedyr (her, kvæg og svin modeller). For at opfylde dette mål blev det totale proteinlysat fremstillet fra cortex-regionen af kvæg-og svinenyrer.
Protocol
Representative Results
Discussion
At fremskaffe nyrer fra slagteriet umiddelbart efter dyrenes død er nøglen til succes i denne metode. Dette er den største fordel ved at udnytte organer fra køer og grise i stedet for menneskelige Kadaverer. Der er normalt mindst en 12-24 h forsinkelse fra dødstidspunktet, indtil menneskelige Kadaver organer indkøbes. Fordi den kemiske sammensætning af kropsorganer signifikant ændringer inden for 2 h post mortem15,16, VEGF-undersøgelser i human Kadaver n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Scholl slagteri (Blissfield, MI) for levering af kvæg-og svine nyrerne. Der blev ikke udnyttet nogen tilskudsfinansiering til denne undersøgelse.
Materials
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
References
- Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
- Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).
- Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).
- Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
- Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92 (1), 15 (2015).
- Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neuroscience. 385, 1-10 (2018).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).
- Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).
- Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).
- Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).
- Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).
- Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).
- Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
- Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
- Konstantinou, G. N. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).
- Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).
- Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
- Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. , 872978 (2012).
- Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).
