Summary
Apresentado aqui é um protocolo para a utilização de uma preparação de extrato renal cortical e normalização total da proteína para demonstrar a correlação entre fator de crescimento endotelial vascular e hormônio luteinizador no rim de mamíferos.
Abstract
O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) ajuda a controlar a angiogênese e a permeabilidade vascular no rim. Distúrbios renais, como nefropatia diabética, estão associados à desregulação do VEGF no rim. Os fatores que regem o VEGF em condições fisiométricas no rim não são bem compreendidos. O hormônio luteinizador (LH), um hormônio pró-angiogênico, ajuda a regular a expressão fisiométrica vegf em órgãos reprodutivos. Dado que os receptores De LH são encontrados no rim, nós, no Instituto de Pesquisa Zietchick, hipotetizar aqui que LH também ajuda a regular a expressão VEGF no rim também. Para fornecer evidências, visamos mostrar que os níveis de LH são capazes de prever os níveis de VEGF no rim de mamíferos. A maioria das investigações relacionadas ao VEGF envolvendo o rim têm usado mamíferos de ordem inferior como modelos (ou seja, roedores e coelhos). Para traduzir este trabalho para o corpo humano, decidiu-se examinar a relação entre VEGF e LH em mamíferos de ordem superior (ou seja, modelos bovinos e suínos). Este protocolo usa o lisato total da proteína do córtex do rim. As chaves para o sucesso deste método incluem a aquisição de rins de animais de matadouro imediatamente após a morte, bem como a normalização dos níveis de anrósteria (no extrato renal) por proteína total. Este estudo demonstra com sucesso uma relação linear significativa entre LH e VEGF em ambos os rins bovinos e suínos. Os resultados são reproduzíveis em duas espécies diferentes. O estudo fornece evidências de que o uso de extratos renais de vacas e porcos é um excelente recurso econômico e abundante para o estudo da fisiologia renal, particularmente para examinar a correlação entre o VEGF e outros analítes.
Introduction
O fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A), ajuda a regular a angiogênese e permeabilidade vascular no rim e outros órgãos1,2 (a seguir, o VEGF-A será referido como VEGF). Os níveis de VEGF no rim estão controle homeostático apertado. Quando os níveis renais de VEGF são elevados ou deprimidos, o rim pode funcionar mal. Por exemplo, dentro de 3 semanas após o nascimento, camundongos com heterozigosidade específica de podocito para VEGF desenvolvem endotelrose e glomeruli sem derramamento de sangue (ou seja, lesões renais observadas na pré-eclâmpsia humana) e insuficiência renal em estágio terminal ocorre nesses heterozigotos em 3 meses de idade. Nocautes homozigóticos específicos de podocito morrem de hidrops e insuficiência renal dentro de 1 dia após o nascimento3,4.
Por outro lado, a superexpressão do VEGF renal causa proteinúria e hipertrofia glomerular3,4. Por exemplo, coelhos transgênicos que superexpressam vegf exibem proteinúria progressiva com aumento das taxas de filtragem glomerular nos estágios iniciais da nefropatia, seguido pela diminuição das taxas de filtragem glomerular em estágios posteriores3. A nefropatia diabética, principal causa de doença renal em estágio terminal em adultos diabéticos, está fortemente associada à desregulaçãovegf 2,5. Muita atenção tem sido dada ao papel da hipóxia na indução da expressão vegf condições patológicas5. No entanto, os fatores que regem o VEGF em condições fisiométricas (tanto no rim quanto em outros órgãos) não são bem compreendidos2,6. Identificar esses fatores (exceto oxigênio) que estão envolvidos na regulação fisiológica e patológica do VEGF é um empreendimento importante.
Hormônio luteinizador (LH), um hormônio pró-angiogênico, ajuda a regular a expressão fisiométrica VEGF em órgãos reprodutivos, como o ovário e testículo7,8. Estudos anteriores forneceram evidências de que a LH também ajuda a regular o VEGF em órgãos não reprodutivos, como os olhos6,9,10. LH receptores são encontrados na medula e córtex do rim11,12. De nota, as células epiteliais tubulares, bem como o receptor LH, expressam VEGF11,12,13,14. Tomando estas duas observações junto, nós supor que LH igualmente ajuda a regular a expressão de VEGF no rim13,14. Para fornecer evidências dessa relação LH/VEGF, o protocolo apresentado visa mostrar que os níveis de LH são capazes de prever os níveis de VEGF no rim. Muitas investigações anteriores relacionadas ao VEGF envolvendo o rim usaram modelos de mamíferos de ordem inferior (ou seja, roedores e coelhos)2. Para traduzir este trabalho para o corpo humano, o estudo examina a relação entre VEGF e LH em mamíferos de maior ordem (aqui, modelos bovinos e suínos). Para realizar esse objetivo, o lisato total de proteínas foi preparado a partir da região do córtex dos rins bovinos e suínos.
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Protocol
Nenhum animal vivo ou experimental foi utilizado para este estudo.
1. Manuseio de tecidos
- Procure rins inteiros bovinos e suínos imediatamente após o abate de um matadouro. Transporte no gelo para o laboratório.
- Ao chegar ao laboratório, lave os rins com 50 mL de soro soro soro para o soro de soro de soro vermelho (PBS) de fosfato gelado. Repita este passo 2x para remover o sangue completamente.
- Mantenha os rins no gelo (ou refrigerados) até a extração.
2. Dissecação de Rins
- Use tesouras estéreis, fórceps, uma faca e placas de Petri para dissecar os rins e extirpar a porção de tecido necessária.
- Prepare ripa lysis buffer antes da dissecção renal. Dissolva 5 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M Tris (pH = 8,0), NP-40 (ID + GEPAL CA-630), 10% de sódio deoxicolado e 10% SDS em água destilada dupla, em seguida, misture bem. Leve à geladeira o buffer de lyse RIPA quando não estiver em uso.
- Corte suavemente o rim ao meio (plano sagital) e corte um pedaço de tecido (50-70 mm2)da região do córtex no centro do rim (pesando 80-100 mg por peso molhado).
- Pique o bloco de tecido em pedaços pequenos com uma faca para ajudar no processo de homogeneização.
- Depois de picar os tecidos, transferi-los para um tubo de microfúria com 1 mL de gelo-frio 1x RIPA disisé de extração tampão. Coloque os tubos no gelo até a extração.
3. Homogeneização de tecidos
- Rotular os tubos de microfúgios com detalhes específicos da amostra para a coleta de supernatant tecido.
- Usando um homogeneizador portátil com uma sonda estéril, em seguida, homogeneizar os tecidos para 1-2 min em condições frias (amostras no balde de gelo) até que nenhum pedaço de tecidos são visíveis.
- Sujeito os extratos de tecido imediatamente para centrífuga na centrífuga refrigerada em 9.600 x g para 5 min a 4 °C.
- Retire os tubos da centrífuga e coloque-os no balde de gelo.
- Colete o supernatant em um tubo novo etiquetado do microfuge e guarde no gelo. Descarte a pelota.
- Prepare alíquotas separadas dos supernatantes para ensaios imunosorbentos lh e vegf-a ligados a enzimas (ELISA) e análise total de proteínas, respectivamente, para evitar ciclos de congelamento-degelo.
4. Bovino e Ensaio DeSinista LH ELISA
- Guarde todos os componentes de ensaio da ELISA incluídos no kit elisa de hormônio luteinização comercialmente disponível (LH) (ver Tabela de Materiais)a 2-8 °C. Isso inclui o anticorpo, sARH-conjugado, placa de ensaio (96 bem), calibradores, tampão de lavagem (concentrado 20x), substrato A, substrato B e solução de stop. Prepare todos os reagentes como recomendado pelas instruções do fabricante.
- Antes de iniciar o ensaio, leve todos os reagentes e placa de ensaio à temperatura ambiente (RT). Use o número necessário de poços para o ensaio, selo, e manter os poços não utilizados em 4 °C até o uso.
- Diluir o tampão de lavagem (15 mL de concentrado de 20x) a 300 mL com água destilada dupla
- Configure os poços em branco sem qualquer solução.
- Adicione 50 μL de padrão ou amostra a cada poço (n = 2), em seguida, adicione mais 50 μL de peroxidase rábano (hrp) conjugado a cada poço. Adicione imediatamente mais 50 μL de solução de anticorpos para cada poço. Selar a placa, misture bem, e incubar por 1 h a 37 °C.
- Lave os poços com tampão de lavagem 1x (200 μL/bem) e repita 4x.
- Adicione 50 μL de substrato A e 50 μL de substrato B a cada poço, e misture bem tocando a placa ao lado suavemente. Selar a placa e incubar por 15 min a 37 °C no escuro por 15 min.
- Adicione 50 μL de solução de parada para cada poço, toque suavemente na placa e leia a placa usando o espectrômetro definido para um comprimento de onda de 450 nm.
- Normalize os níveis bovinos e suínos de LH até a proteína total (ver seção 6).
5. Bovino e Porcine VEGF-A ELISA Ensaio
- Guarde todos os componentes de ensaio da ELISA incluídos nos kits Vascular Endothelial Growth Factor-A ELISA (ver Tabela de Materiais)a 2-8 °C. Isso inclui o anticorpo, sARH-conjugado, placa de ensaio (96 bem), calibradores, tampão de lavagem (concentrado 20x), substrato A, substrato B e solução de stop. Prepare todos os reagentes como recomendado pelas instruções do fabricante.
- Antes de iniciar o ensaio, traga todos os reagentes e placa de ensaio para RT. Use o número necessário de poços para o ensaio, selo e manter os poços não utilizados em 4 °C até o uso.
- Diluir o tampão de lavagem (15 mL de concentrado de 20x) a 300 mL com água destilada dupla
- Adicione 100 μL do padrão ou amostra a cada poço (n = 2). Selar a placa, misture bem, e incubar por 2 h a 37 °C.
- Retire o líquido em cada poço e adicione 100 μL de reagente de detecção A para cada poço, selar a placa, e incubar por 1 h a 37 °C.
- Lave os poços com tampão de lavagem 1x (400 μL/bem) e repita 4x.
- Adicione 100 μL de reagente de detecção B para cada poço e misture bem tocando a placa no lado suavemente. Selar a placa e incubar a placa por 1 h a 37 °C.
- Lave os poços com tampão de lavagem 1x (400 μL/bem) e repita 4x.
- Adicione 90 μL de solução de substrato a cada poço, toque suavemente na placa e incubar por 1 h a 37 °C.
- Adicione 50 μL de solução de parada para cada poço, toque suavemente na placa e leia a placa usando o espectrômetro definido para um comprimento de onda de 450 nm.
- Normalize os níveis bovinos e suínos vegf-A para a proteína total (seção 6).
6. Estimativa total de proteínas
- Estimaa a proteína total dos extratos de rim bovina e suíno por albumina sérica bovina padrão (BSA) usando um kit comercial (ver Tabela de Materiais) deacordo com as recomendações do fabricante.
7. Análise Estatística
- Calcule o desvio médio, mediano e padrão de cada anályte.
- Teste a divergência de distribuição de amostras do teste normal de uso de Kolmogorov-Smirnov para decidir, após o uso, entre paramétrico vs. testes estatísticos não paramétricos. Se os dados forem normalmente distribuídos, realizetestes estatísticos por meio de testes paramétricos.
- Em circunstâncias apropriadas (como a distribuição normal de dados), utilize modelos de regressão para examinar a relação linear entre LH e VEGF-A.
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Representative Results
Os níveis médio e médio e médio de LH e VEGF por tipo animal e por sexo são mostrados na Tabela 1. Depois de verificar a normalidade dos dados por Kolmogorov-Smirnov Teste de normalidade, modelos de regressão linear foram utilizados para examinar a relação entre LH e VEGF. LH foi encontrado para ser um preditor forte e significativo de VEGF em ambos os rins bovinos e suínos (modelo renal bovina: n = 7, R2 = 0,86, p = 0,002; modelo de rim porcino: n = 7; R2 = 0,66, p = 0,025).
A relação linear LH/VEGF é ilustrada na Figura 1 (modelo de regressão bovina) e na Figura 2 (modelo de regressão porcina). A equação linear bovina é a seguinte: nível VEGF = 2.156 x nível LH + 68,75. A equação linear suína é a seguinte: nível VEGF = 196,7 x níveis de LH + 47,94.
| Tipo de amostra | Machos | Fêmeas | Todos |
| Rins bovinos | n = 4 | n = 3 | n = 7 |
| LH (mIU/mg proteína total) | Média: 27,47 (SD 13,3) | Média: 19,5 (SD 2.1) | Média: 24,06 (SD 10,8) |
| Mediana: 25,7 | Mediana: 19,9 | Mediana: 19,9 | |
| VEGF (proteína total pg/mg) | Média: 126,2 (SD 25,8) | Média: 106,0 (SD 14,5) | Média: 120,6 (SD 25,1) |
| Mediana: 131,6 | Mediana: 103,5 | Mediana: 110,8 | |
| Rins suínos | n = 4 | n = 3 | n = 7 |
| LH (mIU/mg proteína total) | Média: 13,2 (SD 3,6) | Média: 12,3 (SD 5,5) | Média: 12,8 (SD 4,5) |
| Mediana: 13,6 | Mediana: 10,3 | Mediana: 11,2 | |
| VEGF (proteína total pg/mg) | Média: 2987,2 (SD 772,5) | Média: 2354,1 (SD 932,4) | Média: 2715,9 (SD 901,0) |
| Mediana: 3324,67 | Mediana: 2377,3 | Mediana: 3226,4 |
Tabela 1: Níveis médios de LH e VEGF por tipo de animal e sexo.
Figura 1: LH/VEGF relação linear em rins bovinos adultos (n = 7). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: LH/VEGF relação linear em rins suínos adultos (n = 7). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
A aquisição de rins do matadouro imediatamente após a morte animal é a chave para o sucesso nesta metodologia. Esta é a principal vantagem de utilizar órgãos de vacas e porcos em vez de cadáveres humanos. Geralmente há pelo menos um atraso de 12-24 h a partir da hora da morte até que os órgãos de cadáveres humanos são adquiridos. Como a composição química dos órgãos corporais muda significativamente dentro de 2 h post-mortem15,16,VEGF-estudos em rins cadáver humano pode não refletir as circunstâncias da vida real. Embora o protocolo enfatize muito a importância da aquisição imediata e colocação de órgãos animais no gelo após a extração, não se sabe se outros pesquisadores também priorizam essa etapa. Por exemplo, a seção de metodologia de um estudo recente (utilizando rins bovinos e suínos para a detecção de resíduos de antibióticos) não especificou o atraso de tempo entre a morte animal e a aquisição/refrigeração dos órgãos17.
Este estudo mede os analitos de interesse (VEGF e LH) com ELISAs comercialmente disponíveis e específicos para espécies. Elisas são altamente sensíveis, simples de realizar ensaios com, e produzir resultados robustos18. Um passo crítico no protocolo é a normalização dos níveis de análise (medidos pela ELISA) por proteína total. O extrato de rim cortical é uma substância biológica altamente heterogênea. À luz disso, um fator de correção é essencial para que os níveis de análise possam ser comparados entre os animais. Assim, normalizada pela proteína total foi realizada, uma vez que nós e outros têm normalizado com sucesso outras substâncias biológicas heterogêneas (ou seja, urina, manchas de sangue seco, e fluido vítreo) da mesma forma9,19,20.
Um estudo anterior mostrou que a correlação entre LH e VEGF no fluido vítreo (de olhos bovinos e suínos) só se manifesta após a normalização pela proteína total6. É importante ressaltar que esse passo de normalização é freqüentemente omitido em estudos vegf publicados, particularmente naqueles que envolvem ensaios da ELISA. Em vez disso, os níveis de VEGF são muitas vezes expressos em unidades como picograma por mililitro (e não como picograma por miligrama de proteína total). Por exemplo, nenhuma das medições vitreous vegf em nove diferentes estudos ELISA (que foram incluídos em um artigo de revisão VEGF vítreo) foram normalizados por qualquer método de correção21,22. Essa falta de normalização do VEGF nos estudos da ELISA pode explicar parcialmente por que o VEGF ainda não foi verificado como um biomarcador válido21,22.
Apesar do tamanho limitado da amostra dos dados representativos (bovina, n = 7; suíno, n = 7), este protocolo demonstra uma relação linear forte e significativa entre LH e VEGF nos rins bovinos e suínos. Dito isto, não havia um tamanho amostral grande o suficiente para realizar análises multivariadas ajustadas para o gênero. Pretendemos repetir este estudo com maiores tamanhos de amostra para que tais análises possam ser realizadas. No entanto, os resultados apresentados suportam a potencial associação entre LH e VEGF no rim de mamíferos.
Espera-se que este trabalho ajude a promover a compreensão da regulação homeostática de VEGF no rim. Tanto a qualidade dessa metodologia quanto a robustez dos achados são ilustradas pela reprodutibilidade dos resultados em duas espécies diferentes. Como os animais destinados à produção de carne são saudáveis, o uso de extratos renais de animais de matadouro é principalmente para estudar fisiologia; no entanto, seus órgãos são menos úteis para o estudo da patologia, que é a principal limitação de seu uso. Em suma, o uso de extratos renais de vacas e porcos é um excelente recurso econômico e abundante para o estudo de rins adultos normais. Por fim, o protocolo demonstra a eficácia da utilização total de proteínas para normalização, particularmente ao examinar correlações entre o VEGF e outros analytes.
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Disclosures
Zietchick Research Institute (ZRI) é um instituto de pesquisa privado (com fins lucrativos), e Dr. Tammy Movsas (fundador e diretor da ZRI) tem um pedido de patente pendente e patentes validadas para o uso de antagonistas da gonadotropina no tratamento de doenças oculares e diabetes. Além de ser um funcionário (bioquímico) da ZRI, o Dr. A. Muthusamy não tem outros conflitos financeiros para relatar. A. Arivalagan (estagiário de verão na ZRI, estudante de graduação da Universidade de Michigan) não tem outros conflitos financeiros para relatar.
Acknowledgments
Os autores agradecem slaughterhouse Scholl (Blissfield, MI) para fornecer os rins bovinos e suínos. Nenhum financiamento de subvenção foi utilizado para este estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
References
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