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Bioengineering

High-Throughput Identifikation der Resistenz gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate in Tomaten mit Seedling Flood Assay

Published: March 10, 2020 doi: 10.3791/60805
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, United States Department of Agriculture

ERRATUM NOTICE

Summary

Der Sämlingsfluttest erleichtert die schnelle Überprüfung von Wildtomaten-Beitritten auf die Resistenz gegen das Pseudomonas syringae Bakterium. Dieser Assay, der in Verbindung mit dem bakteriellen Wachstumstest verwendet wird, kann bei der weiteren Charakterisierung der zugrunde liegenden Resistenz gegen das Bakterium helfen und kann verwendet werden, um Kartierungspopulationen zu untersuchen, um die genetische Grundlage des Widerstands zu bestimmen.

Abstract

Tomate ist eine agronomisch wichtige Pflanze, die von Pseudomonas syringaeinfiziert werden kann, einem gramnegativen Bakterium, das zu einer bakteriellen Speckerkrankung führt. Die Tomaten-P. syringae pv. Tomatenpathosystem ist weit verbreitet, um die genetische Grundlage der pflanzenanten Reaktionen und Krankheitsresistenz zu sezieren. Während Die Krankheit über viele Jahrzehnte erfolgreich durch die Einführung des Pto/Prf-Genclusters aus Solanum pimpinellifolium in kultivierte Tomaten gemanagt wurde, haben sich Rassen-1-Stämme von P. Syringae entwickelt, um Resistenzen des Pto/Prf-Genclusters zu überwinden und weltweit vorzufinden.

Wilde Tomatenarten sind wichtige Reservoirs natürlicher Vielfalt bei der Erkennung von Krankheitserregern, da sie sich in verschiedenen Umgebungen mit unterschiedlichen Krankheitserregerdrücken entwickelt haben. In typischen Siebeinwänden zur Krankheitsresistenz in Wildtomaten kommen erwachsene Pflanzen zum Einsatz, die aufgrund ihrer verlängerten Wachstumszeit und des größeren Wachstumsraumbedarfs die Anzahl der Pflanzen begrenzen können, die gesiebt werden können. Wir haben eine Methode entwickelt, um 10 Tage alte Tomatensämlinge auf Resistenz zu prüfen, die die Pflanzenwachstumszeit und den Wachstumsraum minimiert, einen schnellen Umbruch von Pflanzen ermöglicht und große Probengrößen testen lässt. Die Samenergebnisse des Überlebens oder des Todes können als diskrete Phänotypen oder auf einer Resistenzskala behandelt werden, die durch die Menge des neuen Wachstums bei überlebenden Sämlingen nach Überschwemmungen definiert wird. Diese Methode wurde optimiert, um 10 Tage alte Tomatensämlinge auf Widerstand gegen zwei P. syringae-Stämme zu überprüfen und kann leicht an andere P. syringae-Stämme angepasst werden.

Introduction

Pseudomonas syringae ist ein gramnegatives pathogenes Bakterium, das eine breite Palette von Pflanzenwirten infiziert. Bakterien gelangen durch die Stomata oder physikalische Wunden in die Wirtspflanze und vermehren sich im Apoplast1. Pflanzen haben eine zweistufige Immunantwort entwickelt, um vor Infektionen durch bakterielle Krankheitserreger zu schützen. Die erste Ebene tritt an der Pflanzenzelloberfläche auf, wo Mustererkennungsrezeptoren auf der Pflanzenzellmembran hochkonservierte pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) in einem Prozess namens PAMP-triggered immunity (PTI)2wahrnehmen. Während dieses Prozesses reguliert die Wirtsanlage die Abwehrwege, einschließlich der Ablagerung von Callose an die Zellwand, dem Verschluss von Stomata, der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und der Induktion pathogenesebezogener Gene.

Bakterien können PTI überwinden, indem sie ein Sekretionssystem des Typs III verwenden, um Proteine, sogenannte Effektoren, direkt in die Pflanzenzelle3zu liefern. Effektorproteine zielen häufig auf Komponenten von PTI ab und fördern die Pathogenvirulenz4. Die zweite Stufe der Pflanzenimmunität tritt innerhalb der Pflanzenzelle bei der Erkennung der Effektorproteine auf. Diese Erkennung ist abhängig von Resistenzgenen, die Nukleotid-bindende Stelle leucin-reiche Wiederholungsrezeptoren (NLRs) kodieren. NLRs sind in der Lage, Effektoren entweder direkt zu erkennen oder ihre Aktivität auf einem Virulenzziel oder Lockvogel5zu erkennen. Sie lösen dann eine sekundäre Immunantwort in einem Prozess namens Effektor-ausgelöste Immunität (ETI), die oft mit einer überempfindlichen Reaktion (HR) verbunden ist, eine Form des lokalisierten Zelltodes an der Stelle der Infektion6. Im Gegensatz zur Gen-für-Gen-Resistenz im Zusammenhang mit ETI können Pflanzen eine quantitative Partielleresistenz aufweisen, die vom Beitrag mehrerer Gene abhängt7.

P. syringae pv. Tomate (Pst) ist der Erreger von bakteriellen Flecken auf Tomaten und ist ein anhaltendes landwirtschaftliches Problem. Vorherrschende Stämme im Feld waren typischerweise Pst-Race 0-Stämme, die einen oder beide der Typ-III-Effektoren AvrPto und AvrPtoB ausdrücken. DC3000(PstDC3000) ist ein repräsentativer Race 0-Stamm und ein Modell-Erreger, der bakterielle Flecken in Tomaten verursachen kann. Zur Bekämpfung der bakteriellen Speckkrankheit introgressierten Züchter den Pto [P. syringae pv. tomato]/Prf [Pto resistance and fenthion sensitivity] gen cluster from the wild tomato species Solanum pimpinellifolium into modern cultivars8,9. Das Pto-Gen kodiert eine Serin-Threonin-Proteinkinase, die zusammen mit der Prf NLR eine Resistenz gegen PstDC3000 durch Erkennung der Effektoren AvrPto und AvrPtoB10,11,12,13,14verleiht. Allerdings ist dieser Widerstand wirkungslos gegen aufkommende Race 1-Stämme, die ihre schnelle und aggressive Ausbreitung in den letzten Jahren15,16ermöglichen. Race 1-Stämme umgehen der Erkennung durch den Pto/Prf-Cluster, da AvrPto entweder verloren geht oder in diesen Stämmen mutiert ist und AvrPtoB minimal15,17,18anzusammeln scheint.

Wilde Tomatenpopulationen sind wichtige Reservoirs der natürlichen Variation für Pst-Resistenz und wurden zuvor verwendet, um potenzielle Resistenz loci19,20,21zu identifizieren. Aktuelle Siebe auf Pathogenresistenz nutzen jedoch 4–5 Wochen alte erwachsene Pflanzen20,21. Daher sind sie durch Wachstumszeit, Wachstumskammerraum und relativ kleine Stichprobengrößen begrenzt. Um die Grenzen konventioneller Ansätze auszuräumen, haben wir einen Hochdurchsatz-Tomaten-P.-Syringae-Resistenz-Assay mit 10 Tage alten Tomatensämlingen22entwickelt. Dieser Ansatz bietet mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung erwachsener Pflanzen: nämlich kürzere Wachstumszeit, geringerer Platzbedarf und höherer Durchsatz. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass dieser Ansatz die bei erwachsenen Pflanzen beobachteten Perhänotypen der Krankheitsresistenz getreu rekapituliert22.

In dem in diesem Protokoll beschriebenen Sämling-Fluttest werden Tomatensämlinge 10 Tage lang auf Petrischalen steriler Murashige- und Skoog-Medien (MS) angebaut und dann mit einem Inokulum überflutet, das die von Interesse verwendeten Bakterien und ein Tensid enthält. Nach Überschwemmungen können Sämlinge mittels bakterieller Wachstumstests quantitativ auf Krankheitsresistenz ausgewertet werden. Darüber hinaus kann das Überleben oder der Tod von Sämlingen 7-14 Tage nach der Überflutung als diskreter Resistenz- oder Krankheitsphänotyp fungieren. Dieser Ansatz bietet eine Alternative mit hohem Durchsatz für das Screening einer großen Anzahl von Wildtomaten-Beitritten auf Resistenz gegen Pst Race 1-Stämme, wie Pst-Stamm T1 (PstT1), und kann leicht an andere bakterielle Stämme von Interesse angepasst werden.

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Protocol

1. Vorbereitung und Verwendung des Biosicherheitsschranks

  1. Biosicherheitsschrank mit 70% Ethanol abwischen.
  2. Schließen Sie die Schärpe und schalten Sie das ultraviolette Licht im Biosicherheitsschrank für 15 min ein.
  3. Nach 15 min schalten Sie das ultraviolette Licht im Biosicherheitsschrank aus. Heben Sie die Schärpe an und schalten Sie das Gebläse 15 min ein.
  4. Wischen Sie alle Gegenstände, die im Biosicherheitsschrank verwendet werden sollen, mit 70% Ethanol ab, bevor Sie die Gegenstände in den sterilisierten Schrank legen.
  5. Reinigen Sie Handschuhe oder nackte Hände mit 70% Ethanol, bevor Sie im Biosicherheitsschrank arbeiten.
  6. Arbeiten Sie in der Mitte des Biosicherheitsschranks, weg vom Gebläse.
  7. Verwenden Sie ungeöffnete Flaschen autoklaviert steril10 mM MgCl2 und ultrareine H2O für Experimente. Flaschen in den Biosicherheitsschrank legen und nur im sterilisierten Biosicherheitsschrank öffnen, nicht auf der Tischplatte.
  8. Verwenden Sie spezielle Glaspipetten und Pipettenspitzen für die Arbeit im sterilisierten Biosicherheitsschrank. Stellen Sie sicher, dass diese nur im Biosicherheitsschrank geöffnet werden, niemals auf der Tischplatte.
  9. Nach Verwendung des Biosicherheitsschranks alle Abfälle (außer Bleichabfälle) autoklavieren und die Oberfläche mit 70% Ethanol abwischen.

2. Aufbereitung von Pflanzenmedien

  1. 0,5x MS Basalsalze in reinemH2O wiegen und 0,8% Bacto-Agar auswiegen und dann zu gelösten 0,5x MS hinzufügen.
  2. Autoklav und lassen Sie die Medien in 50 °C Wasserbad für 1 h vor dem Gießen oder Pipetieren abkühlen.
  3. Um sicherzustellen, dass die Platten nicht übergefüllt werden, markieren Sie Polystyrol Einweg sterile 100 x 25 mm Platten auf einen Füllstand von 40 ml. Gießen Sie Medien in 100 x 25 mm sterile Platten in einem sterilisierten Biosicherheitsschrank.

3. Vorbereitung von Pflanzenmaterialien und Wachstumsbedingungen

  1. Tomatensamen in ein 2,2 ml Mikrozentrifugenrohr geben und 2,0 ml 50% Bleichlösung hinzufügen.
  2. Rock die Röhre auf einer Wippe für 25 min.
  3. Nach 25 min die Samen von der Wippe entfernen und die Bleichlösung mit einer Pipette im sterilen Biosicherheitsschrank entfernen. Stellen Sie sicher, dass alle Bleichmittel entfernt sind.
  4. Fügen Sie 2 ml sterile Reinst h2O, um die Samen zu waschen. Invertieren Sie das Rohr 5x.
  5. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem Rohr mit einer Pipette.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 3.3–3.5, um die Samen 4x mehr zu waschen.
  7. 2 ml steriles Reinst-H2O hinzufügen und die Samen in eine leere sterile Petrischale gießen.
  8. Flammenzangen in Ethanol und lassen Sie vor dem Übertragen und gleichmäßigen Abstand Samen auf 100 x 25 mm Platten mit 0,5x MS + 0,8 % Agar-Medien abkühlen.
  9. 5–7 Samen in einer Linie über die Mitte einer Platte übertragen und die Ränder der Platten mit chirurgischem Klebeband (1,25 cm x 9,1 m) versiegeln.
  10. Die sterilisierten Samen bei 4 °C im Dunkeln mindestens 3 Tage lang streuen, um die Keimung zu synchronisieren. Stellen Sie sicher, dass die Platten flach und nach oben gestapelt sind, damit sich die Samen nicht auf dem Teller verschieben.
  11. Vertikal orientieren die Platten, so dass die Wurzeln entlang der Oberfläche der Platte wachsen, mit der Linie der Samen horizontal ausgerichtet, wenn sie auf die Wachstumskammer übertragen.
    ANMERKUNG: Stellen Sie die Wachstumskammer auf 22 °C ein und bieten Sie 16 h Licht bei einer Lichtintensität von 200–220 °E Meter-2 s-1 und 8 h Dunkelheit.
  12. Vor dem Hochwasser wachsen Sämlinge für 10 Tage in der Wachstumskammer, an der Sämlinge in der Regel vollständig entstandene und erweiterte Kotyledonen und entstehende erste wahre Blätter zeigen (Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1: Entwicklungsstadium typischer 10 Tage alter Tomatensämlinge. Rio Grande-PtoR Tomatensamen wurden bei 4 °C für mindestens 3 Tage im Dunkeln sterilisiert, plattiert und geschichtet. Die Sämlinge wurden 10 Tage lang auf 0,5-fachen MS-Platten bei 22 °C angebaut, bevor sie überflutet wurden. Typischerweise werden die Kotyledonen nach 10 Tagen vollständig erweitert, und die ersten wahren Blätter beginnen zu entstehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Vorbereitung der King es B23 (KB) Medien

  1. Becher mit 500 ml Reinst-H2O füllen und auf einer Rührplatte rühren.
  2. 20 g Bacto-Pepton, 1,5 g wasserfreiesK2HPO4und 12,5 ml Glycerin in einem Becher mit Reinst-H2 O vollständig auflösen.
  3. Gießen Sie die gelöste Mischung in einen 1 L abgestuften Zylinder und bringen Sie bis zu einem 1 L Endvolumen mit Ultrareines H2O.
  4. Die Brühe wieder in den Becher gießen und rühren, bis sie gemischt ist.
  5. 7,5 g Bacto-Agar in zwei 500 ml Glasflaschen wiegen und 500 ml KB-Brühe ab Schritt 4,4 in jede Flasche geben. Autoklav für 20 min.
  6. Entfernen Sie die Flaschen aus dem Autoklaven und wirbeln Sie sanft, um den Agar zu verteilen.
  7. Die Flaschen für 1 h in ein 50 °C-Wasserbad geben.
  8. Nach 1 h die Flasche in den Biosicherheitsschrank und unter aseptischen Bedingungen übertragen, 1.600 l sterile 1 M MgSO4und entsprechende Antibiotika in die Medien geben.
    HINWEIS: Verwenden Sie für Rifampicin-resistente Stämme PstDC3000 und PstT1 Rifampicin, das in Dimethylformamid in einer Endkonzentration von 50 g/ml gelöst ist. Verwenden Sie Cycloheximid, das in Ethanol in einer Endkonzentration von 50 g/ml gelöst wird, um Pilzwachstum auf den Platten zu verhindern.
  9. Wirbeln Sie die Medien sanft zu mischen und dann gießen, um den Boden der Platten zu decken.
  10. Mindestens 1 h für die Platten erstarren lassen, bevor sie bei 4 °C auf dem Kopf gelagert werden.

5. Aufrechterhaltung von Bakterienstämmen und Kulturbedingungen

  1. Halten Sie einen Glyzerinbestand aus einer einzigen Bakterienkolonie als 1 ml gesättigte Bakterienkultur und 333 l steriles 80% Glycerin bei -80 °C.
  2. Patchbakterien (z.B. PstT1) von einem Glycerinbestand auf KB-Agar mit geeigneten Antibiotika (Abschnitt 4).
  3. Lassen Sie die Bakterien für 2 Tage bei 28 °C erholen, bevor Sie frische Bakterien mit einem flachen, sterilen Zahnstocher auf selektiven KB-Agar sätten.
  4. Streichen Sie frische Bakterien aus dem Glycerin-Bestand mit einem flachen, sterilen Zahnstocher auf geeignete selektive KB-Agar.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der gepatchte Glycerinbestand nicht älter als 2 Wochen ist.
  5. Für PstDC3000 die KB-Platte bei 28 °C für 24 h inkubieren, bevor Sie Bakterien im Hochwasserexperiment verwenden.
  6. Für PstT1 die KB-Platte bei 28 °C für 48 h inkubieren, bevor Sie Bakterien im Hochwasserexperiment verwenden.

6. Zubereitung von PstT1 inoculum

  1. Aseptisch setzen Sie die Bakterien in sterilen 10 mM MgCl2 auf eine optische Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,1 oder etwa 5 x 107 Koloniebildeinheiten (CFU)/ml) aus.
  2. Führen Sie serielle Verdünnungen mit steriler 10 mM MgCl2 Lösung im Biosicherheitsschrank durch. Verwenden Sie für PstT1 ein Spektralphotometer, um Inokulum mit einer Anfangskonzentration von OD600 = 0,1 herzustellen.
  3. Für PstT1 eine Verdünnung von 1/10 aus der anfänglichen Resuspension bei OD600 = 0,1 vornehmen, um eine serielle Verdünnung bei einer Konzentration von OD600 = 0,01 zu erhalten.
  4. Verwenden Sie die serielle Verdünnung bei OD600 = 0,01 ab Schritt 6.3, machen Sie eine 3/4 Verdünnung, um eine endgültige OD600 = 0,0075 zu erhalten.
  5. Eine Verdünnung des nichtionischen Organosilikon-Tensids C13H34O4Si3 (d. h. Tensid) in 10 mM MgCl2 und Wirbel für 15 s. Fügen Sie den 1/10 Bestand an Tensid zur letzten seriellen Verdünnung (OD600 = 0,0075) zu einer Endkonzentration von 0,015% hinzu und wirbeln Sie gut zu mischen.

7. Vorbereitung von PstDC3000 inoculum

  1. Aseptisch resuspendieren Bakterien in sterilen 10 mM MgCl2 auf eine optische Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,1 (ca. 5 x 107 KBE/ml).
  2. Führen Sie serielle Verdünnungen mit steriler 10 mM MgCl2 Lösung im Biosicherheitsschrank durch. Verwenden Sie für PstDC3000 ein Spektralphotometer, um Inokulum mit einer Anfangskonzentration von OD600 = 0,1 herzustellen.
  3. Für PstDC3000 eine Verdünnung von 1/10 aus der anfänglichen Resuspension bei OD600 = 0,1 vornehmen, um eine serielle Verdünnung bei einer Konzentration von OD600 = 0,01 zu erhalten.
  4. Verwenden Sie die serielle Verdünnung bei OD600 = 0,01 von Schritt 3, machen Sie eine 1/2 Verdünnung, um eine endgültige OD600 = 0,005 zu erhalten.
  5. 1/10 Verdünnung des Tensids in 10 mM MgCl2 und Wirbel für 15 s. Fügen Sie den 1/10 Bestand an Tensid zur letzten seriellen Verdünnung (OD600 = 0,005) auf eine Endkonzentration von 0,015% hinzu und wirbeln Sie gut zum Mischen.

8. Tomatensämungsmethode

  1. Nehmen Sie die Platten mit den zehn Tage alten Sämlingen aus der Wachstumskammer und legen Sie sie in den Biosicherheitsschrank, um die Platten für Überschwemmungen vorzubereiten.
  2. Entfernen Sie das chirurgische Band von zwei Platten.
  3. Stellen Sie einen Timer für 3 min. Messen Sie 6 ml endstehendes Inokulum (PstT1 OD600 = 0.0075 [Abschnitt 6] oder PstDC3000 OD600 = 0.005 [Abschnitt 7]) und übertragen Sie 6 ml Inokulum auf jede Platte mit den 10 Tage alten Sämlingen.
  4. Die Sämlinge vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze in das Inokulum drücken. Starten Sie den Timer.
  5. Halten Sie eine Platte in jeder Hand. Neigen Sie die Vorderseite der Platte nach unten, um Inokulum anzusammeln und vor allem die Kotyledonen und Blätter der Sämlinge zu versenken.
  6. Wischen Sie Seite zu Seite 5–7x und kippen Sie dann die Platten zurück, um die Wurzeln und die gesamte Platte zu bedecken.
  7. Neigen Sie die Platten wieder nach unten, um die Kotyledonen und Blätter zu untertauchen, und wiederholen Sie für insgesamt 3 min.
  8. Gießen Sie das Inokulum von den Platten, stellen Sie die Platten auf eine flache Oberfläche und gießen Sie dann jedes Restinokulum ein zweites Mal.
  9. Umwickeln Sie die Platten mit chirurgischem Klebeband und wiederholen Sie die Schritte 8.2–8.8 für alle verbleibenden Platten.
  10. Die Platten in der Wachstumskammer erneut bebrüten (siehe Schritt 3.11 HINWEIS), nachdem alle Platten überflutet wurden.
  11. Phänotyp nach 7–10 Tagen für PstDC3000 oder 10–14 Tage für PstT1 (Abschnitt 11). Wenn Sie bakterielle Wachstumstests durchführen, sammeln Sie Blattgewebe nach 4 Tagen (Abschnitte 9 und 10) und dann Phänotyp (Abschnitt 11). Alternativ können Sie phänotypische Analysen und bakterielle Wachstumstests an separaten Pflanzensätzen durchführen.

9. Oberflächensterilisation von Cotyledonen für bakterielle wachstumsfördernden Test

  1. Vier Tage nach dem Überfluten und erneuten Inkubieren der Setzlinge in der Wachstumskammer (Abschnitt 8) entfernen Sie die Teller mit den Tomatensämlingen aus der Wachstumskammer.
  2. Nummeren Sie die einzelnen Sämlinge auf der unteren Außenseite der Platte, wo der Sämling für jeden Genotyp an der Platte befestigt ist.
  3. Beschriften Sie sterile 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre mit den einzelnen Sämlingsnummern und verwenden Sie saubere Zangen, um eine 3 mm sterile Borosilikatperle in jedes Rohr für die Verwendung mit einem Perlenschlag zu fallen. (Siehe ANMERKUNG in Schritt 10.1.)
  4. Pipette 200 l von 10 mM MgCl2 in jedes Rohr und schließen Rohre.
  5. 70% Ethanol zubereiten und 100 ml in ein sauberes Becherglas gießen. 100 ml steriles Reinst-H2 O in ein separates, sauberes Becherglas gießen.
  6. Reinigen Sie gerade Feinpunktzange aus Edelstahl mit gezackten Spitzen mit Ethanol. Öffnen Sie die Platte leicht, um die aseptische Entfernung eines Cotyledons mit den sauberen Zangen zu ermöglichen.
  7. Kneifen Sie die Petiole an der Basis des Cotyledon, um ein Blatt zu entfernen und fallen Sie in den Becher mit 70% Ethanol, um oberflächensterilisieren für 10 s. Spülen Sie das Cotyledon in ultrareines H2O für 10 s.
  8. Legen Sie das Kotyledon auf ein Papiertuch und trocknen Sie es mit zarten Wissenschaftlichtüchern.
  9. Wiegen Sie jedes Kotyledon nach Oberflächensterilisation und Blotting individuell und zeichnen Sie das Gewicht auf.
  10. Legen Sie das Kotyledon in ein zuvor vorbereitetes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr (ab den Schritten 9.3 und 9.4), das mit dem entsprechenden Genotyp und der individuellen Zahl gekennzeichnet ist.
  11. Versiegeln Sie die Platten mit sterilem Klebeband und brüten Sie die Sämlinge in der Wachstumskammer wieder auf (siehe Schritt 3.11 HINWEIS).

10. Bakterielles Wachstum Assay

  1. Mit Proben aus Schritt 9.10, homogenisieren Sie das Gewebe mit dem Perlenschlag in 10 mM MgCl2 für 1-2 min. Wenn das Gewebe nicht ausreichend mazeriert ist, homogenisieren Sie es erneut.
    HINWEIS: Viele Hersteller produzieren Perlenschlaghomogenisatoren. Anzahl und Art der Perlen sowie die Homogenisierungszeit und -geschwindigkeit (falls programmierbar) sollten für jeden Homogenisatortyp optimiert werden. Stellen Sie sicher, dass die Proben während der Homogenisierung nicht überhitzen.
  2. Fügen Sie 800 l von 10 mM MgCl2 zu jeder Tube hinzu, die mazeriertes Gewebe aus Schritt 10.1 enthält, und mehrmals invertieren, um sie zu mischen.
  3. Bereiten Sie serielle Verdünnungen für jede Probe in 10 mM MgCl2 in 96 WellPlatte (100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5) mit einer Mehrkanalpipette (Abbildung 2A).
  4. Pipette 5 l aus jeder Verdünnungsserie mit einer Mehrkanalpipette auf eine KB-Agarplatte (150 mm x 15 mm) mit Cycloheximid und geeigneter Auswahl für den bakteriellen Stamm von Interesse (siehe Schritt 4.8 HINWEIS). Lassen Sie die Platten vollständig trocknen.
  5. Inkubieren Sie die Platte bei 28 °C für 36 h auf den Kopf, und visualisieren Sie dann (Abbildung 2B) die Kolonien auf den Platten mit einem Sezierendes Mikroskop, um zu bestimmen, ob die Kolonien groß genug sind, um zu zählen.
    HINWEIS: Wenn die Kolonien nicht groß genug sind, brüten Sie die Platten erneut und überprüfen Sie die Größe der Kolonien alle paar Stunden. Typischerweise sind die Kolonien nach der Inkubation zahlbar.

Figure 2
Abbildung 2: Serielle Verdünnungen für bakterielle Wachstumstests. (A) Beflecktes Blattgewebe von infizierten Pflanzen wird vor der Koloniezählung verdünnt. Verdünnungen werden in einer 96-Well-Platte (100 ist unverdünnt) durchgeführt. Typischerweise werden Verdünnungen von 10-1 bis 10-5gemacht. (B) Plattverdünnungen für bakterielle Koloniezählt. Von jeder Kolonne der Verdünnungsreihe sind insgesamt 5 l, von der meisten verdünnt bis am konzentriertesten. Nachdem die Kolonien vollständig getrocknet sind, wird die Platte bei 28 °C für 36–48 h inkubiert. Kolonien werden unter einem 10-fachen Sezieren des Mikroskops gezählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Zählen Sie die Kolonien unter einem Sezieren des Mikroskops, bevor sie verschmelzen (Abbildung 2B). Zählen Sie die Kolonien aus den Verdünnungsserienplatten mit weniger als 100 Kolonien.
  2. Nach Erhalt der Koloniezählungen (Abbildung 2B), normalisieren Sie die Anzahl auf 0,01 g Gewebe für Sämlinge und wandeln Sie sich in das bakterielle Wachstum um (Tabelle 1).
    HINWEIS: Die durchschnittliche Masse eines Moneymaker-PtoS Cotyledon summiert sich bei 0,01 g und ist empirisch bestimmt22.
Genotype1 Spalte A Gewebegewicht (g) Spalte B Anzahl der Kolonien in einer Spotsäule C Verdünnungsfaktor für Punkt2 Spalte D Angepasste Anzahl von Kolonien3 Spalte E Verdünnungsfaktor für serielle Verdünnung summieren Säule F Gesamtanzahl der Kolonien Spalte G (cfu/0,01 g)4 Durchschnitt der Kolonien (cfu/0,01 g) Spalte H Durchschnittliches Log-Wachstum (cfu/0.01 g (log10)) Spalte I
Beispiel 1 0,004 g 10 200 berechnet als: (C2 x 0,01 g) / B2 = 25 1000 berechnet als: (D2 x E2 x F2) = 5000000 Durchschnitt für Probe 1 bis letzte Probe: (d.h. Durchschnitt G1:G3) = 7000000 Log des Durchschnitts dh. log(H2) = 6,85
Beispiel 2 0,003 g 15 200 50 1000 10000000
Beispiel 3 0,002 g 6 200 30 1000 6000000
1 Gezeigte Daten für 3 Stichproben
2 Basierend auf Beschichtung 5 x L x 200 für 1 ml
3 Cotyledons sind zu klein, um Sie zu kernen, so dass die Koloniezahlen auf 0,01 g Gewebe normalisiert wurden, basierend auf der durchschnittlichen Masse eines MoneyMaker-PtoS Cotyledon (Daten nicht gezeigt)
4 Bereinigt pro ml auf Basis des plattierten Volumens

Tabelle 1: Stichprobenberechnungen für den Assay für das bakterielle Wachstum. Beispielberechnungen zeigen, wie man die Anzahl der Bakterien normalisiert und das Wachstum des Protokolls bestimmt.

  1. Bei wilden Beitritten und anderen Linien mit komplexem genetischen Hintergrund korrelieren sie das Bakterienwachstum bei einzelnen Sämlingen mit ihrem Phänotyp, wie in Abschnitt 11 beschrieben.

11. Phenotypisierung für Resistenz

  1. Entfernen Sie die Platten aus der Wachstumskammer und phänotyp individuelle Sämlinge für den Tod (aufgrund von Krankheit) oder Überleben (aufgrund von Resistenz) nach 7-14 Tagen.
  2. Phänotyp-Pflanzen, die mit einem hochvirulenten Stamm wie PstDC3000 infiziert waren, zuvor, 7-10 Tage nach der Flutimpfung.
  3. Phänotyp-Pflanzen, die 10–14 Tage nach der Flutimpfung mit PstT1 infiziert sind.
  4. Bestimmen Sie ein Bewertungssystem basierend auf dem Bereich der beobachteten Resistenzphänotypen. Zeichnen Sie binäre Phänotypen für Sorten, isogene Linien und wilde Beitritte mit konsistenten, starken bis mittleren Resistenz-Phänotypen auf (Abbildung 4A, 4B).
  5. Wenn der Sämling innerhalb des Zeitrahmens für die Phänotypisierung neues Wachstum aus dem apikalen Meristem zeigt, zählen Sie ihn als Überleben. Wenn der Sämling einen braunen apikalen Meristem hat und kein neues, grünes vegetatives Wachstum zeigt, zählen Sie ihn als Tod (Abbildung 3).

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Darstellung eines Tomatensämlings. Verschiedene Teile eines Tomatensämlings sind abgebildet, darunter hypocotyl, Cotyledons, Epicotyl, schießen apikale Meristem, und wahre Blätter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Zeichnen Sie Phänotypen in einem Krankheitsspektrum für Populationen auf, z. B. F2-Mapping-Populationen, mit einer Vielzahl von Resistenz-Phänotypen (Abbildung 4C).
  2. Überwachen Sie die Sämlinge sorgfältig auf das Auftreten von Krankheitssymptomen und Tod, um das geeignete Fenster für die Phänotypisierung zu identifizieren.

Figure 4
Abbildung 4: Schematische Darstellung der erwarteten Phänotypen für Sämlingsresistenz und Tod in verschiedenen genetischen Hintergründen. (A) Sälinge von Rio Grande-PtoR und der nahezu isogenen Sorte Rio Grande-PtoS werden 7 Tage nach Überschwemmungen mit PstDC3000 (OD600 = 0,005) + 0,015% Tensid angezeigt. Rio Grande-PtoR zeigt eine konsistente Resistenz und Rio Grande-PtoS eine gleichbleibende Anfälligkeit für Infektionen mit PstDC3000. Diese Linien führen zu diskreten und binären Phänotypen. (B) Sälinge eines wilden Beitritts, wie Solanum neorickii LA1329, werden 10 Tage nach Überschwemmungen mit PstT1 (OD600 = 0,0075) + 0,015% Tensid gezeigt. Sämlinge weisen eine phänotypische Variabilität auf, wurden aber als binäre Phänotypen erfasst. Die Menge der phänotypischen Variabilität und die Methode der Phänotypisierung (binäre Resistenz oder Widerstandsspektrum) hängen von dem jeweiligen getesteten Beitritt ab. (C) Kartierung von Populationen, die durch die Überschreitung wilder Zutritte zu anfälligen Sorten erzeugt werden, kann ein breiteres Spektrum von Phänotypen in F2-Segretierpopulationen aufweisen. In diesem Fall kann es am besten sein, Sämling-Phänotypen auf einem Spektrum zu erfassen. Hochempfindliche Sämlinge aus einer Kartierungspopulation können bereits am 7. Tag phänotypisiert werden, wenn sie mit PstT1 überflutet werden, und zeigen typischerweise ein braunes apikales Meristem, keine bis sehr geringe Erweiterung des Epicotyls und kein neues, grünes vegetatives Wachstum. Das apikale Meristem der anfälligen Sämlinge kann länger grün oder sehr hellbraun bleiben, und es kann eine gewisse Erweiterung des Epicotyls und sehr wenig vegetatives Wachstum geben, das braun wird und am 10. Tag festnimmt. Einzelne Sämlinge können auf Widerstand basierend auf der Menge an neuem und fortlaufendem vegetativem Wachstum bis Tag 14 phänotypisiert werden. Sämlinge können dann auf der Grundlage der oben beschriebenen Phänotypen in verschiedene Widerstandskategorien wie schwach, mittel oder stark eingeteilt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Representative Results

Nachweis der PtoR-vermitteltenImmunität in Sorten und isogenen Linien mit dem Sämlingsresistenztest
Abbildung 5 zeigt repräsentative Ergebnisse für Moneymaker-PtoR und Moneymaker-PtoS-Sorten 7-10 Tage nach dem Hochwasser mit PstDC3000. Vor der Infektion zeigten 10 Tage alte Sämlinge vollständig aufgetauchte und erweiterte Kotyledonen und entstehende erste echte Blätter. Die Sämlinge wurden mit 10 mM MgCl2 + 0,015% Tensid als Negativkontrolle (Daten nicht gezeigt) und PstDC3000 mit einer optischen Dichte von 0,005 + 0,015% Tensid überflutet. Die Sämlinge wurden 7-10 Tage nach dem Hochwasser phänotypisiert (Abbildung 5). Einzelne Sämlinge aus genotypisch homogenen Linien, wie Moneymaker-PtoR und Moneymaker-PtoS, geben hochkonsistente und binäre Phänotypen im Sämlingsfluttest. Als Moneymaker-PtoR, das den Pto/Prf-Gencluster (n = 5) trägt, mit PstDC3000 in der optimalen Konzentration von OD600 = 0,005 behandelt wurde, war die Resistenz aufgrund der PtoR-vermitteltenImmunität stark und wurde durch neues, grünes vegetatives Wachstum bei allen Individuen22bezeichnet. Near-isogenic Moneymaker-PtoS Sämlinge (n = 5), die die PstDC3000 Effektoren AvrPto oder AvrPtoB nicht erkennen können, starben schnell innerhalb von 7 Tagen nach Überschwemmungen und hatten charakteristischerweise braune apikale Meristme, bakterielle Flecken, Chlorose und keine Anzeichen für ein neues, grünes vegetatives Wachstum (Abbildung 5).

Figure 5
Abbildung 5: Phänotypische Charakterisierung von Resistenz- oder Krankheitssymptomen 7–10 Tage nach der Infektion in einer Sorte. Moneymaker-PtoR und Moneymaker-PtoS Tomatensämlinge wurden auf 0,5x MS Platten für 10 Tage angebaut, bevor sie mit P. syringae pv überflutet wurden. Tomate DC3000 (OD600 = 0,005) + 0,015% Tensid. Moneymaker-PtoR Sämlinge überlebten (n = 5) und Moneymaker-PtoS Sämlinge (n = 5) starben. Die Anzahl der überlebenden Sämlinge für jeden Genotyp aus der getesteten Gesamtzahl wird angezeigt. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Phänotypische Screening von wilden Beitritten mit dem Sämlingsresistenz-Assay
Abbildung 6 zeigt repräsentative Ergebnisse für Sämlinge empfänglicher und resistenter Beitritte 10–14 Tage nach überschwemmungen mit PstT1. Zu den anfälligen Beitritten gehören RG-PtoR, S. pimpinellifolium LA1375 und S. pimpinellifolium LA1606, und resistente Beitritte umfassen S. neorickii LA1329. Zehn Tage alte Sämlinge wurden mit 10 mM MgCl2 + 0,015% Tensid als Negativkontrolle und PstT1 mit einer optischen Dichte von 0,0075 + 0,015% Tensid überflutet. Die Sämlinge wurden mindestens 10 Tage nach dem Hochwasser phänotypisiert, da PstT1-infizierte Sämlinge langsamer starben als PstDC3000-infizierte Sämlinge. Mock-inokulierte Sämlinge waren grün, gesund und aktiv wachsen. Diese Kontrolle ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Beitritte nicht empfindlich auf die Konzentration von Tensid reagieren, und um sicherzustellen, dass es keine bakterielle Kontamination gibt. Anfällige Beitritte (Rio Grande-PtoR [n = 7], S. pimpinellifolium LA1375 [n = 7] und S. pimpinellifolium LA1606 [n = 5]) waren tot, hatten braune apikale Meristeme und fehlten 10–14 Tage nach der Impfung mit PstT1. Im Gegensatz dazu wiesen zwei S. neorickii LA1329 (n = 3) Sämlinge ein hohes Maß an neuem, grünem Wachstum auf und überlebten eine Infektion mit PstT1 (Abbildung 6). Drei LA1329 Sämlinge keimten nicht. In der Regel wurden 5–7 Individuen für jeden Beitritt in einem primären Bildschirm untersucht, um die Prävalenz des Widerstands in der Bevölkerung zu bestimmen. Wenn ein genetisch komplexerer Wildbeitritt, wie LA1329, mit PstT1 überflutet wird, zeigen die Resistenz-Phänotypen etwas mehr Variabilität zwischen einzelnen Sämlingen an als Moneymaker-PtoR, die mit PstDC3000 behandelt wurden. Die Resistenz-Phänotypen waren jedoch in der Regel weniger variabel als die in F2-Mapping-Populationen. So wurde binäre Phänotypisierungskriterien für LA1329 verwendet.

Figure 6
Abbildung 6: Phänotypische Charakterisierung von Resistenz- oder Krankheitssymptomen 10–14 Tage nach der Infektion bei wilden Beitritten. Rio Grande-PtoR, S. pimpinellifolium LA1606, S. pimpinellifolium LA1375 und S. neorickii LA1329 Tomatensämlinge wurden 10 Tage lang auf 0,5-fachen MS-Platten angebaut und dann mit PstT1 (OD600 = 0,0075) + 0,015% Tensid überflutet. Die Anzahl der überlebenden Sämlinge für jeden Wildbeitritt aus der getesteten Gesamtzahl wird angezeigt. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Quantitative Bewertung des Bakterienwachstums mit Hilfe des Sämlings-Flut-Assays
Um zu bestätigen, dass die beobachtete Resistenz in LA1329 gegen PstT1 zu einem geringeren Bakterienwachstum führte, wurden bakterielle Wachstumstests bei Tomatensämlingen durchgeführt. Das Niveau des PstT1 Wachstums in Moneymaker-PtoS und S. neorickii LA1329 wurde 4 Tage nach der Infektion bestimmt. Moneymaker-PtoS ist eine nahezu isogene Linie mit gleichbleibender Anfälligkeit bei einzelnen Sämlingen. Wilde Zu- und Abhilfeen wie S. neorickii LA1329 sind oft genetisch komplexer. LA1329 zeigt ca. 60% Widerstand gegen PstT1 in der gesamten Bevölkerung22. Da Sämlinge ihre Kotyledonen nach einer Infektion fallen lassen können, wurde ein Sämling auf jeder Platte angebaut, um das bakterielle Wachstum im geernteten Kotyledon mit dem Gesamtüberleben oder dem Tod des Sämlings zu korrelieren, wie es phätypisch mindestens 10 Tage nach der Überflutung bestimmt wurde. Die Bakterienzahlen an Tag 4 für jeden Sämling wurden auf 0,01 g Gewebe normalisiert und in Holzwachstum umgewandelt (CFU/0,01 g(Log10)). Das Holzwachstum für phänotypisch resistente LA1329 Sämlinge (LA1329RES) oder phänotypisch empfängliche Sämlinge (LA1329SUS) wurde getrennt gepoolt und miteinander und der anfälligen Sorte Moneymaker-PtoSverglichen. Beispielsweise gab es einen Unterschied von 1,7 Log en bakterienwachstum zwischen LA1329RES (Log 6.3) und LA1329SUS (Log 8.0) und einen 1,6-Log-Unterschied zwischen LA1329RES (Log 6.3) und Moneymaker-PtoS (Log 7.9) (Abbildung 7). Daher korrelierte die phäotypische Resistenz mit der quantitativen Resistenz in den Sämlings-Assays.

Figure 7
Abbildung 7: Resistente Solanum neorickii LA1329 Sämlinge unterstützen ein geringeres Bakterienwachstum als Moneymaker-PtoS oder anfällig S. neorickii LA1329. Bakterielle Zahlen wurden 4 Tage nach der Inokulation von S. neorickii LA1329 (n = 14) und Moneymaker-PtoS (n = 10) Sämlinge mit PstT1 infiziert und Normalisierung wurde auf 0,01 g Gewebe durchgeführt. Für LA1329 wurden die beiden phänotisch-phätlichen Gruppen, anfällig (SUS) oder resistent (RES), getrennt beobachtet und gezählt. Oberhalb des Balkens * = statistisch signifikanter Unterschied, der durch eine Ein-Faktor-Analyse der Varianz bestimmt wird. Es wurde ein allgemeines lineares Modellverfahren (p < 0.001) gefolgt von einem mehrfachen Vergleich der Mittelwerte mit Tukeys Post-hoc-Test verwendet. Fehlerbalken = Standardfehler. Die Abbildung zeigt ein repräsentatives Experiment an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Ein Protokoll zur Hochwasserimpfung mit PstDC3000 oder PstT1, das optimiert ist, um Resistenzen gegen diese Bakterienstämme bei Tomatensämlingen zu erkennen, wird beschrieben. Es gibt mehrere kritische Parameter für optimale Ergebnisse im Sämlingsresistenztest, einschließlich der Bakterienkonzentration und Tensidkonzentration, die empirisch bestimmt wurden22. Für PstDC3000 wurde die optische Dichte optimiert, um ein vollständiges Überleben auf einer resistenten Sorte zu erreichen, die den Pto/Prf-Cluster enthält, und den vollständigen Tod auf einer anfälligen Sorte ohne pto/Prf-Cluster 22. Für eine Sorte wie PstT1, bei der es keine bekannten resistenten Sorten gibt, wurde die optische Dichte so optimiert, dass sie die niedrigstmögliche für konsistenten und vollständigen Pflanzentod22 ist. Uppalapati et al.24 entwarfen einen Tomatensämling-Assay, um die Pathogenese von PstDC3000 und die Virulenzfunktion von Koronat zu untersuchen. In diesem Virulenz-Assay wurden Infektionen mit Bakterien durchgeführt, die auf eine OD600 von 0,124konzentriert wurden, 20-fach höher als die optische Dichte von Stämmen, die in unserem Resistenztest verwendet werden. Die Erkennung von PstDC3000 Effektoren AvrPto und AvrPtoB bei Tomatensämlingen, die den Pto/Prf-Gencluster tragen, ergibt ETI und eine makroskopische HR22. Im Zusammenhang mit einer starken Immunantwort wie ETI wurde ein niedrigerer bakterieller Titer für PstDC3000 verwendet, um eine überwältigende genetische Resistenz aus dem Pto/Prf-Gencluster 22zu vermeiden. Darüber hinaus deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass eine hohe bakterielle Konzentration schwächere Immunantworten wie PTI oder quantitative Teilresistenz überwältigen könnte, bei der mehrere Gene zum gesamten Phänotyp beitragen. Tensid ist notwendig, damit die Bakterien an der Blattoberfläche haften; jedoch können hohe Konzentrationen zu Chlorose des Blattes22führen. Zuvor haben wir eine Reihe von Tensidkonzentrationen getestet, um empirisch die ideale Konzentration bei 10 Tage alten Tomatensämlingen22zu bestimmen. Bei der Prüfung neuer Arten, die sich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber Tensid unterscheiden können, sollte die Tensidkonzentration optimiert werden, um eine Konzentration zu identifizieren, die keine Schäden oder Chlorose in Abwesenheit von Bakterien verursacht. Geeignete Assay-Bedingungen erfordern eine Optimierung einer Tensidkonzentration, die keine Schäden verursacht, und eine bakterielle Konzentration, die Beifall bei allen anfälligen Kontrollen verursacht.

Weitere kritische Parameter für den Erfolg des Sämlings-Hochwasser-Assays sind die Verwendung von Sämlingen in bestimmten Entwicklungsstadien (10 Tage alte Sämlinge) (Abbildung 1),die Aufrechterhaltung stabiler Wachstumskammerbedingungen (Lichtintensität von ca. 200 m-2 s-1, konstante Temperatur von 22 °C, 16 h Licht) und die Durchführung von Experimenten in einem sterilen Biosicherheitsschrank. Medienvolumen über 45 ml oder unter 35 ml können den konsistenten Tod anfälliger Kontrollen beeinflussen, da das Volumen die umgebungende Mikroumgebung der Sämlinge auf der Platte beeinträchtigen kann. Zum Beispiel könnten Unterschiede in der relativen Luftfeuchtigkeit innerhalb der versiegelten Platten die Infektiosität der Bakterien und die Fähigkeit der Pflanzen beeinflussen, Infektionen zu überleben. Sterile Technik ist entscheidend, da verunreinigungen auf den Platten die Todesursache oder Anfälligkeit bei Sämlingen verwirren können. Da pflanzenpathogene Wechselwirkungen durch die zirkadiane Uhr24,25,26beeinflusst werden, wird empfohlen, die Pflanzen zu einer konsistenten Tageszeit zu befallen.

Pst ist ein Blattpathogen, der bevorzugt die Luftteile von Tomatensämlingen besiedelt, einschließlich der Cotyledons24 (Abbildung 3). Daher konzentriert sich die qualitative Phänotypisierung im Sämlingsflut-Assay auf Wachstum und Krankheitssymptome in Luftteilen des Sämlings, und Gewebe für den bakteriellen Wachstumstest wird aus den Kotyledonen für die quantitative Analyse abgetastet. Nach der Flutimpfung können Sämlinge innerhalb von 7–10 Tagen nach der Impfung mit PstDC3000 oder 10–14 Tage nach der Impfung mit PstT1 sterben, wie in Abschnitt 11 beschrieben. Der Samentod wird durch ein braunes apikales Meristem, verhaftete Epicotyldehnung und/oder verhaftetes vegetatives Wachstum visualisiert. Wenn verschiedene Bakterienstämme verwendet werden, muss das Timing empirisch bestimmt werden. Darüber hinaus sollte das Fortschreiten der Krankheit an Kontrollanlagen täglich nach Überschwemmungen überwacht werden, bis ein konsistenter Zeitrahmen vom Auftreten der Krankheitssymptome bis zum Samentod identifiziert werden kann. Abhängig von den Genotypen und Behandlungen, die im Hochwassertest verwendet werden, können Sämlings-Phänotypen als binäre Phänotypen oder auf einem Krankheitsspektrum aufgezeichnet werden (Abbildung 4). Ein breiteres Spektrum von Phänotypen kann beobachtet werden, wenn Überschwemmungen F2-Mapping-Populationen aus Wildentomate-Beitritten zu anfälligen Sorten kreuzen (Abbildung 4C). Es kann am besten sein, die Populationen in einem Krankheitsspektrum zu phänotypisieren, je nachdem, wie schnell der Sämling stirbt und wie viel neues vegetatives Wachstum und Verzweigung (Abbildung 4C). Der Sämling-Flut-Assay kann auch in Verbindung mit dem Bakteriellen Wachstumstest verwendet werden, um den Mitwirkungsgrad des bakteriellen Wachstums im Zusammenhang mit qualitativen Phänotypen bei einzelnen Sämlingen quantitativ zu bewerten (Abbildung 7). Sehr starke Reduktionen (d. h. log 3) des bakterienwachstums oder eine starke Resistenz bei resistenten Sämlingen eines wilden Beitritts im Vergleich zu einer anfälligen Sorte deuten darauf hin, dass die zugrunde liegende genetische Basis der Resistenz auf ETI22zurückzuführen sein könnte. Kleinere Verringerungen des Bakterienwachstums (d. h. der Verbrauch von Log 1,7), wie bei LA1329 Sämlingen beobachtet, können auf den Beitrag einer schwächeren Resistenz aus quantitativen Merkmalen und/oder PTI zurückzuführen sein. So kann der Sämlingswachstumstest ein wichtiges Werkzeug zur weiteren Charakterisierung der Resistenz in wilden Tomatenlinien sein.

Typischerweise wurden genetische Screens an vier- bis fünf Wochen alten erwachsenen Tomatenpflanzen durchgeführt, um die genetische Grundlage der P. syringae Resistenz in wilden Beitritten20,21zu identifizieren. Erwachsene Tomatenpflanzen benötigen viel längere Wachstumszeiten, benötigen mehr Platz in der Wachstumskammer und sind viel größere Pflanzen, was bedeutet, dass in der Regel nur wenige Individuen für jede Linie gescreent werden. Der Setzlingsfluttest bietet einen starken, alternativen Ansatz bei der Identifizierung der P. syringae Resistenz in wilden Tomaten beitritten. Durch das Screening im Sämlingsstadium kann eine große Probengröße getestet werden, die besonders vorteilhaft beim Nachweis von Resistenzen in genetisch komplexen Populationen sein kann. Reduzierter Bedarf an Wachstumskammerraum und Wachstumszeit ermöglichen einen Ansatz mit hohem Durchsatz und die schnelle Erkennung natürlicher Resistenzen bei wilden Zuständen zu neu auftretenden Krankheitserregern. Darüber hinaus ist der Instandsetzungswiderstand von P. syringae, der in der Setzphase dieses Assays festgestellt wurde, nicht auf die Entwicklungsphase beschränkt. S. neorickii LA1329 und S. habrochaites LA1253 wurden zunächst im Sämlingsstadium identifiziert und zeigen auch Resistenzen gegen PstT1 bei erwachsenen Pflanzen, wie zuvor beschrieben22.

Der Sämlingsflut-Assay ist ein vielseitiges Protokoll, das modifiziert und optimiert werden kann, um Host-Resistenzen gegen andere P. syringae-Stämme zu erkennen. Es könnte möglicherweise im Zusammenhang mit verschiedenen bakteriellen Krankheitserregern von Tomaten, wie die Xanthomonas-Arten, weiter angewendet werden. Diese Methode wird die Suche nach neuen Quellen der Krankheitsresistenz gegen bakterielle Krankheitserreger beschleunigen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Jamie Calma für die Prüfung der Wirkung des Medienvolumens auf Krankheits- oder Resistenzergebnisse. Wir danken Dr. Mael Baudin und Dr. Karl J. Scheiber vom Lewis Lab für die konstruktiven Kommentare und Anregungen zum Manuskript. Die Forschung zur Pflanzenimmunität im Lewis-Labor wurde von der USDA ARS 2030-21000-046-00D und 2030-21000-050-00D (JDL) und der NSF-Direktion für Biologische Wissenschaften IOS-1557661 (JDL) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) VWR International 56222-182
3mm borosilicate glass beads Friedrich & Dimmock GB3000B
Bacto peptone BD 211677
Bacto agar BD 214010
Biophotometer Plus Eppendorf E952000006
Biosafety cabinet, class II type A2
BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene VWR International 47744-642
Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks VWR International 500029-808
cycloheximide Research Products International C81040-5.0
Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade Fisher Scientific P288-500
Dimethylformamide
Dissecting microscope (Magnification of at least 10x)
Ethanol - 190 Proof
Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom Fisher Scientific 08-772-3
Glass Alcohol Burner Wick Fisher Scientific S41898A / No. W-125
Glass Alcohol Burners Fisher Scientific S41898 / No. BO125
Glycerol ACS reagent VWR International EMGX0185-5
Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666-A
Magnesium chloride, ACS grade VWR International 97061-356
Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade VWR International 97062-130
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL
Microcentrifuge tubes, 2.2 mL
Mini Beadbeater-96, 115 volt Bio Spec Products Inc. 1001
Murashige & Skoog, Basal Salts Caisson Laboratories, Inc. MSP01-50LT
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL Rainin L8-200XLS
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL Rainin L8-20XLS
Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish VWR International 89107-632
Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish Fisher Scientific FB08-757-14
Polystyrene 150x15mm sterile petri dish Fisher Scientific 08-757-148
Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) Staples 1013131
Rifampicin Gold Biotechnology R-120-25
Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) Fisher Scientific NCO138454
Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 Rainin 17005091
Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 Rainin 17005093
VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" VWR International 82027-386

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bioengineering Ausgabe 157 Pseudomonas syringae Tomaten Krankheitsresistenz Sieb Bakterienwachstum Phänotypen

Erratum

Formal Correction: Erratum: High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay. The Introduction, Protocol, Representative Results and Discussion sections were updated.

The last paragraph of the Introduction section was updated from:

In the seedling flood assay described in this protocol, tomato seedlings are grown on Petri dishes of sterile Murashige and Skoog (MS) media for 10 days and then are flooded with an inoculum containing the bacteria of interest and a surfactant. Following flooding, seedlings can be quantitatively evaluated for disease resistance via bacterial growth assays. Additionally, seedling survival or death can act as a discrete resistance or disease phenotype 7–14 days after flooding. This approach offers a high-throughput alternative for screening large numbers of wild tomato accessions for resistance to Pst race 1 strains, such as Pst strain T1 (PstT1), and can easily be adapted to other bacterial strains of interest.

to:

In the seedling flood assay described in this protocol, tomato seedlings are grown on Petri dishes of sterile Murashige and Skoog (MS) media for 10 days and then are flooded with an inoculum containing the bacteria of interest and a surfactant. Following flooding, seedlings can be quantitatively evaluated for disease resistance via bacterial growth assays. Additionally, seedling survival or death can act as a discrete resistance or disease phenotype 7–14 days after flooding. This approach offers a high-throughput alternative for screening large numbers of wild tomato accessions for resistance to Pst race 1 strains, such as Pst strain 19 (Pst19), and can easily be adapted to other bacterial strains of interest.

Step 4.8 of the Protocol section was updated from:

  1. After 1 h, transfer the bottle to the biosafety cabinet and under aseptic conditions, add 1,600 µL of sterile 1 M MgSO4, and appropriate antibiotics to the media.
    NOTE: For rifampicin resistant strains PstDC3000 and PstT1, use rifampicin dissolved in dimethylformamide at a final concentration of 50 µg/mL. Use cycloheximide dissolved in ethanol at a final concentration of 50 µg/mL to prevent fungal growth on the plates.

to:

  1. After 1 h, transfer the bottle to the biosafety cabinet and under aseptic conditions, add 1,600 µL of sterile 1 M MgSO4, and appropriate antibiotics to the media.
    NOTE: For rifampicin resistant strains PstDC3000 and Pst19, use rifampicin dissolved in dimethylformamide at a final concentration of 50 µg/mL. Use cycloheximide dissolved in ethanol at a final concentration of 50 µg/mL to prevent fungal growth on the plates.

Step 5.2 of the Protocol section was updated from:

  1. Patch bacteria (i.e., PstT1) from a glycerol stock onto KB agar with appropriate antibiotics (section 4).

to:

  1. Patch bacteria (i.e., Pst19) from a glycerol stock onto KB agar with appropriate antibiotics (section 4).

Step 5.6 of the Protocol section was updated from:

  1. For PstT1, incubate the KB plate at 28 ˚C for 48 h prior to using bacteria in the flood experiment.

to:

  1. For Pst19, incubate the KB plate at 28 ˚C for 48 h prior to using bacteria in the flood experiment.

Step 6 of the Protocol section was updated from:

6. Preparation of PstT1 inoculum

to

6. Preparation of Pst19 inoculum

Step 6.2 of the Protocol section was updated from:

  1. Perform serial dilutions using sterile 10 mM MgCl2 solution in the biosafety cabinet. For PstT1, use a spectrophotometer to make inoculum with a starting concentration of OD600 = 0.1.

to:

  1. Perform serial dilutions using sterile 10 mM MgCl2 solution in the biosafety cabinet. For Pst19, use a spectrophotometer to make inoculum with a starting concentration of OD600 = 0.1.

Step 6.3 of the Protocol section was updated from:

  1. For PstT1, make a 1/10 dilution from the initial resuspension at OD600 = 0.1 to obtain a serial dilution at a concentration of OD600 = 0.01.

to:

  1. For Pst19, make a 1/10 dilution from the initial resuspension at OD600 = 0.1 to obtain a serial dilution at a concentration of OD600 = 0.01.

Step 8.3 of the Protocol section was updated from:

  1. Set a timer for 3 min. Measure 6 mL of final inoculum (PstT1 OD600 = 0.0075 [section 6] or PstDC3000 OD600 = 0.005 [section 7]) and transfer 6 mL of inoculum to each plate with the 10-day-old seedlings.

to:

  1. Set a timer for 3 min. Measure 6 mL of final inoculum (Pst19 OD600 = 0.0075 [section 6] or PstDC3000 OD600 = 0.005 [section 7]) and transfer 6 mL of inoculum to each plate with the 10-day-old seedlings.

Step 8.11 of the Protocol section was updated from:

  1. Phenotype after 7–10 days for PstDC3000 or 10–14 days for PstT1 (section 11). If carrying out bacterial growth assays, collect leaf tissue after 4 days (sections 9 and 10) and then phenotype (section 11). Alternatively, perform phenotypic analysis and bacterial growth assays on separate sets of plants.

to:

  1. Phenotype after 7–10 days for PstDC3000 or 10–14 days for Pst19 (section 11). If carrying out bacterial growth assays, collect leaf tissue after 4 days (sections 9 and 10) and then phenotype (section 11). Alternatively, perform phenotypic analysis and bacterial growth assays on separate sets of plants.

Step 10.7 of the Protocol section was updated from:

  1. After obtaining colony counts (Figure 2B), normalize the counts to 0.01 g of tissue for seedlings and convert to log bacterial growth (Table 1).
    NOTE: The average mass of one Moneymaker-PtoS cotyledon is 0.01 g and is empirically determined22.
Genotype1 Column A Tissue Weight (g) Column B # of Colonies in a spot Column C Dilution factor for spot2 Column D Adjusted # of Colonies3 Column E Dilution factor for serial dilution Column F Total # of Colonies Column G (cfu/0.01 g)4 Average # of Colonies (cfu/0.01 g) Column H Average Log Growth (cfu/0.01 g (log10)) Column I
Sample 1 0.004 g 10 200 calculated as: (C2 x 0.01 g) / B2 = 25 1000 calculated as: (D2 x E2 x F2) = 5000000 average for sample 1 through last sample: (ie. average G1:G3) = 7000000 log of average ie. log(H2) = 6.85
Sample 2 0.003 g 15 200 50 1000 10000000
Sample 3 0.002 g 6 200 30 1000 6000000
1Data shown for 3 samples
2Based on plating 5 µL x 200 for 1 mL
3Cotyledons are too small to core so colony counts were normalized to 0.01 g of tissue based on the average mass of one MoneyMaker-PtoS cotyledon (data not shown)
4Adjusted per mL based on volume plated

Table 1: Sample calculations for seedling bacterial growth assay. Sample calculations demonstrate how to normalize bacterial counts and determine log bacterial growth.

to:

  1. After obtaining colony counts (Figure 2B), normalize the counts to 0.1 g of tissue for seedlings and convert to log bacterial growth (Table 1).
    NOTE: The average mass of one Moneymaker-PtoS cotyledon is 0.1 g and is empirically determined22.
Genotype1 Column A Tissue Weight (g) Column B # of Colonies in a spot Column C Dilution factor for spot2 Column D Adjusted # of Colonies3 Column E Dilution factor for serial dilution Column F Total # of Colonies Column G (cfu/0.01 g)4 Average # of Colonies (cfu/0.01 g) Column H Average Log Growth (cfu/0.1 g (log10)) Column I
Sample 1 0.04 g 10 200 calculated as: (C2 x 0.1 g) / B2 = 25 1000 calculated as: (D2 x E2 x F2) = 5000000 average for sample 1 through last sample: (ie. average G1:G3) = 7000000 log of average ie. log(H2) = 6.85
Sample 2 0.03 g 15 200 50 1000 10000000
Sample 3 0.02 g 6 200 30 1000 6000000
1Data shown for 3 samples
2Based on plating 5 µL x 200 for 1 mL
3Cotyledons are too small to core so colony counts were normalized to 0.1 g of tissue based on the average mass of one MoneyMaker-PtoS cotyledon (data not shown)
4Adjusted per mL based on volume plated

Table 1: Sample calculations for seedling bacterial growth assay. Sample calculations demonstrate how to normalize bacterial counts and determine log bacterial growth.

Step 11.3 of the Protocol section was updated from:

  1. Phenotype plants infected with PstT1 at 10–14 days after flood inoculation.

to:

  1. Phenotype plants infected with Pst19 at 10–14 days after flood inoculation.

Figure 4 in the Protocol section was updated from:

Figure 4
Figure 4: Schematic representation of expected phenotypes for seedling resistance and death in various genetic backgrounds. (A) Seedlings of Rio Grande-PtoR and the near-isogenic cultivar Rio Grande-PtoS are displayed 7 days after flooding with PstDC3000 (OD600 = 0.005) + 0.015% surfactant. Rio Grande-PtoR displays consistent resistance, and Rio Grande-PtoS displays consistent susceptibility to infection with PstDC3000. These lines give rise to discrete and binary phenotypes. (B) Seedlings of a wild accession, such as Solanum neorickii LA1329, are shown 10 days after flooding with PstT1 (OD600 = 0.0075) + 0.015% surfactant. Seedlings display phenotypic variability but were recorded as binary phenotypes. The amount of phenotypic variability and the method of phenotyping (binary resistance or resistance spectrum) will depend on the particular accession tested. (C) Mapping populations generated by outcrossing wild accessions to susceptible cultivars may display a wider spectrum of phenotypes in F2 segregating populations. In this case, it may be most appropriate to record seedling phenotypes on a spectrum. Highly susceptible seedlings from a mapping population may be phenotyped for death as early as day 7 when flooded with PstT1, and typically show a brown apical meristem, no to very little extension of the epicotyl, and no new, green vegetative growth. The apical meristem of susceptible seedlings may stay green or very light brown for more time, and there may be some extension of the epicotyl and very little vegetative growth, which turns brown and arrests by day 10. Individual seedlings can be phenotyped for resistance based on the amount of new and ongoing vegetative growth by day 14. Seedlings can then be grouped based on the phenotypes described above into different categories of resistance such as weak, medium, or strong resistance. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 4
Figure 4: Schematic representation of expected phenotypes for seedling resistance and death in various genetic backgrounds. (A) Seedlings of Rio Grande-PtoR and the near-isogenic cultivar Rio Grande-PtoS are displayed 7 days after flooding with PstDC3000 (OD600 = 0.005) + 0.015% surfactant. Rio Grande-PtoR displays consistent resistance, and Rio Grande-PtoS displays consistent susceptibility to infection with PstDC3000. These lines give rise to discrete and binary phenotypes. (B) Seedlings of a wild accession, such as Solanum neorickii LA1329, are shown 10 days after flooding with Pst19 (OD600 = 0.0075) + 0.015% surfactant. Seedlings display phenotypic variability but were recorded as binary phenotypes. The amount of phenotypic variability and the method of phenotyping (binary resistance or resistance spectrum) will depend on the particular accession tested. (C) Mapping populations generated by outcrossing wild accessions to susceptible cultivars may display a wider spectrum of phenotypes in F2 segregating populations. In this case, it may be most appropriate to record seedling phenotypes on a spectrum. Highly susceptible seedlings from a mapping population may be phenotyped for death as early as day 7 when flooded with Pst19, and typically show a brown apical meristem, no to very little extension of the epicotyl, and no new, green vegetative growth. The apical meristem of susceptible seedlings may stay green or very light brown for more time, and there may be some extension of the epicotyl and very little vegetative growth, which turns brown and arrests by day 10. Individual seedlings can be phenotyped for resistance based on the amount of new and ongoing vegetative growth by day 14. Seedlings can then be grouped based on the phenotypes described above into different categories of resistance such as weak, medium, or strong resistance. Please click here to view a larger version of this figure.

The second paragraph of the Representative Results section was updated from:

Phenotypic screening of wild accessions using the seedling resistance assay
Figure 6 shows representative results for seedlings of susceptible and resistant accessions 10–14 days after flooding with PstT1. Susceptible accessions include RG-PtoR, S. pimpinellifolium LA1375, and S. pimpinellifolium LA1606, and resistant accessions include S. neorickii LA1329. Ten-day-old seedlings were flooded with 10 mM MgCl2 + 0.015% surfactant as a negative control, and PstT1 at an optical density of 0.0075 + 0.015% surfactant. The seedlings were phenotyped at least 10 days after flooding, as PstT1-infected seedlings died more slowly than PstDC3000-infected seedlings. Mock-inoculated seedlings were green, healthy, and actively growing. This control is important to ensure that the accessions are not sensitive to the concentration of surfactant, and to ensure there is no bacterial contamination. Susceptible accessions (Rio Grande-PtoR [n = 7], S. pimpinellifolium LA1375 [n = 7], and S. pimpinellifolium LA1606 [n = 5]) were dead, had brown apical meristems, and lacked new growth 10–14 days after inoculation with PstT1. In contrast, two S. neorickii LA1329 (n = 3) seedlings displayed a high level of new, green growth and survived infection with PstT1 (Figure 6). Three LA1329 seedlings did not germinate. Typically, 5–7 individuals were screened for each accession in a primary screen to determine the prevalence of resistance in the population. When a more genetically complex wild accession, such as LA1329, is flooded with PstT1, the resistance phenotypes display slightly more variability among individual seedlings, compared to Moneymaker-PtoR treated with PstDC3000. However, the resistance phenotypes were usually less variable than those seen in F2 mapping populations. Thus, binary phenotyping criteria was used for LA1329.

to:

Phenotypic screening of wild accessions using the seedling resistance assay
Figure 6 shows representative results for seedlings of susceptible and resistant accessions 10–14 days after flooding with Pst19. Susceptible accessions include RG-PtoR, S. pimpinellifolium LA1375, and S. pimpinellifolium LA1606, and resistant accessions include S. neorickii LA1329. Ten-day-old seedlings were flooded with 10 mM MgCl2 + 0.015% surfactant as a negative control, and Pst19 at an optical density of 0.0075 + 0.015% surfactant. The seedlings were phenotyped at least 10 days after flooding, as Pst19-infected seedlings died more slowly than PstDC3000-infected seedlings. Mock-inoculated seedlings were green, healthy, and actively growing. This control is important to ensure that the accessions are not sensitive to the concentration of surfactant, and to ensure there is no bacterial contamination. Susceptible accessions (Rio Grande-PtoR [n = 7], S. pimpinellifolium LA1375 [n = 7], and S. pimpinellifolium LA1606 [n = 5]) were dead, had brown apical meristems, and lacked new growth 10–14 days after inoculation with Pst19. In contrast, two S. neorickii LA1329 (n = 3) seedlings displayed a high level of new, green growth and survived infection with Pst19 (Figure 6). Three LA1329 seedlings did not germinate. Typically, 5–7 individuals were screened for each accession in a primary screen to determine the prevalence of resistance in the population. When a more genetically complex wild accession, such as LA1329, is flooded with Pst19, the resistance phenotypes display slightly more variability among individual seedlings, compared to Moneymaker-PtoR treated with PstDC3000. However, the resistance phenotypes were usually less variable than those seen in F2 mapping populations. Thus, binary phenotyping criteria was used for LA1329.

Figure 6 in the Representative Results section was updated from:

Figure 6
Figure 6: Phenotypic characterization of resistance or disease symptoms 10–14 days post-infection in wild accessions. Rio Grande-PtoR, S. pimpinellifolium LA1606, S. pimpinellifolium LA1375 and S. neorickii LA1329 tomato seedlings were grown on 0.5x MS plates for 10 days, and then flooded with PstT1 (OD600 = 0.0075) + 0.015% surfactant. The number of surviving seedlings for each wild accession out of the total number tested is shown. Scale bar = 1 cm. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 6
Figure 6: Phenotypic characterization of resistance or disease symptoms 10–14 days post-infection in wild accessions. Rio Grande-PtoR, S. pimpinellifolium LA1606, S. pimpinellifolium LA1375 and S. neorickii LA1329 tomato seedlings were grown on 0.5x MS plates for 10 days, and then flooded with Pst19 (OD600 = 0.0075) + 0.015% surfactant. The number of surviving seedlings for each wild accession out of the total number tested is shown. Scale bar = 1 cm. Please click here to view a larger version of this figure.

The third paragraph of the Representative Results section was updated from:

Quantitative assessment of bacterial growth using the seedling flood assay
To confirm that the observed resistance in LA1329 to PstT1 resulted in lower bacterial growth, bacterial growth assays were carried out in tomato seedlings. The level of PstT1 growth in Moneymaker-PtoS and S. neorickii LA1329 was determined 4 days post-infection. Moneymaker-PtoS is a near-isogenic line with consistent susceptibility among individual seedlings. Wild accessions such as S. neorickii LA1329 are often more genetically complex. LA1329 displays approximately 60% resistance to PstT1 across the population22. Because seedlings may drop their cotyledons after infection, one seedling was grown on each plate to correlate bacterial growth in the harvested cotyledon with overall seedling survival or death as determined phenotypically at least 10 days after flooding. The bacterial counts on day 4 for each seedling were normalized to 0.01 g of tissue and converted to log growth (CFU/0.01 g(log10)). Log growth for phenotypically resistant LA1329 seedlings (LA1329RES) or phenotypically susceptible seedlings (LA1329SUS) were separately pooled and compared to each other and the susceptible cultivar Moneymaker-PtoS. For example, there was a 1.7 log difference in bacterial growth between LA1329RES (log 6.3) and LA1329SUS (log 8.0), and a 1.6 log difference between LA1329RES (log 6.3) and Moneymaker-PtoS (log 7.9) (Figure 7). Therefore, phenotypic resistance correlated with quantitative resistance in the seedling assays.

to:

Quantitative assessment of bacterial growth using the seedling flood assay
To confirm that the observed resistance in LA1329 to Pst19 resulted in lower bacterial growth, bacterial growth assays were carried out in tomato seedlings. The level of Pst19 growth in Moneymaker-PtoS and S. neorickii LA1329 was determined 4 days post-infection. Moneymaker-PtoS is a near-isogenic line with consistent susceptibility among individual seedlings. Wild accessions such as S. neorickii LA1329 are often more genetically complex. LA1329 displays approximately 60% resistance to Pst19 across the population22. Because seedlings may drop their cotyledons after infection, one seedling was grown on each plate to correlate bacterial growth in the harvested cotyledon with overall seedling survival or death as determined phenotypically at least 10 days after flooding. The bacterial counts on day 4 for each seedling were normalized to 0.01 g of tissue and converted to log growth (CFU/0.01 g(log10)). Log growth for phenotypically resistant LA1329 seedlings (LA1329RES) or phenotypically susceptible seedlings (LA1329SUS) were separately pooled and compared to each other and the susceptible cultivar Moneymaker-PtoS. For example, there was a 1.7 log difference in bacterial growth between LA1329RES (log 6.3) and LA1329SUS (log 8.0), and a 1.6 log difference between LA1329RES (log 6.3) and Moneymaker-PtoS (log 7.9) (Figure 7). Therefore, phenotypic resistance correlated with quantitative resistance in the seedling assays.

Figure 7 in the Representative Results section was updated from:

x

Figure 7
Figure 7: Resistant Solanum neorickii LA1329 seedlings support lower bacterial growth than Moneymaker-PtoS or susceptible S. neorickii LA1329. Bacterial counts were determined 4 days post-inoculation from S. neorickii LA1329 (n = 14) and Moneymaker-PtoS (n = 10) seedlings infected with PstT1 and normalization was performed to 0.01 g of tissue. For LA1329, the two phenotypic groups, susceptible (SUS) or resistant (RES), were observed and counted separately. Above the bar * = statistically significant difference determined by a one-factor analysis of variance. A general linear model procedure (p < 0.001) followed by a multiple comparison of means using Tukey's post hoc test was used. Error bars = standard error. The figure indicates one representative experiment. Please click here to view a larger version of this figure.

x

Figure 7
Figure 7: Resistant Solanum neorickii LA1329 seedlings support lower bacterial growth than Moneymaker-PtoS or susceptible S. neorickii LA1329. Bacterial counts were determined 4 days post-inoculation from S. neorickii LA1329 (n = 14) and Moneymaker-PtoS (n = 10) seedlings infected with Pst19 and normalization was performed to 0.1 g of tissue. For LA1329, the two phenotypic groups, susceptible (SUS) or resistant (RES), were observed and counted separately. Above the bar * = statistically significant difference determined by a one-factor analysis of variance. A general linear model procedure (p < 0.001) followed by a multiple comparison of means using Tukey's post hoc test was used. Error bars = standard error. The figure indicates one representative experiment. Please click here to view a larger version of this figure.

The first paragraph of the Discussion section was updated from:

A protocol for flood inoculation with PstDC3000 or PstT1 optimized to detect resistance to these bacterial strains in tomato seedlings is described. There are several critical parameters for optimal results in the seedling resistance assay, including bacterial concentration and surfactant concentration, which were empirically determined22. For PstDC3000, the optical density was optimized to achieve complete survival on a resistant cultivar containing the Pto/Prf cluster and complete death on a susceptible cultivar lacking the Pto/Prf cluster22. For a strain such as PstT1, where there are no known resistant varieties, the optical density was optimized to be the lowest possible for consistent and complete plant death22. Uppalapati et al.24 designed a tomato seedling assay to investigate the pathogenesis of PstDC3000 and the virulence function of coronatine. In this virulence assay, infections were performed using bacteria concentrated to an OD600 of 0.124, 20x higher than the optical density of strains used in our resistance assay. Recognition of PstDC3000 effectors AvrPto and AvrPtoB in tomato seedlings carrying the Pto/Prf gene cluster results in ETI and a macroscopic HR22. In the context of a strong immune response such as ETI, a lower bacterial titer was used for PstDC3000 to avoid overwhelming genetic resistance from the Pto/Prf gene cluster22. In addition, these results suggest that a high bacterial concentration could overwhelm weaker immune responses such as PTI or quantitative partial resistance, where multiple genes contribute to the overall phenotype. Surfactant is necessary for the bacteria to adhere to the leaf surface; however, high concentrations can cause chlorosis of the leaf22. We previously tested a range of surfactant concentrations to empirically determine the ideal concentration in 10-day-old tomato seedlings22. When testing new species that may differ in their sensitivity to surfactant, the surfactant concentration should be optimized to identify a concentration that does not cause damage or chlorosis in the absence of bacteria. Appropriate assay conditions will require optimization of a surfactant concentration that does not cause damage, and a bacterial concentration that causes disease in all susceptible controls.

to:

A protocol for flood inoculation with PstDC3000 or Pst19 optimized to detect resistance to these bacterial strains in tomato seedlings is described. There are several critical parameters for optimal results in the seedling resistance assay, including bacterial concentration and surfactant concentration, which were empirically determined22. For PstDC3000, the optical density was optimized to achieve complete survival on a resistant cultivar containing the Pto/Prf cluster and complete death on a susceptible cultivar lacking the Pto/Prf cluster22. For a strain such as Pst19, where there are no known resistant varieties, the optical density was optimized to be the lowest possible for consistent and complete plant death22. Uppalapati et al.24 designed a tomato seedling assay to investigate the pathogenesis of PstDC3000 and the virulence function of coronatine. In this virulence assay, infections were performed using bacteria concentrated to an OD600 of 0.124, 20x higher than the optical density of strains used in our resistance assay. Recognition of PstDC3000 effectors AvrPto and AvrPtoB in tomato seedlings carrying the Pto/Prf gene cluster results in ETI and a macroscopic HR22. In the context of a strong immune response such as ETI, a lower bacterial titer was used for PstDC3000 to avoid overwhelming genetic resistance from the Pto/Prf gene cluster22. In addition, these results suggest that a high bacterial concentration could overwhelm weaker immune responses such as PTI or quantitative partial resistance, where multiple genes contribute to the overall phenotype. Surfactant is necessary for the bacteria to adhere to the leaf surface; however, high concentrations can cause chlorosis of the leaf22. We previously tested a range of surfactant concentrations to empirically determine the ideal concentration in 10-day-old tomato seedlings22. When testing new species that may differ in their sensitivity to surfactant, the surfactant concentration should be optimized to identify a concentration that does not cause damage or chlorosis in the absence of bacteria. Appropriate assay conditions will require optimization of a surfactant concentration that does not cause damage, and a bacterial concentration that causes disease in all susceptible controls.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

Pst is a foliar pathogen that preferentially colonizes the aerial parts of tomato seedlings, including the cotyledons24 (Figure 3). Therefore, qualitative phenotyping in the seedling flood assay focuses on growth and disease symptoms in aerial portions of the seedling, and tissue for the bacterial growth assay is sampled from the cotyledons for quantitative analysis. After flood inoculation, seedlings may die within 7–10 days after inoculation with PstDC3000 or 10–14 days after inoculation with PstT1, as discussed in section 11. Seedling death is visualized by a brown apical meristem, arrested epicotyl elongation, and/or arrested vegetative growth. If different bacterial strains are used, the timing will have to be empirically determined. In addition, the progression of disease on control plants should be monitored daily after flooding until a consistent time frame from the onset of disease symptoms to seedling death can be identified. Depending on the genotypes and treatments used in the flood assay, seedling phenotypes can be recorded as binary phenotypes or on a disease spectrum (Figure 4). A broader spectrum of phenotypes may be observed when flood inoculating F2 mapping populations from wild tomato accessions crossed to susceptible cultivars (Figure 4C). It may be best to phenotype segregating populations on a disease spectrum depending on how quickly the seedling dies and the degree of new vegetative growth and branching (Figure 4C). The seedling flood assay can also be used in conjunction with the seedling bacterial growth assay to quantitatively assess levels of bacterial growth associated with qualitative phenotypes in individual seedlings (Figure 7). Very large reductions (i.e., ~log 3) in bacterial growth or strong resistance in resistant seedlings of a wild accession compared to a susceptible cultivar suggest that the underlying genetic basis of resistance may be due to ETI22. Smaller reductions in bacterial growth (i.e., ~log 1.7), as observed in LA1329 seedlings, may be due to the contribution of weaker resistance from quantitative trait loci and/or PTI. Thus, the seedling growth assay can be an important tool in further characterizing resistance in wild tomato lines.

to:

Pst is a foliar pathogen that preferentially colonizes the aerial parts of tomato seedlings, including the cotyledons24 (Figure 3). Therefore, qualitative phenotyping in the seedling flood assay focuses on growth and disease symptoms in aerial portions of the seedling, and tissue for the bacterial growth assay is sampled from the cotyledons for quantitative analysis. After flood inoculation, seedlings may die within 7–10 days after inoculation with PstDC3000 or 10–14 days after inoculation with Pst19, as discussed in section 11. Seedling death is visualized by a brown apical meristem, arrested epicotyl elongation, and/or arrested vegetative growth. If different bacterial strains are used, the timing will have to be empirically determined. In addition, the progression of disease on control plants should be monitored daily after flooding until a consistent time frame from the onset of disease symptoms to seedling death can be identified. Depending on the genotypes and treatments used in the flood assay, seedling phenotypes can be recorded as binary phenotypes or on a disease spectrum (Figure 4). A broader spectrum of phenotypes may be observed when flood inoculating F2 mapping populations from wild tomato accessions crossed to susceptible cultivars (Figure 4C). It may be best to phenotype segregating populations on a disease spectrum depending on how quickly the seedling dies and the degree of new vegetative growth and branching (Figure 4C). The seedling flood assay can also be used in conjunction with the seedling bacterial growth assay to quantitatively assess levels of bacterial growth associated with qualitative phenotypes in individual seedlings (Figure 7). Very large reductions (i.e., ~log 3) in bacterial growth or strong resistance in resistant seedlings of a wild accession compared to a susceptible cultivar suggest that the underlying genetic basis of resistance may be due to ETI22. Smaller reductions in bacterial growth (i.e., ~log 1.7), as observed in LA1329 seedlings, may be due to the contribution of weaker resistance from quantitative trait loci and/or PTI. Thus, the seedling growth assay can be an important tool in further characterizing resistance in wild tomato lines.

The fourth paragraph of the Discussion section was updated from:

Typically, genetic screens have been performed on four- to five-week-old adult tomato plants to identify the genetic basis of P. syringae resistance in wild accessions20,21. Adult tomato plants require much longer growth times, require more space in the growth chamber, and are much larger plants, which means that usually few individuals are screened for each line. The seedling flood assay provides a powerful, alternative approach in the identification of P. syringae resistance in wild tomato accessions. Screening at the seedling stage permits a large sample size to be tested which can be particularly advantageous in detecting resistance in genetically complex populations. Reduced growth chamber space requirements and growth time facilitate a high-throughput approach and rapid detection of natural resistance in wild accessions to emerging pathogens. Furthermore, P. syringae resistance that was identified at the seedling stage in this assay is not restricted to the developmental stage. S. neorickii LA1329 and S. habrochaites LA1253 were initially identified at the seedling stage and also display resistance to PstT1 in adult plants as previously described22.

to:

Typically, genetic screens have been performed on four- to five-week-old adult tomato plants to identify the genetic basis of P. syringae resistance in wild accessions20,21. Adult tomato plants require much longer growth times, require more space in the growth chamber, and are much larger plants, which means that usually few individuals are screened for each line. The seedling flood assay provides a powerful, alternative approach in the identification of P. syringae resistance in wild tomato accessions. Screening at the seedling stage permits a large sample size to be tested which can be particularly advantageous in detecting resistance in genetically complex populations. Reduced growth chamber space requirements and growth time facilitate a high-throughput approach and rapid detection of natural resistance in wild accessions to emerging pathogens. Furthermore, P. syringae resistance that was identified at the seedling stage in this assay is not restricted to the developmental stage. S. neorickii LA1329 and S. habrochaites LA1253 were initially identified at the seedling stage and also display resistance to Pst19 in adult plants as previously described22.

High-Throughput Identifikation der Resistenz gegen <em>Pseudomonas syringae pv. Tomate</em> in Tomaten mit Seedling Flood Assay
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Hassan, J. A., Chau-Ly, I. J.,… More

Hassan, J. A., Chau-Ly, I. J., Lewis, J. D. High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay. J. Vis. Exp. (157), e60805, doi:10.3791/60805 (2020).

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