Summary
Présenté ici est un protocole pour l'utilisation d'une préparation corticale d'extrait de rein et de normalisation totale de protéine pour démontrer la corrélation entre le facteur de croissance endothéliale vasculaire et l'hormone lutéinisante dans le rein de mammifères.
Abstract
Le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) aide à commander l'angiogenèse et la perméabilité vasculaire dans le rein. Les désordres rénaux, tels que la néphropathie diabétique, sont associés à la dysrégulation de VEGF dans le rein. Les facteurs qui régissent VEGF dans des conditions physiologiques dans le rein ne sont pas bien compris. L'hormone lutéinisante (LH), une hormone pro-angiogénique, aide à réguler l'expression physiologique de VEGF dans les organes reproducteurs. Étant donné que les récepteurs LH se trouvent dans le rein, nous, à l'Institut de recherche Zietchick, présumé ici que LH contribue également à réguler l'expression VEGF dans le rein ainsi. Pour fournir des preuves, nous avons cherché à montrer que les niveaux de LH sont en mesure de prédire les niveaux de VEGF dans le rein des mammifères. La plupart des enquêtes liées au VEGF impliquant le rein ont utilisé des mammifères de moindre ordre comme modèles (c.-à-d. rongeurs et lapins). Pour traduire ce travail au corps humain, il a été décidé d'examiner la relation entre veGF et LH chez les mammifères de plus haut niveau (c'est-à-dire les modèles bovins et porcins). Ce protocole utilise le lysate protéique total du cortex rénal. Les clés du succès de cette méthode comprennent l'approvisionnement en reins d'animaux d'abattoir immédiatement après la mort ainsi que la normalisation des niveaux d'analytes (dans l'extrait de rein) par protéine totale. Cette étude démontre avec succès une relation linéaire significative entre LH et VEGF dans les reins bovins et porcins. Les résultats sont reproductibles chez deux espèces différentes. L'étude fournit des preuves à l'appui que l'utilisation d'extraits de rein de vaches et de porcs sont une ressource excellente, économique et abondante pour l'étude de la physiologie rénale, en particulier pour examiner la corrélation entre veGF et d'autres analytes.
Introduction
Le facteur de croissance endothéliale vasculaire A (VEGF-A), aide à réguler l'angiogenèse et la perméabilité vasculaire dans le rein et d'autres organes1,2 (ci-après, VEGF-A sera appelé VEGF). Les niveaux de VEGF dans le rein sont sous contrôle homéostatique serré. Lorsque les niveaux rénaux de VEGF sont élevés ou déprimés, le rein peut dysfonctionnement. Par exemple, dans les 3 semaines suivant la naissance, les souris avec l'hétérozygosity podocyte-spécifique pour VEGF développent l'endotheliosis et le glomeruli sans sang (c.-à-d., lésions rénales vues dans la preeclampsia humaine), et l'échec rénal de phase finale se produit dans ces heterozygotes par 3 mois d'âge. Les ko homozygotiques spécifiques aux podocytes meurent d'hydrops et d'insuffisance rénale dans un délai de 1 jour après la naissance3,4.
D'autre part, la surexpression de VEGF rénal provoque la protéinurie et l'hypertrophie glomerulaire3,4. Par exemple, les lapins transgéniques qui surexpriment veGF présentent des proteinuria progressives avec des taux de filtration glomerulaires accrus aux premiers stades de la néphropathie, suivis d'une diminution des taux de filtration glomerulaire s'est accentué aux stades plus avancés3. La néphropathie diabétique, une cause majeure de la maladie rénale de phase finale dans les adultes diabétiques, est fortement associée à la dysregulation de VEGF2,5. Une grande attention a été accordée au rôle de l'hypoxie dans l'induire l'expression de VEGF dans des conditions pathologiques5. Cependant, les facteurs régissant le VEGF dans des conditions physiologiques (tant dans le rein que dans d'autres organes) ne sont pas bien compris2,6. L'identification de ces facteurs (à l'exception de l'oxygène) qui sont impliqués dans la régulation physiologique et pathologique du VEGF est une entreprise importante.
L'hormone lutéinisante (LH), une hormone pro-angiogénique, aide à réguler l'expression physiologique de VEGF dans les organes reproducteurs tels que l'ovaire et le testicule7,8. Des études antérieures ont fourni des preuves que LH aide également à réguler VEGF dans les organes non reproductifs, tels que les yeux6,9,10. Les récepteurs de LH se trouvent dans la médulle et le cortex du rein11,12. A noter, les cellules épithéliales tubulaires rénales, ainsi que le récepteur LH, expriment VEGF11,12,13,14. Prenant ces deux observations ensemble, nous avons supposé que LH aide également à réguler l'expression VEGF dans le rein13,14. Pour fournir l'évidence de cette relation de LH/VEGF, le protocole présenté vise à montrer que les niveaux de LH sont capables de prévoir des niveaux de VEGF dans le rein. De nombreuses enquêtes antérieures sur le VEGF concernant le rein ont utilisé des modèles de mammifères d'ordre inférieur (c.-à-d. rongeurs et lapins)2. Pour traduire ce travail sur le corps humain, l'étude examine la relation entre le VEGF et le LH chez les mammifères de plus haut niveau (ici, les modèles bovins et porcins). Pour atteindre cet objectif, le lysate protéique total a été préparé à partir de la région du cortex des reins bovins et porcins.
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Protocol
Aucun animal vivant ou expérimental n'a été utilisé pour cette étude.
1. Manipulation des tissus
- Procurez-vous des reins entiers bovins et porcins immédiatement après l'abattage d'un abattoir. Transport sur glace jusqu'au laboratoire.
- À l'arrivée au laboratoire, rincer les reins avec 50 ml de phosphate glacé tamponné saline (PBS). Répétez cette étape 2x pour enlever complètement le sang.
- Conserver les reins sur la glace (ou réfrigéré) jusqu'à l'extraction ultérieure.
2. Dissection des reins
- Utilisez des ciseaux stériles, des forceps, un couteau et des plats Petri pour disséquer les reins et exciser la portion tissulaire requise.
- Préparer le tampon de lyse RIPA avant la dissection rénale. Dissoudre 5 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M Tris (pH 8,0), NP-40 (ID - GEPAL CA-630), 10% de désoxycholate de sodium, et 10% DeDS dans de l'eau double distillée, puis bien mélanger. Réfrigérer le tampon de lyse RIPA lorsqu'il n'est pas utilisé.
- Couper doucement le rein en deux (plan sagittal) et couper un morceau de tissu (50-70 mm2) de la région du cortex au centre du rein (pesant 80-100 mg par poids humide).
- Émincer le bloc de tissu en petits morceaux avec un couteau pour aider le processus d'homogénéisation.
- Après avoir mis élagué les tissus, les transférer dans un tube de microfuge avec 1 ml de tampon d'extraction de lyse RIPA glacé. Placer les tubes dans la glace jusqu'à l'extraction ultérieure.
3. Homogénéisation des tissus
- Étiqueter les tubes de microfuge avec des détails d'échantillon spécifiques pour la collecte des supernatants tissulaires.
- À l'aide d'un homogénéisateur portatif à l'aide d'une sonde stérile, puis homogénéiser les tissus pendant 1-2 min dans des conditions froides (échantillons sur le seau à glace) jusqu'à ce qu'aucun morceau de tissu ne soit visible.
- Soumettre les extraits de tissu immédiatement pour la centrifugation dans la centrifugeuse réfrigérée à 9 600 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Retirer les tubes de la centrifugeuse et les placer sur le seau à glace.
- Recueillir le supernatant dans un nouveau tube de microfuge étiqueté et stocker sur la glace. Jeter la boulette.
- Préparer des aliquots distincts des supernatants pour les essais immunosorbent liés à l'hilité Etide (ELISA) et l'analyse totale des protéines , respectivement, afin d'éviter les cycles de gel et de dégel.
4. Bovine et Porcine LH ELISA Esay
- Conservez tous les composants d'analyse ELISA inclus dans le kit ELISA (LH) de l'hormone lutéinisante disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux)à 2-8 oC. Cela comprend l'anticorps, HRP-conjugué, plaque d'assay (96 bien), calibrateurs, tampon de lavage (20x concentré), substrat A, substrat B, et solution d'arrêt. Préparer tous les réactifs comme recommandé par les instructions du fabricant.
- Avant de commencer l'assidu, apportez tous les réactifs et la plaque d'astodonte à la température ambiante (RT). Utilisez le nombre requis de puits pour l'assouglement, le joint et gardez les puits inutilisés à 4 oC jusqu'à l'utilisation.
- Diluer le tampon de lavage (15 ml de concentré de 20x) à 300 ml avec de l'eau à double distillation
- Configurez les puits vierges sans aucune solution.
- Ajoutez 50 ll de norme ou d'échantillon à chaque puits (n '2), puis ajoutez 50 l de peroxidase de raifort (hrp)-conjugué à chaque puits. Ajoutez immédiatement 50 l de solution d'anticorps à chaque puits. Sceller l'assiette, bien mélanger et incuber pendant 1 h à 37 oC.
- Laver les puits à l'œil de 1x tampon de lavage (200 l/puits) et répéter 4x.
- Ajouter 50 l de substrat A et 50 l de substrat B à chaque puits, et bien mélanger en tapant doucement sur la plaque sur le côté. Sceller l'assiette et incuber pendant 15 min à 37 oC dans l'obscurité pendant 15 min.
- Ajoutez 50 ll de solution d'arrêt à chaque puits, appuyez doucement sur la plaque et lisez la plaque à l'aide du spectrophotomètre réglé sur une longueur d'onde de 450 nm.
- Normaliser les niveaux de LH bovine et porcine en protéines totales (voir la section 6).
5. Bovine et Porcine VEGF-A ELISA Esay
- Conservez tous les composants d'analyse ELISA inclus dans les kits ELISA (facteur de croissance endothéliale vasculaire disponible dans le commerce) (voir Tableau des matériaux)à 2-8 oC. Cela comprend l'anticorps, HRP-conjugué, plaque d'assay (96 bien), calibrateurs, tampon de lavage (20x concentré), substrat A, substrat B, et solution d'arrêt. Préparer tous les réactifs comme recommandé par les instructions du fabricant.
- Avant de commencer l'assidu, apportez tous les réactifs et la plaque d'astodonte à RT. Utilisez le nombre requis de puits pour l'assouglement, le joint, et gardez les puits inutilisés à 4 oC jusqu'à l'utilisation.
- Diluer le tampon de lavage (15 ml de concentré de 20x) à 300 ml avec de l'eau à double distillation
- Ajouter 100 l'échantillon ou l'échantillon à chaque puits (n '2). Sceller l'assiette, bien mélanger et incuber pendant 2 h à 37 oC.
- Retirer le liquide dans chaque puits et ajouter 100 l de réagent de détection A à chaque puits, sceller la plaque, et couver pendant 1 h à 37 oC.
- Laver les puits à l'œil de tampon de lavage 1x (400 l/puits) et répéter 4x.
- Ajouter 100 l de réagent de détection B à chaque puits et bien mélanger en tapant doucement sur la plaque sur le côté. Sceller la plaque et la couver pendant 1 h à 37 oC.
- Laver les puits à l'œil de tampon de lavage 1x (400 l/puits) et répéter 4x.
- Ajouter 90 l de solution de substrat à chaque puits, tapoter doucement la plaque, et couver pendant 1 h à 37 oC.
- Ajoutez 50 ll de solution d'arrêt à chaque puits, appuyez doucement sur la plaque et lisez la plaque à l'aide du spectrophotomètre réglé sur une longueur d'onde de 450 nm.
- Normaliser les concentrations de VEGF-A bovines et porcines en protéines totales (section 6).
6. Estimation totale des protéines
- Estimer la protéine totale des extraits de rein bovin et porcin par test standard d'albumine de sérum bovin (BSA) à l'aide d'un kit commercial (voir tableau des matériaux) selon les recommandations du fabricant.
7. Analyse statistique
- Calculez l'écart moyen, médian et standard de chaque analyte.
- Testez la divergence de la distribution de l'échantillon par rapport à l'utilisation normale du test Kolmogorov-Smirnov pour décider, sur utilisation, entre paramétrique et. tests statistiques non paramétriques. Si les données sont normalement distribuées, effectuez des tests statistiques par des tests paramétriques.
- Dans des circonstances appropriées (comme la distribution normale des données), utilisez des modèles de régression pour examiner la relation linéaire entre LH et VEGF-A.
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Representative Results
Les niveaux moyen et médians de LH et de VEGF par type d'animal et par sexe sont indiqués dans le tableau 1. Après vérification de la normalité des données par Kolmogorov-Smirnov Test de la normalité, des modèles de régression linéaire ont été utilisés pour examiner la relation entre LH et VEGF. LH s'est avéré être un prédicteur fort et significatif de VEGF dans les reins bovins et porcins (modèle bovin de rein : n ' 7, R2 - 0,86, p - 0,002 ; modèle porcin de rein : n ' 7 ; R2 à 0,66, p 0,025).
La relation linéaire LH/VEGF est illustrée dans la figure 1 (modèle de régression bovine) et la figure 2 (modèle de régression porcine). L'équation linéaire bovine est la suivante : niveau VEGF de 2,156 x niveau LH à 68,75. L'équation linéaire porcine est la suivante : niveau VEGF 196,7 x niveaux de LH 47,94.
| Type d'échantillon | Mâles | Femelles | Tous |
| Reins bovins | n '4 | n 3 | n 7 |
| LH (mIU/mg protéines totales) | Moyenne: 27.47 (SD 13.3) | Moyenne: 19.5 (SD 2.1) | Moyenne: 24.06 (SD 10.8) |
| Médiane: 25.7 | Médiane: 19.9 | Médiane: 19.9 | |
| VEGF (protéines totales de pg/mg) | Moyenne: 126.2 (SD 25.8) | Moyenne: 106.0 (SD 14.5) | Moyenne: 120.6 (SD 25.1) |
| Médiane: 131.6 | Médiane: 103.5 | Médiane: 110.8 | |
| Reins porcins | n '4 | n 3 | n 7 |
| LH (mIU/mg protéines totales) | Moyenne: 13.2 (SD 3.6) | Moyenne: 12.3 (SD 5.5) | Moyenne: 12.8 (SD 4.5) |
| Médiane: 13.6 | Médiane: 10.3 | Médiane: 11.2 | |
| VEGF (protéines totales de pg/mg) | Moyenne: 2987.2 (SD 772.5) | Moyenne: 2354.1 (SD 932.4) | Moyenne: 2715.9 (SD 901.0) |
| Médiane: 3324.67 | Médiane: 2377.3 | Médiane: 3226.4 |
Tableau 1 : Niveaux moyen et médians de LH et de VEGF selon le type d'animal et le sexe.
Figure 1 : Relation linéaire LH/VEGF chez les reins bovins adultes (n . 7). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Relation linéaire LH/VEGF chez les reins porcins adultes (n . 7). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'aveux des reins de l'abattoir immédiatement après la mort animale est la clé du succès de cette méthodologie. C'est le principal avantage d'utiliser des organes de vaches et de porcs au lieu de cadavres humains. Il y a habituellement au moins un retard de 12-24 h à partir du moment de la mort jusqu'à ce que les organes humains de cadavre soient achetés. Puisque la composition chimique des organes corporels change de manière significative dans 2 h post-mortem15,16, VEGF-études dans les reins de cadavre humain peut ne pas refléter des circonstances réelles. Bien que le protocole souligne grandement l'importance de l'approvisionnement immédiat et du placement d'organes animaux sur la glace après l'extraction, on ne sait pas si d'autres chercheurs accordent également la priorité à cette étape. Par exemple, la section méthodologique d'une étude récente (utilisation des reins bovins et porcins pour la détection des résidus d'antibiotiques) n'a pas précisé le délai entre la mort animale et l'approvisionnement/réfrigération des organes17.
Cette étude mesure les analytes d'intérêt (VEGF et LH) avec des ELISA disponibles dans le commerce et spécifiques aux espèces. Les ELISA sont très sensibles, simples à effectuer des essais avec, et donnent des résultats robustes18. Une étape critique dans le protocole est la normalisation des niveaux d'analytes (mesurés par ELISA) par protéine totale. L'extrait de rein cortical est une substance biologique très hétérogène. À la lumière de cela, un facteur de correction est essentiel afin que les niveaux d'analytes peuvent être comparés entre les animaux. Ainsi, normalisée par la protéine totale a été exécutée, puisque nous et d'autres avons réussi à normaliser d'autres substances biologiques hétérogènes (c.-à-d., urine, taches de sang séchées, et fluide vitreux) de la même manière9,19,20.
Une étude antérieure a montré que la corrélation entre LH et VEGF dans le liquide vitré (des yeux bovins et porcins) ne se manifeste qu'après la normalisation par la protéine totale6. Fait important, cette étape de normalisation est souvent omise dans les études publiées du VEGF, en particulier dans celles impliquant des essais ELISA. Au lieu de cela, les niveaux de VEGF sont souvent exprimés dans des unités telles que le picogramme par millilitre (et non pas comme picogramme par milligramme de protéine totale). Par exemple, aucune des mesures veGF vitrées dans neuf études différentes de l'ELISA (qui ont été incluses dans un article d'examen veGF vitré) n'a été normalisée par une méthode de correction21,22. Cette absence de normalisation du VEGF dans les études ELISA peut expliquer en partie pourquoi le VEGF n'a pas encore été vérifié comme biomarqueur valide21,22.
Malgré la taille limitée de l'échantillon des données représentatives (bovine, n ' 7; porcine, n - 7), ce protocole démontre une relation linéaire forte et significative entre l'HL et le VEGF chez les reins bovins et porcins. Cela dit, il n'y avait pas une taille d'échantillon assez grande pour effectuer des analyses multivariées ajustées en fonction du sexe. Nous avons l'intention de répéter cette étude avec des échantillons plus grands afin que de telles analyses puissent être effectuées. Néanmoins, les résultats présentés soutiennent l'association potentielle entre LH et VEGF dans le rein de mammifères.
On s'attend à ce que ce travail aidera à approfondir la compréhension de la régulation homéostatique de VEGF dans le rein. La qualité de cette méthodologie et la robustesse des résultats sont illustrées par la reproductibilité des résultats chez deux espèces différentes. Étant donné que les animaux destinés à la production de viande sont sains, l'utilisation d'extraits de rein provenant d'animaux d'abattoir est principalement destinée à l'étude de la physiologie; cependant, leurs organes sont moins utiles pour étudier la pathologie, qui est la principale limitation de leur utilisation. Dans l'ensemble, l'utilisation d'extraits rénaux de vaches et de porcs sont une excellente ressource économique et abondante pour l'étude des reins adultes normaux. Enfin, le protocole démontre l'efficacité de l'utilisation de protéines totales pour la normalisation, en particulier lors de l'examen des corrélations entre VEGF et d'autres analytes.
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Disclosures
Zietchick Research Institute (ZRI) est un institut de recherche privé (à but lucratif), et le Dr Tammy Movsas (fondateur et directeur de ZRI) a une demande de brevet en instance et des brevets validés pour l'utilisation d'antagonistes de la gonadotropine dans le traitement des maladies oculaires et le diabète. En plus d'être un employé (biochimiste) à ZRI, le Dr A. Muthusamy n'a pas d'autres conflits financiers à signaler. A. Arivalagan (stagiaire d'été à L'IRZ, étudiant de premier cycle à l'Université du Michigan) n'a pas d'autres conflits financiers à signaler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Scholl's Slaughterhouse (Blissfield, MI) d'avoir fourni les reins bovins et porcins. Aucune subvention n'a été utilisée pour cette étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
References
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