Dimostrazione di una relazione lineare tra il fattore di crescita endoteliale vascolare e l'ormone luteinizzante negli estratti della corteccia renale
Summary
Presentato qui è un protocollo per l’utilizzo di una preparazione di estratto di rene corticale e la normalizzazione totale delle proteine per dimostrare la correlazione tra fattore di crescita endoteliale vascolare e ormone luteinizzante nel rene dei mammiferi.
Abstract
Fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) aiuta a controllare l’angiogenesi e la permeabilità vascolare nel rene. Disturbi renali, come la nefropatia diabetica, sono associati con la disregolazione VEGF nel rene. I fattori che governano il VEGF in condizioni fisiologiche nel rene non sono ben compresi. L’ormone luteinizzante (LH), un ormone pro-angiogenico, aiuta a regolare l’espressione fisiologica VEGF negli organi riproduttivi. Dato che i recettori LH si trovano nel rene, noi, presso l’Istituto di ricerca di zietchick, abbiamo ipotizzato qui che LH aiuta anche a regolare l’espressione VEGF nel rene pure. Per fornire prove, abbiamo cercato di dimostrare che i livelli di LH sono in grado di prevedere i livelli di VEGF nel rene dei mammiferi. La maggior parte delle indagini relative al VEGF che coinvolgono il rene hanno utilizzato come modelli mammiferi di ordine inferiore (ad esempio, roditori e conigli). Per tradurre questo lavoro nel corpo umano, si è deciso di esaminare la relazione tra VEGF e LH nei mammiferi di ordine superiore (ad esempio, modelli bovini e suini). Questo protocollo utilizza la proteina totale lisato dalla corteccia renale. Le chiavi del successo di questo metodo includono l’approvvigionamento di reni da animali da macello subito dopo la morte, nonché la normalizzazione dei livelli di analita (nell’estratto renale) per proteina totale. Questo studio dimostra con successo una relazione lineare significativa tra LH e VEGF nei reni bovini e porcili. I risultati sono riproducibili in due specie diverse. Lo studio fornisce prove a sostegno che l’uso di estratti renali da mucche e maiali sono una risorsa eccellente, economica e abbondante per lo studio della fisiologia renale, in particolare per esaminare la correlazione tra VEGF e altri analiti.
Introduction
Fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGF-A), aiuta a regolare l’angiogenesi e la permeabilità vascolare nel rene e in altri organi1,2 (qui di seguito, VEGF-A sarà indicato come VEGF). I livelli di VEGF nel rene sono sotto stretto controllo omeostatico. Quando i livelli di VEGF renale sono elevati o depressi, il rene può non funzionare correttamente. Ad esempio, entro 3 settimane dalla nascita, i topi con eterozigosità specifica podocite per il VEGF sviluppano endoteliosi e glomeruli senza sangue (cioè lesioni renali osservate nella preeclampsia umana), e il rene di insufficienza allo stadio finale si verifica in queste eterozigoti entro i 3 mesi di età. Knockout omozigotici specifici per podociti muoiono per idropi e insufficienza renale entro 1 giorno dalla nascita3,4.
D’altra parte, la sovraespressione del VEGF renale provoca proteinuria e ipertrofia glomerare3,4. Ad esempio, i conigli transgenici che sovraesprimono il VEGF presentano proteinuria progressiva con tassi di filtrazione glomerale aumentati nelle prime fasi della nefropatia, seguiti da tassi di filtrazione glomerale in diminuzione nelle fasi successive3. La nefropatia diabetica, una delle principali cause di malattia renale allo stadio finale negli adulti diabetici, è fortemente associata alla disregolazione VEGF2,5. È stata prestata molta attenzione al ruolo dell’ipossia nell’indurre l’espressione del VEGF in condizioni patologiche5. Tuttavia, i fattori che regolano il VEGF in condizioni fisiologiche (sia nel rene che in altri organi) non sono ben compresi2,6. Identificare questi fattori (ad eccezione dell’ossigeno) che sono coinvolti nella regolazione del VEGF fisiologico e patologico è un’impresa importante.
Ormone luteinizzante (LH), un ormone pro-angiogenico, aiuta a regolare l’espressione fisiologica VEGF in organi riproduttivi come l’ovaio e il testire7,8. Studi precedenti hanno fornito prove che LH aiuta anche a regolare il VEGF negli organi non riproduttivi, come gli occhi6,9,10. I recettori LH si trovano nella medulla e nella corteccia delrene 11,12. Da notare, le cellule epiteliali tubolari renali, così come il recettore LH, esprimono VEGF11,12,13,14. Prendendo insieme queste due osservazioni, abbiamo ipotizzato che LH aiuta anche a regolare l’espressione VEGF nel rene13,14. Per fornire la prova di questa relazione LH/VEGF, il protocollo presentato mira a dimostrare che i livelli di LH sono in grado di prevedere i livelli di VEGF nel rene. Molte precedenti indagini relative al VEGF che hanno coinvolto il rene hanno utilizzato modelli di mammiferi di ordine inferiore (ad esempio, roditori e conigli)2. Per tradurre questo lavoro nel corpo umano, lo studio esamina la relazione tra VEGF e LH nei mammiferi di ordine superiore (qui, modelli bovini e porcino). Per raggiungere questo obiettivo, il lisato proteico totale è stato preparato dalla regione della corteccia dei reni bovini e porcili.
Protocol
Representative Results
Discussion
Procurarsi i reni dal mattatoio subito dopo la morte animale è la chiave del successo in questa metodologia. Questo è il vantaggio principale dell’utilizzo di organi da mucche e maiali invece di cadaveri umani. Di solito c’è almeno un ritardo di 12-24 ore dal momento della morte fino a quando gli organi cadaveri umani sono procurati. Poiché la composizione chimica degli organi corporei cambia in modo significativo entro 2 h dopo la morte15,16, gli studi VEGF …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Scholl’s Slaughterhouse (Blissfield, MI) per aver fornito i reni bovini e porcinici. Per questo studio non è stato utilizzato alcun finanziamento per sovvenzioni.
Materials
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
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