Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hög noggrannhet korrigering av 3D kromatiska förändringar i en ålder av super-resolution biologisk avbildning med chromagnon

Published: June 16, 2020 doi: 10.3791/60800
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 1,2
1Advanced ICT Research Institute Kobe, National Institute of Information and Communications Technology, 2Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 3Micron Advanced Bioimaging Unit, Department of Biochemistry, University of Oxford

Summary

Korrigering av kromatiska förändringar i tredimensionella (3D) flerfärgsfluorescensmikroskopibilder är avgörande för kvantitativa dataanalyser. Detta protokoll är utvecklat för att mäta och korrigera kromatiska förändringar i biologiska prover genom förvärv av lämpliga referensbilder och bearbetning med öppen källkod, Chromagnon.

Abstract

Kvantitativ multicolor fluorescensmikroskopi bygger på noggrann rumslig matchning av färgkanaler som förvärvats vid olika våglängder. På grund av kromatisk aberration och den ofullkomliga anpassningen av kameror, kan bilder som förvärvats i varje kanal flyttas och förstoras, samt roteras i förhållande till varandra i någon av de tre dimensionerna. Med den klassiska kalibreringsmetoden mäts kromatiska skiftningar med flerfärgade pärlor som är fästa vid ytan av ett täckspak, och ett antal program finns tillgängliga för att mäta de kromatiska förskjutningar från sådana kalibreringsprover. Kromatisk aberration kan dock variera med djup, förändras med observationsförhållanden och framkallas genom själva det biologiska provet, vilket hindrar bestämningen av den verkliga mängden kromatiska förskjutningar i urvalet av intresse och över volymen. Att korrigera kromatiska skift med högre noggrannhet är särskilt relevant för superupplösningsmikroskopi där endast små kromatiska skift kan påverka kvantitativa analyser och ändra tolkningen av flerfärgsbilder. Vi har utvecklat en programvara med öppen källkod Chromagnon och tillhörande metoder för att mäta och korrigera 3D-kromatiska förändringar i biologiska prover. Här tillhandahåller vi ett detaljerat programprotokoll som innehåller särskilda krav för provberedning, datainsamling och programvarubearbetning för att mäta kromatiska förändringar i biologiska prover av intresse.

Introduction

Multicolor imaging är en av de grundläggande aspekterna av biologisk fluorescensmikroskopi, i de fall där det rumsliga förhållandet mellan olika molekyler eller strukturer är av stort intresse. Kromatisk aberration, en optisk avvikelse av polykromatiskt ljus som orsakas av spridning, ändrar den skenbara positionen för de färgade objekt av intresse. På samma sätt har mikroskop utrustade med flera kameror som ägnas åt att förvärva varje färg mer komplexa kromatiska förändringar på grund av skillnader i optiska element och ofullkomlig anpassning mellan kanalerna. Sådana kromatiska förändringar kan således leda till en felaktig slutsats om inte användaren uttryckligen korrigerar. Även om kromatiska förändringar inte har varit ett stort problem så länge som upplösningen av mikroskopi begränsas av den klassiska upplösningen gränsen, nyligen utveckling av super-upplösning mikroskopi1 har föranlett behovet av mer exakt korrigering av kromatiska förändringar.

Det har varit vanligt att mäta kromatiska skift av mikroskop system med hjälp av en multicolor pärla kalibrering bild2. Den pärlbaserade kalibreringsmetoden är lämplig för mätning av kromatiska skiftningar från mikroskopets hela optik mot täckspakens yta2. Denna metod kan dock inte mäta kromatiska förändringar i de biologiska prov av intresse. Det är viktigt att notera att många biologiska prover är tredimensionella (3D), och de kromatiska förskjutningarna av sådana prover skiljer sig från dem vid täckspakets yta. Dessutom förändras kromatiska skift med bildytor2,3. Vi har mätt kromatiska förändringar i 3D biologiska prover och fann att osäkerheten i kromatiska skift var ofta så mycket som 350 nm av den klassiska multicolor-pärla kalibreringsmetod3. Kromatiska skiften måste därför mätas i biologiska prover på det intressanta djupet och under de bildframställningsförhållanden som används.

Här beskriver vi procedurer för att mäta kromatiska förändringar i biologiska prover och korrigera dessa skift med hjälp av vår programvara, Chromagnon3. För att mäta kromatiska förändringar i biologiska prover använder vår metod två typer av datauppsättningar, en "målbild" och en "referensbild". Den "mål" bilden är en multicolor bild av intresse, till exempel bilder färgade för DNA, kärnkuvert och mikrotubuli. Det är ofta omöjligt att mäta kromatiska förändringar i en sådan bild. Därför behöver vi en "referens" bild som är dedikerade till att mäta de kromatiska förskjutningar i provet. Den enda definitionen av en "referens" bild är en flerfärgsbild av samma objekt. I den meningen är en multicolor pärlor bild också en typ av referensbild. Här beskriver vi tre olika typer av referensbild som används för att mäta kromatiska skiftningar i de biologiska proverna: "överhörning referensbilder", "bright-field reference images" och "biological calibration reference images". Vilken typ av referensbild som ska användas beror på vilken typ av mikroskop som används eller vilken korrigeringsnoggrannhet som krävs enligt tabell 1.

Överhörning Ljust fält Biologisk kalibrering (på en annan bild) Biologisk kalibrering (på samma bild)
Noggrannheten +++ + ++b +++
Enkelhet ++ +++ ++ ++
Tillämplig mikroskopi Brett fält Brett fält Alla Alla
Tillgång till lokal justering + + -C. -C.
a: Antal "+" indikerar ökande betyg. Enda plus är ca 50 nm och tre plus är ca 15 nm i 3D.
b: Noggrannheten beror på hur mycket de variabla bildförhållandena hålls konstanta.
c: Lokal kalibrering mätt med flerfärgade pärlprover kan kombineras enligt beskrivningen i protokollavsnitt 4.

Tabell 1: Parametrar när du väljer typ av referensbilder.

"Överhörning referensbilder" har den högsta korrigeringsnoggrannheten och är relativt enkel att utföra3,,4 (tabell 1). Nackdelen är deras begränsning i mikroskopi applikationer på grund av deras oförmåga att mäta kromatiska förändringar i retningsvägar. För att erhålla sådana bilder bör mikroskopet också vara utrustat med dikroa speglar med flera band och utsläppsfilter som är oberoende styrda från excitationsfilter eller ljuskällor. Lämplig mikroskopi inkluderar konventionell wide-field mikroskopi, single molecule localization microscopy (SMLM) såsom fotoaktiverad lokalisering mikroskopi/ stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (PALM / STORM)5,,6 och expansion mikroskopi7 observeras med bred fält mikroskopi. En överhörning referensbild förvärvas från själva målprovet. Det är en bild av överhörning (genomblödning) fluorescens av ett färgämne som erhållits i alla nödvändiga kanaler. Fluorescensutsläppet utvidgas alltid mot de längre våglängderna, därför är färgämnen med den kortaste utsläppsvåglängden glada över att få överhörning fluorescens i kanaler av längre våglängder. Till exempel, när provet färgas med blått, grönt och rött, bara det blå färgämnet är upphetsad, och emissionsljuset erhålls i de blå, gröna och röda kanalerna. I detta protokoll, DNA färgas med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) användes för att få överhörning fluorescens.

"Referensbilder med ljust fält" är ett enklare och mindre fototoxiskt alternativ till "överhörningsreferensbilder" men är de minst exakta3 (tabell 1). Det här är ljusa fältbilder av målexemplet, som förvärvats i alla färgkanaler som används i målbilden.

"Biologiska kalibreringsreferensbilder" har fördelen av att vara tillämpliga på alla typer av mikroskopi på grund av deras förmåga att mäta kromatiska skiften både i excitations- och utsläppsvägarna3,,8 (tabell 1). Lämplig mikroskopi omfattar bredfältsmikroskopi, konfokalmikroskopi, ljusplåtsmikroskopi, stimulerad utarmning av utsläpp (STED)9, strukturerad belysningmikroskopi (SIM)10, Airyscan/SORA11,12, SMLM observerats med det totala interna reflektionsfluorescensläget (TIRF), Olympus superupplösning (OSR)13och så vidare. En biologisk kalibrering referensbild förvärvas från en kalibrering prov på samma sätt beredd som målprov, men med färgning av en enda struktur med flera färger. Korrigeringsnoggrannheten utmärker upplösningen av de flesta superupplösningsmikroskopi och förbereda ett biologiskt kalibreringsprov kan vara relativt enkelt. En annan fördel är tillgängligheten till "genomsnittliga" flera referensbilder. Även om de enskilda bilderna innehåller dålig information för mätning av kromatiska skift, kan informationsinnehållet ökas genom att medelvärdet av flera bilder i genomsnitt. Noggrannheten beror på hur mycket bildbehandlingsförhållandena hålls konstanta. I detta avseende erhålls bästa prestanda när både mål- och referensprover finns på samma bild, till exempel med hjälp av 8-välklade täckglas (tabell 1, högst till höger). I detta protokoll, aktin färgas med tre färger av falloidin användes som en biologisk kalibrering.

När en referensbild erhålls mäts och korrigeras den kromatiska förskjutningen av vår programvara Chromagnon. Det finns ingen begränsning på numrera av kanaliserar, Z delar upp och tidsramar det Chromagnon kan mäta och korrigera de chromatic förskjutningarna för. Chromagnon mäter kromatiska förändringar i två steg. Det första steget förvärvar de "globala" eller "affine" justeringsparametrarna för översättning i X-, Y-, Z-axlarna, förstoring längs X-, Y-, Z-axlarna och rotationen runt Z-axeln. Beräkningsnoggrannheten för den globala justeringen är ~16 nm i 3D och ~8 nm i 2D. Det andra steget är en valfri 2D iterativ "lokal justering" på projicerade bilder för att få en högre noggrannhet. I den lokala anpassningsprocessen är bilderna indelade i flera regioner och kromatiska förändringar i dessa lokala regioner mäts. Därefter delas regionerna ytterligare och kromatiska skift i underregionerna mäts iterativt tills antalet pixlar i regionen når det minsta antalet pixlar (vanligtvis 60 x 60 pixlar). Den resulterande lokala justeringskartan kombineras med den globala justeringsparametern och tillämpas på målbilden av en elastisk omformning. Efter detta steg förbättras beräkningsnoggrannheten till ~14 nm i 3D och ~6 nm i 2D. Den lokala justeringen är inte lämplig för biologiska kalibreringsreferensbilder eftersom den biologiska strukturen i referensen skiljer sig från den i målet (tabell 1). Därför används endast global justering för biologiska kalibreringsreferensbilder.

De kromatiska skiftena för lokal påbörjar från två källor; mikroskop instrumental lokal distorsion och biologisk strukturell inhomogenitet. Eftersom mikroskop instrumental lokal distorsion är konstant, kan detta mätas från multicolor pärlor referensprov och korrigeras som en fast parameter. Chromagnon kan kombinera mikroskopet instrumental lokal distorsion karta och den globala justering parametrar från biologiska kalibreringar (tabell 1). Med denna metod förväntas den genomsnittliga noggrannheten hos biologisk kalibrering förbättras med ytterligare 1−2 nm.

Här beskriver vi ett protokoll för att korrigera kromatiska förändringar av 3D fluorescensbilder med hjälp av vår programvara Chromagnon, från den enklaste låga änden till högsta noggrannhet. Vi använder immunfärgning av HeLa-celler som ett exempel och observerade dem med hjälp av 3D-wide-field mikroskopi och 3D-SIM. I det första avsnittet beskriver vi hur man förbereder målprover och biologiska kalibreringsprover. Denna del av protokollet bör optimeras för de specifika målen för forskningen. I det andra avsnittet beskriver vi förvärvsmetoderna för tre typer av referensbilder genom mikroskop. Antagandet var att få blå, gröna och röda kanaler, men kanalsammansättning bör ändras av de specifika målen för forskningen och av uppställningarna för mikroskopet. Det spelar ingen roll om mikroskopet är utrustat med en enda kamera eller flera kameror. I det tredje avsnittet beskriver vi hur man kan använda vår programvara för att mäta och korrigera kromatiska förskjutningar av målbilden med hjälp av referensbilder. Slutligen, i det fjärde avsnittet, beskriver vi en metod för att komplettera de biologiska kalibreringsreferensbilderna med hjälp av ett mikroskops instrumentala lokala kalibrering.

Protocol

1. Provberedning

  1. Beredning av ett målprov
    1. Utsäde 2,5 x 105 HeLa celler på en 35 mm glasbotten skålen och odla dem i 2 ml tillväxt medium (Dulbecco modifierade örn medium med L-glutamin och natriumpyruvat kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum [FBS]) vid 37 °C och en CO2 koncentration på 5%. Alternativt utsäde 6 x 104 HeLa celler på en 8-väl kamrar coverglas och odla dem i 0,5 ml tillväxt medium vid 37 °C och en CO2 koncentration av 5%. Använd #1,5 täckglas (med tjocklek på 0,170 mm) för högupplöst mikroskopi.
      OBS: Använd 1/4 volymer för de 8 väl kammarade täckglasen för ytterligare steg utom steg 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.11 och 1.2.5 där volymen är 100 μl oavsett typ av behållare.
    2. Efter ca 24 h inkubation, byt ut lösningen mot 2 ml 3,7% formaldehyd i fosfatbuffertad koksaltlösning (PBS). Efter skonsam blandning, fortsätt att fixa celler i 15 min vid rumstemperatur (RT) på en rotationsplattform.
      VARNING: Arbeta i en rökhuva.
    3. Tvätta celler med 2 ml PBS, 3x vardera i 5−10 min på en rotationsplattform.
      OBS: Följ lokala föreskrifter för att bortskaffa formaldehydavfall.
    4. Permeabilisera celler med 2 ml 0,1% Triton X-100 i PBS i 5 min på en rotationsplattform, följt av tre tvättar med 2 ml PBS, vardera för 5−10 min på en rotationsplattform.
    5. Inkubera celler i 100 μL av 1% bovinum serum albumin (BSA) i PBS för 1 h vid RT på en rotationsplattform.
    6. Byt ut lösningen mot 100 μL av en blandning av primära antikroppar (antiemetaklonal antikropp14 och anti-tubulin monoklonal antikropp15) i 1% BSA i PBS vid lämpliga spädningar (1/500 för anti-emerin och 1/100 för anti-tubulin) och inkubera över natten vid 4 °C.
    7. Tvätta celler med 2 ml PBS, 3−5x vardera i 10 min på en rotationsplattform.
    8. Byt ut lösningen mot 100 μL av en blandning av sekundära antikroppar (antikanin IgG med Alexa Fluor 488 och anti-mus IgG med Alexa Fluor 555) i 1% BSA i PBS vid 1/500 utspädning och inkubera för 3−4 h vid RT.
    9. Tvätta celler med 2 ml PBS, 3−4x vardera i 5 min på en rotationsplattform.
    10. Byt ut lösningen mot 2 ml 0,5 μg/ml DAPI i PBS för att färga DNA i 30 min vid RT på en rotationsplattform.
      OBS: Istället för DAPI kan Hoechst 33342 vid samma koncentration också användas.
    11. Byt ut lösningen mot ~100 μL monteringsmedium (Tabell över material).
  2. Beredning av ett biologiskt kalibreringsprov
    1. Förbered fasta celler enligt beskrivningen i steg 1.1.1−1.1.4.
      OBS: Helst bereds proverna på ett kamrar täckglas för att placera både mål- och referensproverna i separata kammare på samma täckslip (tabell 1, högst till höger). Denna beredning är att föredra när experimentet kräver den högsta korrigeringsnoggrannheten. När provet behöver beredas på ett vanligt täckslip, använd precisionsskydd med variation med låg tjocklek ("Nr 1.5H") för att försäkra reproducerbarhet.
    2. Bered stamlösningen med fluorescerande färgämneskonjugerat falloidin i 1,5 ml metanol och förvara den vid -20 °C. Blanda falloidinlagerlösning i PBS vid följande utspädning: 1/100 för falloidin med Alexa Fluor 405, 1/1000 för falloidin med Alexa Fluor 488 och 1/200 för falloidin med Alexa Fluor 594.
    3. Byt ut lösningen mot 1 ml phalloidinblandningen som beretts i steg 1.2.2 och inkubera i 30 min vid RT på en rotationsplattform.
    4. Tvätta celler med 2 ml PBS, 3−5x vardera i 10 min på en rotationsplattform.
    5. Byt ut lösningen mot ~100 μL monteringsmedium.
      OBS: Kalibreringsproverna kan förvaras vid 4 °C eller -20 °C för upprepad användning.

2. Förvärv av referensbilder

  1. Överhörning referensbilder
    1. Placera det målprov som tagits fram i steg 1.1 på ett bredfältsmikroskop.
    2. Skaffa en fluorescensbild av målet i blå, gröna och röda kanaler.
      För 3D-bilder kan Z-stegstorleken i referensbilden skilja sig från den i målbilden så länge bildfilen innehåller information för stegstorleken. Z-stegstorleken för referens- och målbilder är företrädesvis mindre än hälften av Z-axelns optiska upplösning, som beräknas med Equation 1 hjälp av en diffraktionsbegränsad mikroskopi, där λ är våglängden i nanometer och NA är mållinsens numeriska bländare. Till exempel, om den axiella upplösningen är 550 nm, använd sedan ett Z-steg mindre än 275 nm. Ingen tidsserie krävs för referensbilden.
    3. Därefter, för att förvärva en fluorescens bild av referensen, välj excitation ljus endast för DAPI, och väljer att förvärva i blå, gröna och röda kanaler. Hämta referensbilden exakt i samma stegposition och Z-höjd, vid en 3D-stack.
      OBS: För längre utsläppsvåglängder krävs ökad belysningsintensitet och exponeringstid.
  2. Referensbilder med ljust fält
    1. Placera det målprov som tagits fram i steg 1.1 på ett bredfältsmikroskop.
    2. Skaffa en fluorescensbild av målet i blå, gröna och röda kanaler.
      OBS: Z-stegstorleken uppfyller företrädesvis Nyquist-kriteriet enligt beskrivningen i steg 2.1.2.
    3. Hämta en ljus fältbild av målet i blå, gröna och röda kanaler exakt i samma stegposition som i 2.2.2 och samma Z-höjd vid en 3D-stack.
  3. Biologiska kalibreringsreferensbilder
    1. Placera målprovet som tagits fram i steg 1.1 på ett 3D-SIM-mikroskop.
    2. Förvärva en fluorescensbild av målet i blå, gröna och röda kanaler med 3D-SIM. Rekonstruera den superuppslöjda bilden.
      OBS: Den typ av mikroskop kan vara av vilken typ som helst som 3D-SIM, confocal, STED, etc. Z stegstorlek uppfyller företrädesvis Nyquist-kriteriet enligt beskrivningen i steg 2.1.2.
    3. Förvärva flera fluorescensbilder av referensen som utarbetats i steg 1.2 i olika stegpositioner som liknar målbilden (steg 2.3.2) med 3D-SIM. Rekonstruera de superuppslöjde bilderna..
      Det totala antalet pixlar i XY måste vara detsamma i alla referensbilder. Stegstorleken i Z måste vara densamma i alla referensbilder. Det totala antalet Z-avsnitt är att föredra att vara samma som i målbilden, men detta är inte ett absolut krav. XY-positionen på scenen för dessa referensbilder spelar ingen roll eftersom positionen eller täcken redan skiljer sig från målprovets position och dessutom skillnaden i kromatiskt skift på ett enda täcksben är mindre än 15 nm3. Bildförhållanden inklusive objektiv lins, observationstemperatur, nedsänkningsolja, hålstorlek i konfokalmikroskopi och lutningsvinkel i höglutande belysningsmikroskopi16, bör alla matcha referensen för bästa prestanda. Om mikroskopet utrustar flera kameror för att förvärva flera kanaler samtidigt, bör referensbilderna förvärvas så ofta som varje vecka för att korrigera den instrumentala driften.

3. Korrigering av kromatiska skift med hjälp av chromagnon programvara

  1. Med hjälp av en webbläsare, gå till https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releasesoch ladda ner den senaste binära versionen av Chromagnon.
    Binära versioner är tillgängliga för Windows, Mac och vissa Linux-versioner.
  2. Extrahera programmet och sätta den körbara filen på en lämplig plats. Dubbelklicka på filen på en Windows eller Mac för att öppna den, annars kör du den binära filen från kommandoraden på ett Linux-system.
    Obs! Figure 1 Programmet kan hindras från att öppnas genom att dubbelklicka för första gången på grund av en säkerhetsorsak. I det här fallet använder du den plattformsberoende metoden för att öppna programmet som hämtats från Internet.

Figure 1
Bild 1: En skärmdump av Chromagnon grafiska användargränssnitt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Dra och släpp referensfilerna i "Referensrutan" (bild 1) eller klicka på Referensfiler (bild 1A)för att öppna en dialogruta för filväljare. Beroende på filformat, om programmet ber att installera en Java Development Kit (JDK), tryck ja och användaren kommer att navigeras till nedladdningssidan. Ladda ner och installera JDK för operativsystemet enligt instruktionerna. Chromagnon bör kunna läsa bildfilformatet efter omstart av programmet.
    Obs: Chromagnon kan läsa de flesta bildfilformat (multipage 'tif', 'czi', 'nd2', 'oib', 'lif', 'dv', etc.). Det ursprungliga mikroskopbildformatet är att föredra i det här steget eftersom metadata kan gå förlorade när ett bildformat konverteras till en tif-fil med flera sidor. Om kanalnamnet visas som 0, 1, 2, etc. i stället för våglängder som 528, 609 (Figur 2A, gröna rutor), då Chromagnon inte vet identiteten på kanalerna i bilden. Se i så fall till att ordningen på kanalerna och pixelstorleken i referensfilen matchar dem i målfilen. Om ordningen på kanalerna i referensen till exempel är grön och röd måste ordningen på kanalerna i målet också vara grön och röd, men inte röd och grön.

Figure 2
Bild 2: Exempel skärmdump för att ladda flera filer. (A)Ett fall där alla referensbilder har motsvarande målbilder. Kanalnamn identifieras korrekt med våglängder (indikeras av en grön ruta) i de bildfiler som används i det här exemplet. (B)Ett fall där en enda referensbild används för att korrigera flera målbilder. (C)Ett fall där flera referensbilder (indikeras av en röd ruta) beräknas i genomsnitt, och den resulterande referensbilden efter genomsnitt används för att korrigera flera målbilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Dra och släpp målfilerna i "Målrutan" (bild 1) eller klicka på Målfiler (bild 1B) för att öppna en filväljaredialogruta.
    Om det finns flera målbilder och var och en av dem har motsvarande referensbilder måste motsvarande referensbild och målbild finnas på samma rad i respektive referens- och målrutor (figur 2A). En enda referensbild kan också användas för att justera flera målbilder (bild 2B).
  2. Markera kryssrutan Beskära marginaler om den inte är markerad (bild 1C).
    Om den här kryssrutan är markerad beskärs marginalerna till följd av justeringen. Markera det här alternativet för allmänt bruk, men avmarkera om en jämförelse på pixelnivå krävs mellan bilder före och efter justeringen.
  3. Välj ett utdatabildformat i alternativlistan (bild 1D).
    De tillgängliga formaten är "tif" (ImageJ17-format), "dv" och "ome.tif". formatet "ome.tif" är endast tillgängligt efter installation av JDK.
  4. Ange suffixet för utdatafilnamnet (figur 1E, standardvärdet är "_ALN"),som läggs till i målfilnamnet.
  5. För överhörning referensbilder med hög signal-brus-förhållande, använd lokal justering från vallistan lokal justering (Figur 1F), välj Projektion för att använda lokal justering och Ingen för att inaktivera den. Använd en minsta fönsterstorlek på 60 (bild 1G).
    Obs!Figure 2A Lokal justering rekommenderas inte för biologiska kalibreringsreferensbilder eftersom lokala kromatiska skift varierar från ett prov till ett annat(tabell 1). Av samma skäl kan en enda lokal justering inte tillämpas på många målbilder (figur 2B). Som ett undantag kan det användas när urvalet av intresse är endast på ytan av täcket, och synfältet är fyllt med ljusa objekt, precis som multicolor fluorescerande pärla prover.
  6. För flera biologiska kalibreringsreferensbilder kontrollerar du alternativet med genomsnittliga referenser ( figur1H) för att mäta en enda justeringsparameter från den genomsnittliga bilden, och parametern för enkel justering tillämpas sedan på alla målbilder (figur 2C). Välj Ingen för Lokal justering ( bild1F).
  7. Klicka på Kör alla (bild 1I)för att starta mätningar; justeringsparametrarna tillämpas på målbilderna.
    OBS: Efter mätning chromatic skift från referensfilerna, gör programmet filer med förlängning "chromagnon.csv" eller "chromagnon.tif". Typen av utdatafil beror på om lokal justering är i kraft (bild 1F). Om justeringen görs utan lokal justering är utgången "chromagnon.csv", medan om lokal justering används, är utgången "chromagnon.tif". Filnamnen är desamma som referensfilen förutom det angivna suffixet (figur 1J,standard är utan suffix) och tillägget ("chromagnon.csv" eller "chromagnon.tif"). En detaljerad beskrivning av justeringsprocessen finns i filen "Chromagnon.log" som skapats i samma mapp.
  8. Vänta tills den korrigerade bilden visas i tittaren (Bild 3).
    Om du drar bilden med musen flyttas bilden och mushjulet ändras zoomen. Flytta skjutreglaget(bild 3A) för att ändra avsnittet Z (och/eller T när det är tillämpligt) för visning. Om visningsprogrammet är för långsamt för att uppdatera en bild klickar du på knappen Läs in hela data i minnet (bild 3B)för att förhindra att den kommer åt data på hårddisken. Om du drar färgrutornas vänstra eller högra kant (bild 3C) kan du styra lägsta eller högsta värden för visning. Om du klickar på knappen för varje kanal (bild 3D) växlar du mellan att visa eller dölja den valda kanalen i visningsprogrammet. Högerklicka på färgrutan(figur 3D)gör det möjligt för användare att välja färger för visning, eller ändra visningsalternativen för färgfältet, och det tillåter också användare att ange de exakta minimi- och maximivärdena för visningsskalning genom att välja "skala till ...". Om du klickar på knappen Ortogonal vy (bild 3E) visas bilderna av ZY- och XZ-vyer. Om du flyttar korslinjerna ändras positionen som visas i sidovyerna.

Figure 3
Bild 3: En skärmdump av bildvisaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Om du vill kontrollera om mätningen utfördes korrekt drar du och släpper referensbilderna i "Referensrutan" och "Målrutan". Kör programmet och kontrollera om bilderna är helt överlappande.
    OBS: När det finns tillgängliga, "chromagnon.csv" eller "chromagnon.tif" filer kan användas som referenser för att hoppa över mätningar. Om den kromatiska förskjutningen i bilden förblir okorrigerad kan du prova lösningar som sammanfattas i tabell 2.
  2. Om du vill komma åt justeringsparametrarna i exemplet, eller när justeringsparametrarna behöver redigeras manuellt, öppnar du "chromagnon.csv"-filer direkt med textredigerare eller kalkylprogram. När den redigeras sparar du den som "csv".
    OBS: Värdena är i pixlar för "tz", "ty", "tx", och i grader för "r", och i förstoringsfaktorer för "mz", "min" och "mx".
    1. Alternativt kan du läsa in filen "chromagnon.csv" eller "chromagnon.tif" i Chromagnonsreferens- eller mållåda(bild 1)och dubbelklicka sedan på den för att öppna justeringsredigeraren (bild 4).
    2. Om du vill se hur mycket en kanal flyttas när parametrarna redigeras drar du och släpper referensbildfilen på det nedre området (bild 4A) för att öppna bilden i redigeraren. När du redigerar värdena i tabellen (bild 4B) och trycker på enter-/returknappen, observera hur bilden av motsvarande kanal rör sig när värdena ändras. Efter redigering, klicka på Spara som ... ( Bild4C) för att spara ändringarna.

Figure 4
Bild 4: En skärmbild av en justeringsparameterredigerare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. För att kontrollera den lokala justeringskartan, ladda "chromagnon.tif" via Chromagnon'sReference eller Target box (Bild 1), och dubbelklicka på den för att öppna justeringsredigeraren (bild 4). Klicka på Visa (bild 4D) om du vill visa det lokala skiftet som indikeras av linjer vars längder förstoras med den faktor som anges i listan över förstoringsval ( bild4E).
    Obs: Genom att ange den "ursprungliga bildfilen" (Bild 4F) mappas skiften tillsammans med den ursprungliga bilden.

4. Generera en mikroskopspecifik lokal justeringskarta

  1. Späd 2 μL flerfärgade fluorescerande pärlor med en diameter på 200 nm i 18 μl etanol.
  2. Vortex lösningen och placera 10 μL av pärla lösning i mitten av en glas botten skålen. Se till att använda #1,5 täckglas (med tjocklek på 0,170 mm) för högupplöst mikroskopi.
  3. Låt skålen på RT torka helt i 1 h.
  4. Placera skålen på ett mikroskop som ska kalibreras och fokusera på fluorescerande pärlor.
  5. Få 2D- eller 3D-bilder med den mikroskopi som ska kalibreras. Hämta flera bilder genom att ändra scenpositionen.
  6. Öppna Chromagnon grafiskt användargränssnitt.
  7. Dra och släpp pärlbildsfilerna i "Referensrutan" (bild 1) eller klicka på Referensfiler (bild 1A)för att öppna en dialogruta för filväljare.
  8. Kontrollera alternativet med genomsnittliga referenser ( bild1H). Välj Projektioni urvalslistan Lokal justering (Bild 1F. Använd en minsta fönsterstorlek på 60 (bild 1G). Klicka på Kör alla (bild 1I)för att starta mätningar.
    OBS: En ".chromagnon.tif"-fil skapas, där mikroskopets lokala justeringskarta lagras.
  9. Efter mätningen klickar du på Extra parametrar (bild 1K). Från rutan Lokal förvrängning av ditt mikroskopinstrument klickar du på alternativlistan och väljer Nytt... för att öppna en dialogruta. Dra och släpp filen "chromagnon.tif" som genereras i steg 4.8 i filnamnsrutan eller klicka på välj filknapp för att öppna en filväljares dialogruta. Ange namnet på mikroskopet och klicka på OK.
  10. När du mäter kromatiska skiftningar från överhörning eller biologiska kalibreringsreferensbilder klickar du på Extra parametrar (bild 1K). Välj namnet på mikroskopet som anges i steg 4.9 från rutan Lokal distorsion av mikroskopinstrument. Klicka på OK.
    Valet av "Lokal förvrängning av ditt mikroskopinstrument" sparas inte när programmet har stängts av.
  11. Fortsätt till kromatisk korrigering utan lokal justering som i avsnitt 3.
    OBS: Det är också möjligt att använda lokal justering utöver mikroskopkalibrering. I detta fall börjar lokal justering med mikroskopkalibrering.

Representative Results

Ett exempel på korrigering av kromatiskt skift med hjälp av en överhörningsreferensbild visas i figur 5. Bilden erhölls med ett brett fältmikroskop utrustat med en enda kamera. Fluorescensutsläpp från DAPI användes som referens (figur 5A,B) för att korrigera de blå, gröna och röda kanalerna. Bilden består av 3 kanaler med 60 Z-skivor, var och en består av 256 x 256 pixlar. Bilderna deconvolved innan man mäter de kromatiska skiften. Mätning av lokala kromatiska skift med Chromagnon tog 51 s på en Mac med Intel Core i7 (quad core, 8-trådar, 2,7 GHz), 16 GB RAM och 1 TB flashlagring. Justeringsparametern tillämpades på målbilden (figur 5C,D), som har exakt samma antal voxels som referensbilden. Förbereda den justerade filen tog 3 s. Som ett resultat av trimning kanten pixlar under justeringsprocessen(gröda marginaler kryssruta i figur 1C),antalet voxels minskades efter justering (Figur 5B, 51 Z segment, 252 x 251 pixlar). DNA i anafasbron (indikerad med pilspetsar) ses felaktigt utanför kärnhöljet före justering (Figur 5C, uppenbart i den nedre panelen som visar XZ-vyn), men som förväntat inuti kuvertet efter justering (figur 5D).

Ett exempel på korrigering av kromatiskt skift med hjälp av en biologisk kalibreringsreferensbild visas i figur 6. Bilderna erhölls med ett SIM-mikroskop utrustat med tre kameror. Tre bilder av HeLa celler färgas med falloidiner konjugerade till blå, grön och röda färgämnen var i genomsnitt (figur 6A). Referensbilden består av 3 kanaler med 76 Z-skivor, som var och en består av 1 024 x 1 024 pixlar. Mätning av kromatiska skift med Chromagnon utan lokal justering krävs 194 s på Mac-systemet som beskrivs ovan. Parametern tillämpades på en målbild som består av 3 kanaler med 73 Z-segment, som var och en består av 1 024 x 1 024 pixlar. Generering av den justerade filen tog 25 s. XZ-vyn visar felaktiga kanalpositioner längs Z:n och något längs X-riktningarna(bild 6A,C),men denna felregistrering korrigerades efter justering (figur 6B,D).

Figure 5
Bild 5: Ett exempel på anpassning till en överhörning referensbild. HeLa celler var färgas med DAPI för DNA (visas i magenta), Alexa Fluor 488 (visas i gult) för nukleära kuvert, och Alexa Fluor 555 (visas i blått) för mikrotubuli. Bilder förvärvades av 3D bredfältsmikroskopi med en enda kamera och deconvolved. (A,B) En representativ överhörning referensbild med DAPI-utsläpp, före och efter justering av Chromagnon. Tre färgkanaler visas som överdragna. (C,D) En optisk del av 3D-stacken i tre kanaler före och efter justeringen. Axiell kromatiska aberration är uppenbar vid anaphase bron visas av pilspetsar. Skalan bommar på panel A indikerar 5 μm för alla paneler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Ett exempel på anpassning till en biologisk kalibreringsreferensbild Bilder förvärvades med 3D-SIM utrustad med tre kameror. (A,B) En referensbild i genomsnitt från tre bilder före(A)och efter(B)justering. HeLa celler var färgas med falloidin konjugerade med Alexa Fluor 405, 488 eller 594. (C,D) Målbilden före (C) och efter(D)justering. HeLa celler var färgas med DAPI för DNA (visas i magenta), Alexa Fluor 488 (visas i gult) för nukleära kuvert, och Alexa Fluor 594 (visas i blått) för mikrotubuli. Skalan bommar på panel A indikerar 5 μm för alla paneler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Förfarandet för kromatisk korrigering är en avvägning mellan noggrannhet och ansträngning. För att spara onödiga ansträngningar, är det bättre att veta hur mycket noggrannhet som krävs för din studie. Den högsta noggrannheten kanske inte krävs för konventionell wide-field (live) imaging, och därför är ljusa fältreferensbilder ofta tillräckliga för att korrigera den kromatiska förskjutningen. På samma sätt, när bildbehandlingstillståndet och miljön är konstant, kommer upprepad användning av en biologisk kalibrering att spara tid. Å andra sidan, om en mycket exakt registrering önskas, högkvalitativa överhörning eller biologisk kalibrering referensbilder är nödvändiga. För bästa prestanda bör referensbilder erhållas med så lika villkor och tidpunkter som målbilderna som möjligt. Så länge både referens- och målbilder erhålls med samma mikroskopi, kommer högre rumslig upplösning att förbättra korrigeringsnoggrannheten. Om deconvolution är tillgänglig för både referens- och målbilder kan det förbättra korrigeringsnoggrannheten genom att genomföra detta innan korrigeringen. För bästa prestanda bör provtagningssatsen för den optiska (Z)-axeln uppfyllas i både referens- och målfilen för exakt subpixelinter interpolation (protokollsteg 2.1.3).

Underlåtenhet att korrigera kromatisk förändring leder till felaktiga slutsatser. Dessutom kan användning av fel kalibrering till och med förvärra kromatiska skiften i stället för att korrigera dem, och detta måste därför undvikas. Vi har sammanfattat de möjliga orsakerna till misslyckanden, och deras gemensamma lösningar, i tabell 2. För att undersöka orsaken till ett fel är det i första hand nödvändigt att visuellt kontrollera om den kromatiska förskjutningen i referensbilden korrigeras exakt (protokollsteg 3.12). De flesta fel beror på referensbildernas kvalitet och avhjälps enkelt enligt beskrivningarna i tabell 2. När det gäller referensbildernas kvalitet är det viktigt att notera att den globala anpassningens noggrannhet minskar om hela synfältet inte är fyllt med provet (figur 7, tabell 2). Jämfört med det goda exemplet som visas i figur 7Ainnehåller det dåliga exemplet i figur 7B endast tre kärnkuvert i den övre vänstra regionen, och Chromagnon misslyckades med att justera en del av denna bild. Detta beror på att den globala anpassningsmetoden för Chromagnon delar upp synfältet i fyra regioner(figur 7C)för att mäta skillnaderna i rotation och förstoring med hög noggrannhet3. Denna metod, om den används korrekt, är en ordning mer exakt än andra linjära metoder såsom logpolär omvandling och simplex metoder3. Om någon av de fyra regionerna inte är tillgängliga, kommer Chromagnon att byta till mindre effektiva linjära metoder. För bästa prestanda är därför exemplen i figur 7B och figur 7C oönskade, och de fyra regionerna bör fyllas med objekt. Användare kan kontrollera om något kvadratiskt område i synfältet inte är tillgängligt för mätning genom att titta på loggfilen ("Chromagnon.log"; se protokollsteg 3.10). Lyckligtvis kan detta problem lätt övervinnas genom att i genomsnitt flera biologiska kalibreringsbilder eller använda lokal justering för överhörning eller ljusa fält referensbilder (Tabell 2). I motsats till om referensbilder inte har korrigerats är det svårare att identifiera underlåtenhet att korrigera målbilder. Eftersom sådana fel uppstår på grund av skillnader i filformat, bildframställningsförhållanden, bildtider, bildåtergivnings-/justeringsmetoder mellan referens- och målbilderna (tabell 2)bör användarna alltid vara försiktiga när de använder referensbilder som erhålls under olika förhållanden/tidpunkter från målbilderna. Några exempel bilder finns tillgängliga för testning(https://github.com/macronucleus/Chromagnon)för att få konkret uppfattning om bra och dåliga exempel bilder.

Problem Orsaka Lösning
Det gick inte att korrigera referensbilden Låg kontrast Hämta om möjligt en bild med högre kontrast. Om en referensbild med ljust fält används, reacquire bilden i en vattenbaserad lösning för att få högre kontrast i cellen. Alternativt kan du prova att tillämpa beräkningsbullereduktion (t.ex. gaussisk filtrering). Stäng av den lokala justeringen, som är känsligare för brus.
Kontaminering av icke-relaterade bilder Ta bort källan till de orelaterade bilderna i exemplet om möjligt. För överhörning referensbilder, kontrollera excitation spektra av de färgämnen som används för målbilder. Om färgämnena är upphetsade under förvärvet av en överhörningsbild (t.ex. Om damm på kamerachipet skapar en uppenbar kanalskillnad rengör du kamerachippet eller använder en beräkningsliknande plattfältsmetod.
En extremt ljuspunkt gjord av en kosmisk strålning Hämta bilden igen om möjligt. Alternativt kan du prova att tillämpa beräkningsbullereduktion (t.ex. filtrering av median eller gaussisk).
Deconvolution artefakter (konstgjorda signaler vid axial och laterala kanter) Trimma kantpixlarna eller Z-avsnitten efter dekontrieringen. Om den ena sidan trimmas bör den andra sidan också trimmas för att behålla bildcentret.
Z-stegstorleken är för gles En Z-stack bör förvärvas för att uppfylla Nyquistkriteriet enligt protokoll 2.1.3.
Optisk avvikelse Sfärisk villfarelse är den största avvikelsen som orsakas av användare. Välj rätt objektiv för provet och använd en täckslipjocklek på 170 μm. Om objektivet är utrustad med en korrigeringsring, justera den för att hitta den position där det högsta fluorescensantalet erhålls från fokus. När det gäller ett oljenedsänkningsmål utan korrigeringsring, justera brytningsindexet för nedsänkningsoljan som ökar fluorescensantalet i fokus.
Synfältet är ofyllt (fig. 7) När det gäller biologiska kalibrering referensbilder, genomsnitt många bilder. När det gäller överhörning eller referensbilder med ljust fält använder du lokal justering.
En oidentifierad programvara bugg Rapportera problemet via GitHub (https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)
Det gick inte att korrigera målbilden Metadata för bildfilen går förlorad Använd det ursprungliga mikroskopfilformatet som innehåller fullständiga metadata och undvik att konvertera till en tiff-fil med flera sidor före bearbetning. Använd samma ordning på kanaler som det står i protokoll 3.3.
Felaktiga justeringsmetoder för den givna mikroskopiet Använd inte den lokala justeringsmetoden när du mäter från biologiska kalibreringsreferensbilder till målbilder. Använd inte andra korshörningsreferensbilder än bredfältsmikroskopi.
Skillnader i bildbehandlingsförhållanden Håll bildförhållandena konstanta mellan referens- och målbilderna enligt protokoll 2.3.3.
Skillnader i urval (inklusive täcket) Använd alltid samma monteringsmedium, täckslip (t.ex. nr 1.5H) och ett liknande fokusdjup.
Mikroskop drift sedan kalibreringen gjordes senast Gör en kalibrering lika ofta som varannan vecka. Håll temperaturen konstant, och använd ett flytande bord för att undvika hårdvarudrift av mikroskopet.

Tabell 2: Felsökning för kromatisk korrigering.

Figure 7
Bild 7: Exempel på referensbilder. Kärn- kuvert i fissionjästceller märkta med GFP och mCherry. Bilder förvärvades med konventionella wide-field mikroskopi. Kromatiska skift korrigerades med Chromagnon utan lokal justering med hjälp av bilderna själva som referensbilder. Bilderna deconvolveds sedan för att visa detaljerna. (A) Ett bra exempel med många objekt i synfältet. (B) Ett dåligt exempel med objekt endast i det övre vänstra hörnet. Feljustering är uppenbart på en viss region av bilden. (C) Ett oönskat exempel där en av quadrisection (åtskilda av prickade tvärrlinjer) är tom. Skalan på panel A anger 5 μm för hela fältvyn och 1,25 μm för den förstorade vyn och gäller för alla paneler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I det här protokollet beskrev vi tre olika referenstyper (tabell 1). Bland dem, överhörning referensbilder och biologisk kalibrering referensbilder behöver ytterligare noggrann diskussion. För överhörning referensbilder, prover färgas med DAPI eller Hoechst 33342, och monteras i glycerol eller kommersiella monteringsmedia kan effektivt användas för att anpassa den blå, grön och röda kanaler. På samma sätt kan Alexa Fluor 488 användas för att anpassa de gröna och röda kanalerna. Emellertid, erhålla överhörning fluorescens är ofta svårt eftersom många blå färgämnen utom DAPI och Hoechst är dimmer och sönderfall snabbare än de flesta gröna och röda färgämnen. Dessutom är utsläppsspektrat för moderna färgämnen smalare, vilket gör att anpassningen av mer än tre kanaler med denna metod utmanar. Uppmärksamhet bör också ägnas åt några vanliga röda färgämnen (t.ex. Alexa Mjöl 568 och 594, men inte Alexa Fluor 555) som kan vara upphetsad av violett ljus, som förhindrar att erhålla hög kontrast överhörning bilder från blå färgämnen. En annan nackdel är att denna metod inte kan mäta den kromatiska villfarelsen av excitationsljusbanor i flerfärgsupptring, eftersom endast en enda excitationvåglängd används för excitation (tabell 1). Eftersom de flesta avancerade mikroskopi använder förändrad belysning optik, är tillämpningen av denna metod begränsad. Ändå är dess högre korrigering noggrannhet tillräckligt fördelaktigt för att det ska beskrivas i detta protokoll. I allmänhet bör en överhörning bild tas efter en målbild för att förhindra blekning eller fototoxiska effekter. För SMLM som observeras med bredbandsläget bör en referensbild förvärvas innan en målbild förvärvas, eftersom fluorescensfärgämnen kan blekas vid avbildning.

Biologiska kalibrering referensbilder tillåter användare att enkelt anpassa önskat antal kanaler på bekostnad av ytterligare provberedning. En annan fördel med biologisk kalibrering referensbilder är tillgången på "genomsnitt" flera referenser som hjälper till att fylla alla synfält. Denna metod kan lida av skillnader i bildframställningsförhållanden om kalibreringsprovet bereds på en annan bild. Det mesta av detta problem kan lösas om både mål och referenser bereds på samma bild med hjälp av kommersiella kammarlockglas (tabell 1), och andra bildförhållanden hålls konstanta som i protokollsteg 2.3.3. I detta fall kan en korrigeringsnoggrannhet som liknar den för överhörningsreferensbilder förväntas3. Protokollet att använda falloidin som visas här är ett av de enklaste sätten att färga en enda cellulär struktur med flera färger. Det finns många möjliga scenarier för att förbereda biologiska kalibreringsprover. För immunfärgning kan ett prov märkas med en enda primär antikropp följt av färgning med sekundära antikroppar i flera färger. På så sätt kan en enda målstruktur märkas med flera färger. Alternativt, 5-etynyl-2'-deoxyuridin, detekteras av "klick" kemi etiketter nyligen syntetiserade DNA i flera färger med hög densitet, som beskrivs i detalj tidigare8. För levande celler är det användbart att förbereda en transgen stam som hyser två kopior av en gen som är smält till GFP eller mCherry att märka samma struktur med två färger. Om genens kopieringsnummer är kritiskt så ofta som det observeras för membranproteiner, kan en enda kopia av genen fixeras tandemly till GFP och mCherry (figur 7). Fotokonverterbara fluorescerande proteiner, såsom mEOS218, kan också användas genom att belysa en måttlig nivå av violett ljus för att erhålla både proteinarter med eller utan fotokonvertering. Under låga syreförhållanden kan GFP också användas som ett fotokonverterbart protein från grönt till rött19,20. Att välja rätt kalibreringsprov kommer därmed att göra experimentet mer robust.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av JSPS KAKENHI Grant Numbers JP19H03202 till A.M., JP18H05528 och JP17H03636 till T.H., och JP17H01444 och JP18H05533 till H.Y. L.S. bekräftar stödet från Welcome Trust Strategic Awards 091911 och 107457/Z/15/Z finansiering avancerad bildbehandling vid Micron Oxford.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% formaldehyde solution Polyscience 18814-10
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C
Alexa Fluor 405 phalloidin Thermo Fisher Scientific A30104
Alexa Fluor 488 phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 594 phalloidin Thermo Fisher Scientific A12381
Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16170078
Coverslip Matsunami No. 1S HT
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
Dulbecco’s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate Nacalai Tesque 08458-16
Mounting medium (VECTASHIELD) Vector Laboratories H-1000
Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1) Described in Ref 15.
Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well) Thermo Fisher Scientific 155409
Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1) A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased.
Secondary antibody with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11034
Secondary antibody with Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific A-21424
Secondary antibody with Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A-11032
TetraSpeck Microspheres, 0.2 µm Thermo Fisher Scientific T7280

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  2. Manders, E. M. M. Chromatic shift in multicolour confocal microscopy. Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).
  3. Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 7583 (2018).
  4. Grünwald, D., Singer, R. H. In vivo imaging of labelled endogenous β-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport. Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).
  5. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  7. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  8. Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).
  9. Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  10. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  11. Schulz, O., et al. Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).
  12. Müller, C. B., Enderlein, J. Image Scanning Microscopy. Physical Review Letters. 104 (19), 198101 (1981).
  13. Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
  14. Yorifuji, H., et al. Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane. Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).
  15. Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies. Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).
  16. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  17. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  18. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  19. Sawin, K. E., Nurse, P. Photoactivation of green fluorescent protein. Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).
  20. Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. Photoactivation turns green fluorescent protein red. Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).

Tags

Biologi kromatisk aberration fluorescensmikroskopi superupplösningsavbildning colocalization-analys cellbiologi bildbehandling
Hög noggrannhet korrigering av 3D kromatiska förändringar i en ålder av super-resolution biologisk avbildning med <em>chromagnon</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matsuda, A., Koujin, T.,… More

Matsuda, A., Koujin, T., Schermelleh, L., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon. J. Vis. Exp. (160), e60800, doi:10.3791/60800 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter