Præsenteret her er en protokol til at udnytte en kortikale nyre ekstrakt forberedelse og total protein normalisering at demonstrere sammenhængen mellem vaskulær endotelvækstfaktor og luteiniserende hormon i pattedyrs nyre.
Vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) hjælper med at kontrollere angiogenese og vaskulær permeabilitet i nyrerne. Nyrelidelser, såsom diabetisk nefropati, er forbundet med VEGF dysregulering i nyrerne. De faktorer, der regulerer VEGF under fysiologisk forhold i nyrerne er ikke godt forstået. Luteiniserende hormon (LH), en Pro-angiogen hormon, hjælper med at regulere fysiologisk VEGF udtryk i reproduktive organer. I betragtning af at LH receptorer findes i nyrerne, vi, på Zietchick Research Institute, hypotese her, at LH også hjælper med at regulere VEGF udtryk i nyrerne samt. For at fremlægge dokumentation, vi har til formål at vise, at LH niveauer er i stand til at forudsige VEGF niveauer i pattedyrs nyre. De fleste VEGF-relaterede undersøgelser, der involverer nyrerne, har brugt lavere orden pattedyr som modeller (dvs. gnavere og kaniner). For at oversætte dette arbejde til den menneskelige krop, blev det besluttet at undersøge forholdet mellem VEGF og LH i højere orden pattedyr (dvs., kvæg og svin modeller). Denne protokol bruger det samlede protein lysat fra nyre cortex. Nøglerne til denne metodes succes omfatter indkøb af nyrer fra slagteri dyrene umiddelbart efter døden samt normalisering af analysand niveauer (i nyre ekstraktet) af total protein. Denne undersøgelse viser med held et signifikant lineært forhold mellem LH og VEGF i både kvæg-og svine nyrerne. Resultaterne er reproducerbare i to forskellige arter. Undersøgelsen giver dokumentation for, at brugen af nyre ekstrakter fra køer og grise er en fremragende, økonomisk og rigelig ressource til studiet af renal fysiologi, især for at undersøge korrelationen mellem VEGF og andre analytter.
Vaskulær endotelvækstfaktor A (VEGF-a), hjælper med at regulere angiogenese og vaskulær permeabilitet i nyrerne og andre organer1,2(herefter vil VEGF-a blive omtalt som VEGF). VEGF niveauer i nyrerne er under stram homeostatisk kontrol. Når nyre VEGF niveauer er forhøjet eller deprimeret, kan nyrerne funktionsfejl. For eksempel, inden for 3 uger efter fødslen, mus med podocyte-specifik heterozygosity for VEGF udvikle endotheliosis og blodløse glomeruli (dvs, nyre læsioner set i humant præeklampsi), og slutstadiet nyresvigt forekommer i disse heterozygoter af 3 måneders alderen. Podocyte-specifikke homozygotiske knockouts dør fra hydrops og nyresvigt inden for 1 dag fødsel3,4.
På den anden side, over ekspression af renal VEGF forårsager proteinuri og glomerulær hypertrofi3,4. For eksempel, transgene kaniner, der overekspression af VEGF udviser progressiv proteinuri med øget glomerulær filtrat ions hastigheder i tidlige stadier af nefropati, efterfulgt af nedsat glomerulær filtrat ions hastigheder i senere stadier3. Diabetisk nefropati, en væsentlig årsag til nyresygdom i slutstadiet hos diabetiske voksne, er stærkt forbundet med VEGF dysregulering2,5. En stor del af opmærksomheden er blevet betalt til rollen af hypoksi i inducerende VEGF udtryk under patologiske betingelser5. Men de faktorer, der regulerer VEGF under fysiologisk forhold (både i nyrerne og andre organer) er ikke godt forstået2,6. Identificering af disse faktorer (med undtagelse af ilt), der er involveret i fysiologisk og patologisk VEGF-regulering, er en vigtig virksomhed.
Luteiniserende hormon (LH), en Pro-angiogen hormon, hjælper med at regulere fysiologisk VEGF udtryk i reproduktive organer såsom æggestokkene og testikel7,8. Tidligere undersøgelser har givet dokumentation for, at LH også hjælper med at regulere VEGF i ikke-reproduktive organer, såsom øjnene6,9,10. LH receptorer findes i medulla og cortex af nyrerne11,12. Af note, nyre tubulære epiteliale celler, samt LH receptor, Express VEGF11,12,13,14. Tager disse to observationer sammen, vi hypotese, at LH også hjælper med at regulere VEGF udtryk i nyrerne13,14. At fremlægge dokumentation for dette LH/VEGF forhold, den præsenterede protokol har til formål at vise, at LH niveauer er i stand til at forudsige VEGF niveauer i nyrerne. Mange tidligere VEGF-relaterede undersøgelser, der involverer nyrerne har brugt lavere orden pattedyr modeller (dvs., gnavere og kaniner)2. For at omsætte dette arbejde til det menneskelige legeme, undersøgelsen undersøger forholdet mellem VEGF og LH i højere orden pattedyr (her, kvæg og svin modeller). For at opfylde dette mål blev det totale proteinlysat fremstillet fra cortex-regionen af kvæg-og svinenyrer.
At fremskaffe nyrer fra slagteriet umiddelbart efter dyrenes død er nøglen til succes i denne metode. Dette er den største fordel ved at udnytte organer fra køer og grise i stedet for menneskelige Kadaverer. Der er normalt mindst en 12-24 h forsinkelse fra dødstidspunktet, indtil menneskelige Kadaver organer indkøbes. Fordi den kemiske sammensætning af kropsorganer signifikant ændringer inden for 2 h post mortem15,16, VEGF-undersøgelser i human Kadaver n…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Scholl slagteri (Blissfield, MI) for levering af kvæg-og svine nyrerne. Der blev ikke udnyttet nogen tilskudsfinansiering til denne undersøgelse.
Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |