Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

طريقة سريعة لتصوير الفلورسينس متعدد الأطياف لأقسام الأنسجة المجمدة

doi: 10.3791/60806 Published: March 30, 2020

Summary

نحن نصف طريقة تلطيخ سريعة لإجراء التصوير متعدد الأطياف على الأنسجة المجمدة.

Abstract

يتيح التصوير الفلوري المتعدد الأطياف على أنسجة البارافين المضمنة (FFPE) ذات البارافين ذات البارافين (FFPE) الكشف عن علامات متعددة في عينة نسيج واحد يمكن أن توفر معلومات حول التعبير المشترك للمستضد والتوزيع المكاني للعلامات. ومع ذلك، قد يؤدي عدم وجود أجسام مضادة مناسبة للأنسجة الثابتة الشكلية إلى تقييد طبيعة العلامات التي يمكن اكتشافها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن طريقة تلطيخ تستغرق وقتًا طويلاً. هنا نصف طريقة سريعة لإجراء التصوير الفلوري متعدد الأطياف على الأنسجة المجمدة. وتشمل هذه الطريقة تركيبات الفلوروفور المستخدمة، والخطوات التفصيلية لتلطيخ الأنسجة المجمدة الماوس والإنسان، والمسح الضوئي، واقتناء، وإجراءات التحليل. لتحليل تلطيخ، يتم استخدام نظام التصوير متعدد الأطياف المتاحة تجاريا ً. من خلال هذه الطريقة ، تم تلطيخ ما يصل إلى ست علامات مختلفة واكتشافها في قسم واحد من الأنسجة المجمدة. يمكن لبرنامج تحليل التعلم الآلي أن يُستخدم في الخلايا الظاهرية التي يمكن استخدامها للتحليل الكمي. الطريقة الموصوفة هنا للأنسجة المجمدة مفيدة للكشف عن العلامات التي لا يمكن اكتشافها في أنسجة FFPE أو التي لا تتوفر الأجسام المضادة لأنسجة FFPE.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد أدت التطورات الأخيرة في تقنيات التصوير المجهري إلى تحسين معرفتنا وفهمنا للعمليات البيولوجية وحالات المرض بشكل كبير. في الموقع الكشف عن البروتينات في الأنسجة عن طريق الكيمياء المناعية الكروميوم (IHC) يتم بشكل روتيني في علم الأمراض. ومع ذلك ، فإن الكشف عن علامات متعددة باستخدام تلطيخ Chromogenic IHC يشكلتحديًا 1 ويتم تطوير طرق أحدث لاستخدام أساليب تلطيخ الفلور المناعي (mIF) متعددة ، حيث يتم وضع علامات بيولوجية متعددة على عينة نسيج واحد. الكشف عن علامات بيولوجية متعددة مفيد، لأن المعلومات المتعلقة بهندسة الأنسجة، والتوزيع المكاني للخلايا، والتعبير المشترك للمستضد يتم التقاطها جميعها في عينة نسيج واحد2. وقد جعل استخدام تكنولوجيا التصوير الفلورية المتعددة الأطياف الكشف عن علامات بيولوجية متعددة ممكناً. في هذه التكنولوجيا، وذلك باستخدام بصريات محددة يمكن فصل أطياف الفلورسينس لكل فلوروفور الفردية أو "غير مختلطة"، مما يتيح الكشف عن علامات متعددة دون أي تقاطع الطيفية3. التصوير الفلوري متعدد الأطياف أصبح نهجا حاسما في بيولوجيا الخلايا، وتطوير الأدوية قبل السريرية، وعلم الأمراض السريرية، والورم المناعة التنميط4،5،6. الأهم من ذلك، يمكن أن يكون التوزيع السباسي للخلايا المناعية (على وجه التحديد خلايا CD8 T) بمثابة عامل تشخيصي للمرضى الذين يعانون من الأورام الموجودة7.

وقد وضعت أساليب مختلفة لتلطيخ الفلورسين المتعدد ويمكن القيام به إما في وقت واحد أو بالتسلسل. في طريقة تلطيخ في وقت واحد، يتم إضافة جميع الأجسام المضادة معا ككوكتيل في خطوة واحدة لتسمية الأنسجة. تستخدم تقنية UltraPlex مزيجًا من الأجسام المضادة الأولية النتنة متبوعة يليها مزيج من الأجسام المضادة الثانوية المضادة للنتن المترافقة مع الفلوروفور. InSituPlex التكنولوجيا8 يستخدم مزيجا من الأجسام المضادة الفريدة الحمض النووي الاقتران الأولية التي تضاف في وقت واحد إلى الأنسجة تليها خطوة التضخيم وأخيرا المخارج الفلوروفور مترافق التي هي مكملة لكل تسلسل الحمض النووي فريدة من نوعها على الأجسام المضادة الأولية. كل من هذه التكنولوجيات تمكن من الكشف عن أربع علامات بالإضافة إلى 4'،6-diamino-2-phenylindole (DAPI) للتلطيخ النووي. ويستند نهجين آخرين لتلطيخ متعددة في وقت واحد على الطيف كتلة الأيون الثانوية9. يستخدم نظام التصوير Hyperion قياس الخلايا الشامل التصوير10 للكشف عن ما يصل إلى 37 علامة. تستخدم هذه التقنية مزيجًا من الأجسام المضادة المعدنية المترافقة لتلطيخ الأنسجة ، ويتم تشعب مناطق محددة من الأنسجة بالليزر ونقلها إلى مقياس سيتومتر جماعي حيث يتم اكتشاف الأيونات المعدنية. آخر مماثلة التكنولوجيا هو IONPath، الذي يستخدم متعددة الأيون شعاع تكنولوجيا التصوير11. تستخدم هذه التقنية أداة قياس الطيف الكتلي المعدلة ومصدر أيون الأكسجين بدلاً من الليزر لإزالة الأجسام المضادة المعدنية المترافقة. في حين أن كل هذه النهج المتعددة المتزامنة تلطيخ تمكين الكشف عن علامات متعددة، لا يمكن التقليل من التكاليف التي ينطوي عليها لاقتران الحمض النووي، التعاز، أو المعادن إلى الأجسام المضادة، وفقدان الأنسجة بسبب الاجتثاث، ومعالجة الصور واسعة النطاق لعدم الاختلاط. وعلاوة على ذلك، لا تتوفر حاليا ً مجموعات وبروتوكولات تلطيخ إلا لأنسجة FFPE وينطوي تطوير لوحات مخصصة على وقت ونفقات إضافية.

طريقة تلطيخ متعددة متتابعة، في المقابل، تشمل وضع علامة على الأنسجة مع الأجسام المضادة لعلامة واحدة، وتجريد لإزالة الأجسام المضادة، تليها تكرار متتابعة لهذه العملية لتسمية علامات متعددة12. إن تضخيم إشارة التيراميد (TSA) هو الأسلوب متعدد الإرسال التسلسلي الأكثر استخدامًا. تستخدم اثنين من التقنيات متعددة أخرى متعددة مزيج من أساليب تلطيخ متزامنة ومتتابعة. تستخدم منصة CODEX13 مزيجًا من الأجسام المضادة المترافقة مع تسلسلoligonucleotide النووي الفريد الذي يتم تصنيفه في نهاية المطاف بفلوريفوروفور باستخدام خطوة بلمرة مفهرسة يتبعها التصوير والتجريد وتكرار العملية للكشف عن ما يصل إلى 50 علامة. نهج تلطيخ MultiOmyx متعددة14 هو تكرار للتلطيخ مع مزيج من ثلاثة إلى أربعة الأجسام المضادة المفلورة الزوجية ، والتصوير ، وإرواء الفلوروفوريات ، وتكرار هذه الدورة للكشف عن ما يصل إلى 60 علامة على مقطع واحد. على غرار طريقة تلطيخ متعددة في وقت واحد ، في حين يمكن الكشف عن مجموعة واسعة من العلامات ، فإن الوقت الذي ينطوي عليه تلطيخ ، وحيازة الصور ، والمعالجة ، والتحليل واسع النطاق. تتضمن خطوة التجريد /التروية التدفئة و / أو تبييض عينة الأنسجة ، وبالتالي ، يتم تنفيذ نهج تلطيخ متعدد الموجات المتسلسلة عادة على أنسجة FFPE التي تحافظ على سلامة الأنسجة عند التدفئة أو التبييض.

يتم تنفيذ التثبيت الرسمي وتضمين البارافين اللاحق بسهولة في بيئة سريرية ، وكتل الأنسجة سهلة التخزين ، وتتوفر العديد من بروتوكولات تلطيخ متعددة. ومع ذلك ، فإن معالجة وتضمين وإزالة الأنسجة FFPE ، وكذلك استرجاع المستضد15، وهي عملية يمكن من خلالها للأجسام المضادة الوصول بشكل أفضل إلى epitopes ، تستغرق وقتًا طويلاً. وعلاوة على ذلك، فإن المعالجة التي تنطوي عليها أنسجة FFPE يساهم في autofluorescence16 والأقنعة الهدف epitopes، مما أدى إلى تقلب وعدم وجود استنساخ الأجسام المضادة المتاحة للكشف عن المستضدات في أنسجة FFPE17،18،19. مثال على ذلك هو مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) فئة I alleles20. في المقابل، لا ينطوي التجميد المفاجئة للأنسجة على خطوات معالجة واسعة النطاق قبل أو بعد التثبيت، والتحايل على الحاجة إلى استرجاع المستضد21،22، وجعله مفيدًا للكشف عن نطاق أوسع من الأهداف. لذلك ، يمكن أن يكون استخدام الأنسجة المجمدة لتصوير الفلورسينس متعدد الأطياف قيمًا للكشف عن أهداف الدراسات قبل السريرية والسريرية.

وبالنظر إلى القيود المذكورة أعلاه عند استخدام أنسجة FFPE، سألنا عما إذا كان يمكن إجراء التصوير الفلوري المتعدد الأطياف على الأنسجة المجمدة. لمعالجة هذا السؤال، اختبرنا طريقة تلطيخ متعددة في وقت واحد باستخدام لوحة من الأجسام المضادة المفلورة الزوجية للكشف عن مستضدات متعددة وحللنا تلطيخ باستخدام نظام تصوير متعدد الأطياف الآلية. تمكنا من تلطيخ ما يصل إلى ست علامات في قسم نسيج واحد في غضون 90 دقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم الحصول على طحال الفأر وأنسجة ورم الماوس HLF1623 من مختبرنا. تم شراء أنسجة اللوزة البشرية من بائع تجاري. وترد التفاصيل في جدول المواد.

1. تضمين الأنسجة

  1. تضمين الأنسجة الطازجة في OCT (درجة حرارة القطع الأمثل) والتجميد المفاجئة باستخدام الجليد الجاف أو النيتروجين السائل.
  2. تخزين الأنسجة في -80 درجة مئوية.

2. التبريد

  1. اقطع 8 ميكرومتر في cryostat مع ضبط درجات الحرارة عند -25 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تعديل سمك القسم المفضل لتوليد صور أكثر وضوحًا.
  2. ضع المقاطع على الشرائح الزجاجية المشحونة.
  3. الهواء الجاف المقاطع لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل تحديد في الهسولوجيا الصف الجليد الباردة الأسيتون لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: الأسيتون يسبب تخثر البروتينات القابلة للذوبان في الماء ومستخلصات الدهون ولكن لا يؤثر على المكونات المحتوية على الكربوهيدرات. في المقابل، الرسميين يحافظ على معظم الدهون وله تأثير ضئيل على الكربوهيدرات24. اختيار المثبت مهم اعتمادا على اختيار علامة يجري الكشف عنها.
  4. تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية.

3. اختيار الأجسام المضادة والفلوروفوريه

ملاحظة: قبل تلطيخ الأنسجة، يجب التحقق من صحة استنساخ الأجسام المضادة التي ستلطخ بقوة وتحديدا مستضداتها ذات الاهتمام داخل أقسام متتابعة من الأنسجة الثابتة الأسيتون. قد تتطلب بعض الأجسام المضادة مثبتًا مختلفًا ، ويجب أيضًا تحديد توافقها مع الأجسام المضادة الأخرى في اللوحة تجريبيًا. والهدف أيضا هو تحديد الفلوروفورمع الحد الأدنى من التداخل التي يمكن الكشف عنها مع مرشحات epifluorescence DAPI، FITC، Cy3، تكساس الأحمر، وCy5.

  1. تأكيد تلطيخ بواسطة IHC التقليدية أو الكشف عن الفلور المناعي (IF) في أقسام الأنسجة مع مستضد هدف التعبير المعروف.
  2. باستخدام مجموعات فلتر الإثارة والانبعاثات المتاحة على نظام التصوير شبه الآلي وبعد اختبار مجموعات مختلفة من الأجسام المضادة الأولية المترافقة مع الفلوروفورفور، قم بإعداد الفلوروفوريات لاستخدامها التي لها الحد الأدنى من التداخل الطيفي (على سبيل المثال، انظر الجدول 1).

4. تلطيخ

ملاحظة: تم إجراء الإماهة النسيجية وزُل الشرائح في جرة كوبلين. تم تنفيذ خطوات الحجب واحتضان الأجسام المضادة في صندوق شرائح رطب.

  1. السماح للشرائح لالحارة إلى RT لمدة 5-10 دقيقة.
  2. Rehydrate في الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (PBS) لمدة 5 دقيقة.
  3. تنفيذ خطوة حظر قبل تلطيخ الأنسجة بالأجسام المضادة. بالنسبة لأقسام الماوس، استخدم حل حظر متخصص (انظر جدول المواد)لمدة 10 دقيقة في RT. بالنسبة للأقسام البشرية، استخدم 10% مصل بشري مجمع طبيعي (NHS) مخفف في PBS لمدة 15 دقيقة في RT.
    ملاحظة: يمكن اختبار مخازن حظر مختلفة حسب الحاجة للحفاظ على خصائص معينة من المقاطع اعتماداً على إجراءات المتابعة التي سيتم استخدامها.
  4. غسل الشرائح لمدة 5 دقيقة في برنامج تلفزيوني بعد حظر.
  5. للتلطيخ متعدد، قم بإعداد مزيج من الأجسام المضادة مع الفلوروفوريات المتوافقة في تخفيفات مثالية محددة مسبقًا.
  6. أضف مزيج الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور إلى الشرائح. للتلطيخ بعلامة واحدة، أضف فقط الأجسام المضادة الأولية المترافقة إلى الشريحة.
  7. وتشمل شريحة غير الملطخة عنصر التحكم الذي يخضع لنفس إجراء تلطيخ دون إضافة أي جسم مضاد الأولية الاقتران.
  8. احتضان الشرائح لمدة 1 ساعة في RT في الظلام ثم غسل الشرائح 2x مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقيقة لكل منهما. من الآن فصاعداً، يُشار إلى الشريحة الناتجة باسم متعدد الملطخ.
  9. لمواجهة، إضافة DAPI إلى الشريحة الملطخة متعددة، واحتضان لمدة 7 دقيقة في الظلام في RT، وغسل الشرائح 2x مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقيقة لكل منهما. لا مضاد ة الشرائح الملطخة واحدة وغير ملطخة.
  10. لغطاء، إضافة قطرة من المتوسطة تصاعد، ووضع بلطف غطاء الزجاج على الأنسجة.

5- إعداد مكتبة طيفية

  1. الحصول على الصور
    1. تعيين قوة المصباح إلى 100٪. عادة ما يتم تعيين الطاقة إلى 10٪ لأن الكشف عن الفلورسينس على أنسجة FFPE يتضمن خطوة تضخيم الإشارة.
    2. تبدأ بفتح برنامج تشغيل المجهر (انظر جدول المواد).
    3. حدد بروتوكول تحرير ثم بروتوكول جديد.
    4. توفير "اسم البروتوكول"، وحدد الفلورسينس تحت وضع التصوير،وتوفير "اسم الدراسة".
    5. ضع الشرائح الملطخة بواحدة على المسرح وتفحص كل علامة في قناة الفلورسينس المقابلة لضمان تلطيخها. اختر منطقة على الأنسجة تعبر عن أقوى إشارة للعلامة.
    6. ضبط أوقات التعرض باستخدام خيارات التركيز التلقائي وتلقائي.
    7. الحصول على لقطات للشرائح واحدة ملطخة وغير ملطخة وحفظ البروتوكول.
      ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية في برامج التعلم الآلي (انظر جدول المواد)، وذلك باستخدام الشرائح واحدة ملطخة وغير ملطخة للتحقق من تلطيخ محددة وكذلك لتحديد الأجسام المضادة عبر الحديث.
    8. ضمن علامة التبويب إنشاء المكتبات في البرنامج، قم بتحميل كل صورة شريحة ملطخة بواحدة، واختر الفلور المناسب، وانقر فوق استخراج. سيقوم البرنامج تلقائيًا باستخراج إشارة الفلورسينس التي تم اختيارها في الفلور.
    9. لحفظ اللون المستخرج، انقر على حفظ إلى مخزن. قد يتم إنشاء "مجموعة جديدة" أو يمكن تخزين اللون المستخرج إلى مجموعة موجودة.
  2. التحقق من المكتبة الطيفية
    1. تحقق من نافذة المنحنى الطيفي للانبعاثات ، الموجودة على يمين الصورة المستخرجة ، لكل مجموعة تصفية.
      ملاحظة: الإشارة المستخرجة صحيحة إذا لوحظ المنحنى الطيفي فقط في مجموعات التصفية حيث يتم الكشف عن الفلوروفور. إذا لوحظ منحنى طيفي في مجموعة التصفية الخاطئة، فقد يعني ذلك إما أن الإشارة الأساسية المتوقعة في مجموعة الفلتر ليست قوية بما فيه الكفاية، أو أن البرنامج يكتشف إشارة أخرى عالية جدًا، ربما بسبب التداخل الطيفي. في هذه الحالة، حاول أولاً استخدام أداة رسم مناطق المعالجة لرسم المناطق حول المناطق التي تعبر عن علامة الفلورسنت والفلورات في الصورة. هذا يدرب البرنامج على الكشف عن الإشارة الحقيقية وإزالة أي إشارات التداخل. إذا لم ينجح ذلك، كرر عملية تلطيخ الشريحة الملطخة بواحدة لاختبار التمزقات الأجسام المضادة المختلفة.

6. التصوير متعدد الأطياف

ملاحظة: بمجرد إنشاء المكتبة الطيفية والتحقق منها، قم بتنفيذ الخطوات التالية للشريحة الملطخة بمضاعفات متعددة.

  1. مسح الشريحة بالكامل
    1. ضبط أوقات التركيز والتعرض على الشريحة الملطخة متعددة كما هو مذكور تحت في القسم 5.1.
    2. ضمن الشرائح المسح الضوئي، قم بإنشاء مهمة جديدة واختيار البروتوكول المحفوظة أعلاه.
    3. إجراء مسح شريحة كامل على الشريحة الملطخة بمتعدد المضاعفات.
    4. باستخدام برنامج مسح الشريحة بالكامل، افتح صورة مسح الشريحة بأكملها. لم تكن هذه الصورة غير مختلطة من الناحية الطيفية.
    5. حدد المناطق ذات الاهتمام (ROI) عبر صورة مسح الشريحة بأكملها باستخدام أداة Stamp أو ROI. وسيتم مسح هذه الأقراص الضوئية باستخدام أوقات التعرض المحددة في 6.1.1 لاستخدامها في فك المزج والتحليل الطيفي.
    6. انقر فوق الشريحة عملية للحصول على ROIs في التكبير 20x
  2. عدم الخلط الطيفي
    1. مرة واحدة وقد تم الحصول على ROIs، في برنامج التعلم الآلي، تحت علامة التبويب التحليل اليدوي، تحميل الصور الملونة متعددة بالنقر فوق فتح تحت ملف.
    2. في القائمة المنسدلة مصدر المكتبة الطيفية انقر فوق حدد الفلور.
    3. سيتم فتح نافذة جديدة. هنا، اختر المكتبة الطيفية أو المجموعة التي تم إنشاؤها أعلاه.
    4. تحميل صورة الشريحة غير الملطخة. انقر فوق رمز علامة الحبر AF الموجود فوق المكتبة الطيفية المحددة ورسم خط أو منطقة على الشريحة غير الملطخة لتحديد الفلور الفلورية في الأنسجة.
    5. ضمن علامة التبويب تحرير العلامات والألوان، قم بتعيين أسماء لكل علامة. يمكن تعيين ألوان زائفة في هذه الخطوة.
      ملاحظة: لون الصورة Autofluorescence الافتراضية إلى DarkSlateGray. تغيير هذا إلى الأسود.
    6. انقر فوق إعداد الكل.
  3. التحقق من الصور غير المختلطة من الناحية الطيفية
    ملاحظة:
    عند اكتمال خطوة إلغاء الخلط الطيفي، يتم إنشاء صورة مركبة تتكون من كافة الألوان.
    1. انقر فوق تحرير أيقونة عرض العين. هنا، يمكن إيقاف تشغيل كل لون في "شاشة المكونات" أو تشغيله لعرض تلطيخ كل علامة فردية.
    2. فحص بصريا تلطيخ ومورفولوجيا الخلايا للتأكد من عدم وجود تداخل من علامة، إلا إذا كان ذات الصلة بيولوجيا. يمكن أن يساعد أخصائي علم الأمراض في التحقق من تلطيخ البقع أيضًا.
      ملاحظة: وينبغي التحقق من صحة تلطيخ على الشريحة متعددة من خلال ترك الفلوروفور واحد في وقت واحد واستعراض نمط تلطيخ. بالإضافة إلى ذلك ، سيساعد التحقق من الصحة أيضًا في تحديد الفلوروفورات القوية التي تظهر في الأطياف المجاورة بسبب حديث الأجسام المضادة أو النزيف.
    3. لطرق عرض علم الأمراض، والتي تحاكي صور برايتفيلد لكل علامة فلورية ، انقر فوق الزر تحديد صورة مكون. هنا، اختر علامة لعرض صورة حقل ساطع محاكاة.

7. تحليل الصور متعددة الأطياف عبر تجزئة الخلايا وPhenotyping

ملاحظة: بعد التحقق من الصورة غير المختلطة من الناحية الطيفية، يمكن إجراء تجزئة الخلية باستخدام برنامج التعلم الآلي، والذي سيوفر إرشادات خطوة بخطوة. لم يتم إجراء تجزئة الأنسجة هنا. إذا كانت اللوحة تتضمن علامة محددة أو أكثر من الأنسجة وخاصة إذا كان النسيج فوضويًا ، فيجب إجراء تجزئة الأنسجة.

  1. حدد"السيتوبلازم"و"الغشاء"تحت خيار "الجزء".
    ملاحظة: "النوى"يتم اختيار بشكل افتراضي.
  2. حدد علامة من اللوحة. تكوين علامة للكشف عن أي من النوى، السيتوبلازم، أو الغشاء. على سبيل المثال، يمكن تحديد DAPI للكشف عن النوى وCD3 للغشاء.
  3. انقر على زر القطع الناقص ('...') لتحديد خيار تحت"استخدام هذه الإشارة للعثور على". على سبيل المثال، "نواة" لDAPI. يمكن تحديد علامات متعددة من اللوحة للتجزئة.
    ملاحظة: بالنسبة لعلامات السيتوبلازمأو الأغشية، حدد"استخدم هذه الإشارة للمساعدة في التقسيم النووي".
  4. البرنامج تلقائيا بالكشف عن ويخلق قناع لكل نواة، السيتوبلازم، والغشاء في الصورة.
  5. تأكد من أن جميع الخلايا "ملثمة" للتجزئة. للتكيف ، انتقل إلى عرض علم الأمراض للعلامة المحددة التي تم اختيارها في 7.3. واستخدام خيارات التكوين في البرنامج.
  6. انقر فوق"تقسيم الكل"إلى خلايا المقطع.
  7. بعد تجزئة الخلية، تابع مع خلايا الفينوتيبينغ. في هذه الخطوة، اختر العلامات اللازمة للفينوتيجين وحدد يدويًا خمس خلايا على الأقل ملطخة بعلامة مختارة. هذا يدرب البرنامج على الكشف تلقائيا عن جميع الخلايا الملطخة بالعلامة المختارة في الصورة.
  8. يتم إنشاء خريطة النمط الظاهري. تحليل للتأكد من أن الخلية الملطخة بالعلامة هي فينوميند بشكل صحيح.
    ملاحظة: يمكن أن تكون الخلايا الظاهرية عملية تكرارية. إذا كان البرنامج غير قادر على فينوبال الخلايا بشكل صحيح، فهذا يعني أن التدريب غير كاف أو غير صحيح. في هذه الحالة، يجب على المستخدم تحديد المزيد من الخلايا يدوياً وإعادة تدريب البرنامج وتكرار هذه الخطوة حتى يكون المستخدم راضياً عن التدريب.
  9. إنشاء مجموعة تسمى "الآخرين" وتشمل الخلايا التي لم تلطخ لأي من علامات.
    ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لتدريب البرنامج لاستبعاد جميع الخلايا غير الملطخة من phenotyping.

8. تصدير الصور وجداول التحليل

  1. انقر على زر التصدير لعرض لوحة إعدادات التصدير.
  2. في "دليل التصدير"، انقر فوق استعراض لتحديد موقع لتصدير الصور.
  3. في "خيارات تصدير الصور"، اختر تنسيق إخراج الصورة.
  4. في قائمة "الصور للتصدير"، حدد الصور التي سيتم تصديرها. "الصورة المركبة" هي الصورة غير المختلطة الزائفة النهائية. "طرق عرض علم الأمراض" هي صور برايتفيلد محاكاة فردية و "الصور المكونة (TIFF متعددة الصور)" هو ملف TIFF متعدد الصور لبيانات المكونات التي يمكن استخدامها من قبل برامج تحليل الطرف الثالث.
  5. انقر فوق زر"تصدير للجميع"لتصدير الصور.
    ملاحظة: يمكن أيضًا تحديد الجداول من التحليل وتصديرها في هذه الخطوة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الكشف عن علامات واحدة ملطخة على أقسام الطحال المجمدة
نظرًا لأن نظام التصوير شبه الآلي يستخدم نظام فلتر الكريستال السائل القابل للتغير (LCTF) الذي يسمح بنطاق أوسع من اكتشاف الطول الموجي25، ونظرًا لعدم تنفيذ خطوات تضخيم الإشارة هنا ، قمنا أولاً بتحسين اكتشاف أجسامنا المضادة الأولية ذات الاقتران لكل علامة على المجهر. يظهر مثال في الشكل 1، حيث كل علامة واحدة ملطخة هي حمراء ملونة زائفة. وقد تم التحقق من صحة الأجسام المضادة المترافقة اليكسا فلور المستخدمة هنا من قبل الشركات لimmunofluorescence والتدفق الخلوي. ومع ذلك، يتم التحقق من صحة كل CP-Cy5.5 fluorophore فقط للتدفق قياس الخلايا. تمكنا من الكشف عن هذا اللون في الشرائح الملطخة بواحدة ، مما يدعم ملاءمة الأجسام المضادة المعتمدة للتدفق للخلايا لاستخدامها في التصوير متعدد الأطياف وتوفير فائدة استخدام هذه الأجسام المضادة للتحقق من صحة الملاحظات باستخدام تقنيتين مختلفتين (أي قياس التدفق الخلوي والتصوير متعدد الأطياف). ثم شرعنا في إجراء التصوير متعدد الأطياف على الأنسجة المجمدة.

الكشف عن الفلور اتّفال متعدد الألوان على طال الماوس المجمد
لاختبار طريقة تلطيخ متعددة وتصوير الطيفي، استخدمنا أنسجة الطحال المجمدة الماوس، والتي لديها وفرة من الخلايا المناعية. ويبين الشكل 2 صورة غير مختلطة من الناحية الطيفية لعلامات مختلفة في قسم من طحال الماوس المجمد. يتم وصف الأجسام المضادة والنسخ والتركيزات المستخدمة للتلطيخ في الجدول 2. تُظهر الصورة الملتقطة جزءًا من منطقة الخلية T تم تحديده من خلال وجود علامات CD3 و CD4 و CD8، محاطة بخلايا النخاع التي تعبر عن CD11b التي تتم ملاحظتها في الغالب في المنطقة الهامشية. ويلاحظ مناطق الخلايا المنتشرة التي تعبر عن Ki67 في المقام الأول في مراكز الإنبات. أظهر خيار "آراء علم الأمراض" لكل علامة نمط تلطيخ فردي داخل الأنسجة. لوحظت أنماط تلطيخ متميزة لCD11b و Ki67 وعلامات CD3 و CD4 و CD8 معًا ، مما يشير إلى أن طريقة تلطيخ متعددة الأبعاد والتصوير الطيفي عملت على الأنسجة المجمدة.

الكشف عن الفلورسينس متعدد الألوان على اللوزتين البشرية المجمدة
بعد اختبار لوحة تلطيخ مناسبة لأنسجة الماوس، ونحن بعد ذلك تقييم لوحة منفصلة لأنسجة اللوزتين البشرية المجمدة. ويبين الشكل 3 صورة غير مختلطة من الناحية الطيفية للعلامات المختلفة المستخدمة. يتم وصف الأجسام المضادة والنسخ والتركيزات المستخدمة للتلطيخ في الجدول 2. تُظهر الصورة الملتقطة مركزان انباتياليان26 يعبران عن خلايا B التي حددتها علامة CD20. تم التعرف على الخلايا المنتشرة في مركز الانبات الجريبي من قبل Ki67. بعض هذه الخلايا المنتشرة كوستامع CD20، وربما تكون centroblasts27، السذاجة B-الخلايا التي تخضع للتضخم الجسدي النشط. كانت المراكز الانباتية الجريبية محاطة بمنطقة الخلية T البينية التي تم تحديدها من خلال تعبير CD3 و CD4 و CD8. مرة أخرى ، لوحظت أنماط تلطيخ متميزة هنا ، مما يؤكد أن المنهجية عملت على نسيج مجمد.

تطبيق التصوير الفلوري متعدد الأطياف على أنسجة ورم الماوس المجمدة
التصوير متعدد الأطياف هو أداة مفيدة لرصد تسلل الخلايا المناعية في الأورام كتشخيص للعلاجات المناعية. ولهذه الغاية، شرعنا في تلطيخ عينة أنسجة ورم الماوس المجمدة والكشف عن تسلل الخلايا المناعية. يستخدم خط الخلية HLF16 كفيروس الورم الحليمي البشري (HPV)+ نموذج ورم سرطان عنق الرحم في HLA-A*0201 الفئران المعدلة وراثيا28. تم تطوير خط الخلية المعدلة وراثيا عن طريق الخلايا الليفية الرئة القلب الترانزستورات من HLA-A *0201 مع HPV16 E6 و E7 oncogenes وH-Ras V1228. الخلايا التائية والأورام المرتبطة بها الضامة هي الخلايا المناعية الأكثر شيوعا الموجودة في الأورام29. يُظهر الشكل 4 صورة غير مختلطة من الناحية الطيفية على قسم ورم HLF16 مجمد إلى جانب وجهات النظر في علم الأمراض؛ وترد أنماط تلطيخ الفردية في الشكل التكميلي 1. يتم وصف الأجسام المضادة والنسخ والتركيزات المستخدمة للتلطيخ في الجدول 2. تُظهر الصورة الملتقطة مناطق الخلايا التائية المخترقة للورم التي تم تحديدها بواسطة علامات CD3 وCD8 إلى جانب وجود أنساب خلايا النخاع الأخرى التي تم تحديدها بواسطة علامة CD11b. المنطقة التي تم التقاطها تظهر أيضا الضامة المرتبطة الورم (TAMs), ربما من النمط الظاهري M2, التي تم الكشف عنها من قبل علامة CD20630,الذي يرتبط ارتباطا وثيقا إلى العديد من الخلايا المنتشرة الكشف عن Ki67+.

يأتي برنامج التعلم الآلي2 مزودًا بميزات مثل تحليلات الأنسجة والخلايا. عادة ما يتم إجراء هذه التحليلات على أنسجة FFPE الملطخة بتضخيم الإشارة. نظرًا لأن منهجيتنا لا تستخدم تضخيم الإشارة ، فقد أردنا اختبار ما إذا كان يمكن استخدام البرنامج لتحليل تلطيخ الأنسجة المجمدة. باستخدام الميزة التكيفية للبرنامج ، تمكنا من تقسيم الخلايا استنادًا إلى علامة نووية وغشاء وخلايا النمط الظاهري استنادًا إلى العلامات المستخدمة للتلطيخ. ويبين الشكل 5 تجزئة الخلايا وخرائط النمط الظاهري وعدد الخلايا الملطخة لكل علامة حللها البرنامج، مما يدل على أنه يمكن استخدام البرنامج للقياس الكمي للتلطيخ المتعدد الأطياف على الأنسجة المجمدة.

Figure 1
الشكل 1: الكشف عن الأجسام المضادة الأولية المترافقة باستخدام مجهر فلتر بلوري سائل قابل للتغير. وقد لطخت الأجسام المضادة الأولية المترافقة مع العلامات المشار إليها على طحال فأر مجمد وتم اكتشافها باستخدام نظام التصوير متعدد الأطياف Vectra 3.0 تحت أهداف 20x. CD3 على اليكسا فلور 488 ، CD8 على اليكسا فلور 594 ، CD11b على Per-CP Cy5.5 ، CD206 على اليكسا فلور 647 ، وكي67 على اليكسا فلور 555 استخدمت. كل علامة هي حمراء ملونة زائفة. لم يتم استخدام أي بقع مضادة على هذه الشرائح. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التصوير متعدد الأطياف على طحال الماوس المجمدة. (أ)مسح الشريحة الكاملة للشريحة الملونة متعددة المرات التي تم التقاطها تحت أهداف 4x. تم اختيار طابع 2 × 2 عبر مناطق مختلفة من الأنسجة للتصوير متعدد الأطياف. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب)صورة مركبة مأخوذة تحت هدف 20x بعد فك الطيفية. تتم الإشارة إلى العلامات ذات الألوان الزائفة وتظهر صورة مكبرة داخل المربع الأحمر بجوار الصورة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (C)وجهات النظر علم الأمراض لكل علامة على حدة. تظهر صورة مكبرة لكل علامة داخل المربع الأحمر بجوار الصورة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التصوير متعدد الأطياف على اللوزة البشرية المجمدة. (أ)مسح الشريحة الكاملة للشريحة الملونة المتعددة التي تم التقاطها تحت هدف 4x. تم اختيار طابع 1 × 1 (669 ميكرومتر × 500 ميكرومتر) عبر مناطق مختلفة من الأنسجة للتصوير متعدد الأطياف. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب)صورة مركبة بعد فك الطيفية التي اتخذت في إطار هدف 20x. تتم الإشارة إلى العلامات ذات الألوان الزائفة وتظهر صورة مكبرة داخل المربع الأحمر بجوار الصورة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (C)وجهات النظر علم الأمراض لكل علامة على حدة. تظهر صورة مكبرة لكل علامة داخل المربع الأحمر بجوار الصورة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التصوير متعدد الأطياف على ورم الماوس المجمدة. تم إجراء التصوير متعدد الأطياف على منطقة 1 × 1 من ورم HLF16 الماوس المجمدة التي اتخذت في إطار هدف 20x. الصورة المركبة (أعلاه). يشار إلى العلامات ذات الألوان الزائفة وتصور وجهات النظر المرضية (أدناه) لكل علامة فردية. تظهر صورة مكبرة لكل علامة داخل المربع الأحمر بجوار الصورة الأصلية. شريط مقياس = 20 ميكرومتر يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تحليل مقطع ورم الماوس المجمد. (أ)خريطة تجزئة الخلية. تم تنفيذ تجزئة الخلايا التكيفية باستخدام inForm. تم تدريب البرنامج على تحديد النوى (الأخضر) والغشاء (الأحمر). (ب)خرائط النمط الظاهري لكل علامة ملطخة. تم تدريب البرنامج على تحديد الأنماط الظاهرية على أساس تلطيخ. تمثل النقطة الملونة العلامة المشار لها. "أخرى" (أسود) يشير إلى الخلايا التي لم تكن ملطخة للعلامة المشار إليها. (C)شريط المؤامرة (يعني ± STDEV) تصور عدد من الخلايا الملونة لكل علامة في صورتين متعددي الأطياف. يشير الرقم إلى الخلايا الظاهرية في كل صورة ولكنه لا يشير إلى ما إذا كانت العلامات مُعبّر عنها. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فلوروفور الحد الأقصى للإثارة (نانومتر) الحد الأقصى للانبعاثات (نانومتر) الكشف المتوقع في مجموعة التصفية (الاسم)
اليكسا فلور 488 488 519 FITC
اليكسا فلور 555 555 580 Cy3 وتكساس الأحمر
اليكسا فلور 594 590 617 تكساس ريد
اليكسا فلور 647 650 668 تكساس الأحمر وCy5
DAPI 350 470 DAPI
PerCP-Cy 5.5 482 690 Cy3، تكساس الأحمر وCy5

الجدول 1: قائمة الفلوروفوروبورس ذات الطول الموجي الأقصى للإثارة والانبعاثات والكشف المتوقع في مجموعات التصفية المناسبة.

المجمدة طحال الماوس
الأجسام المضادة / صبغ استنساخ التركيز (ميكروغرام/مل)
اليكسا فلور 594 CD8a المضادة للفأرة 53-6.7 10
اليكسا فلور 488 مكافحة الماوس CD3 17A2 20
اليكسا فلور 647 مكافحة الماوس CD4 GK1.5 10
PerCP-Cy 5.5 الجرذ المضادCD11b M1/70 2
اليكسا فلور 555 ماوس المضادة كي -67 B56 10
DAPI 0.1
ورم الماوس المجمدة
الأجسام المضادة / صبغ استنساخ التركيز (ميكروغرام/مل)
اليكسا فلور 594 CD8a المضادة للفأرة 53-6.7 20
اليكسا فلور 488 مكافحة الماوس CD3 17A2 20
اليكسا فلور 647 CD206 المضادة للفأرة (MMR) C068C2 5
PerCP-Cy5.5 الجرذ المضادCD11b M1/70 1
اليكسا فلور 555 ماوس المضادة كي -67 B56 0.25
DAPI 0.1
طن ة بشرية مجمدة
الأجسام المضادة / صبغ استنساخ التركيز (ميكروغرام/مل)
اليكسا فلور 594 CD3 المضادة للإنسان UCHT1 10
PerCP/Cyanine5.5 المضادة للإنسان CD4 RPA-T4 4
اليكسا فلور 647 CD8a المضادة للإنسان C8/144B 10
اليكسا فلور 488 ، eBioscience المضادة للإنسان CD20 L26 10
اليكسا فلور 555 ماوس المضادة كي -67 B56 1
DAPI 0.1

الجدول 2: قائمة الأجسام المضادة والمستنسخات والتركيزات المستخدمة.

الشكل التكميلي 1: أنماط تلطيخ فردية للورم HLF16 المجمد بعد فك التمزج الطيفي. شريط مقياس = 20 ميكرومتر يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد استخدمت الأنسجة المجمدة على نطاق واسع لتصوير mIF للكشف تقليديا ثلاث إلى أربع علامات31 على الأنسجة باستخدام الطريقة المباشرة وغير المباشرة32. في الطريقة المباشرة ، يتم اقتران الأجسام المضادة بالأصباغ المفلورة أو النقاط الكمية33 لتسمية الأنسجة ، بينما في الطريقة غير المباشرة ، يتم استخدام الأجسام المضادة الأولية غير المنقبة لتسمية الأنسجة متبوعة بجسم مضاد ثانوي مفلور يترافق على وجه التحديد يتعرف على الأجسام المضادة الأولية. يمكن أيضًا استخدام بعض طرق تلطيخ المتعددة المتزامنة الأخيرة التي تمت مناقشتها سابقًا لتلطيخ الأنسجة المجمدة واكتشاف أكثر من أربع علامات. ولكن تكلفة الكواشف والوقت الذي استغرقه تلطيخ تصبح مكثفة اعتمادا على عدد من علامات يجري الكشف عنها. تقنية أخرى متعددة للأنسجة المجمدة هي رسم الخرائط متعددة الإيبتوب-ليغاند (MELC)34. تتضمن هذه التقنية تلطيخ العينة بالأجسام المضادة المفلورة، والتصوير، والتبييض الضوئي للفلوروفور. التحذير الرئيسي من هذه التقنية هو أن حقل واحد فقط أو منطقة من الأنسجة يمكن أن تكون متعددة. من أجل تعدد الحقول أو المناطق الأخرى التقنية تحتاج إلى تنفيذيدويا، وهو مضيعة للوقت، أو يتطلب التشغيل الآلي، وهو مكلف. تمكنت مجموعة واحدة35 من اكتشاف ستة ألوان على الأنسجة المجمدة باستخدام مزيج من تلطيخ مباشر وغير مباشر وTSA. ومع ذلك ، استغرق تلطيخ الأنسجة 2 أيام. بالمقارنة، تستخدم منهجيتنا طريقة تلطيخ متعددة متزامنة تتضمن تطبيق مزيج من خمسة أجسام مضادة مترافقة مباشرة بالإضافة إلى DAPI لتلطيخ الأنسجة المجمدة في غضون 90 دقيقة. وعلاوة على ذلك، وباستخدام نظام تصوير الفلورسينس متعدد الأطياف شبه الآلي، تمكنا من فصل ست علامات كشفاً طيافياً في الطحال المتجمد واللوزتين وأنسجة الورم باستخدام تقنية تلطيخ متعددة الأبعاد المبسطة هذه. توفر مجموعات تصفية Cy3 وTexas Red ومجموعات تصفية Cy5 المتوفرة على المجهر فرصًا للكشف عن الفلوروفوريات الإضافية ، وبالتالي قد تزيد من عدد العلامات التي يمكن اكتشافها في وقت واحد في الأنسجة المجمدة.

تعدد البقع باستخدام نهج TSA على أنسجة FFPE يتطلب خطوة استرجاع مستضد تليها تسلسل وضع العلامات والغسيل وتجريد الخطوات. ويتراوح إجراء الإجراء بين يوم إلى يومين حسب أوقات الحضانة المستخدمة للأجسام المضادة6. في الآونة الأخيرة، وذلك باستخدام معالج الأنسجة microfluidic، تم تنفيذ تلطيخ أربعة plex باستخدام نهج TSA على أنسجة FFPE تحت 90 دقيقة. يمكن تنفيذ تقنيات متعددة أخرى لأنسجة FFPE تحت 4-5 ساعة باستخدام أداة تلطيخ آلية. ومع ذلك ، فإن خطوات استرجاع المستضد المناسبة تحتاج إلى تحسين لضمان توافر epitope للأجسام المضادة36، والتي بدورها تعتمد على النظر الدقيق في استنساخ الأجسام المضادة ، فضلا عن ترتيب العلامات التي يتم الكشف عنها. على سبيل المثال، لا يمكن استخدام بعض المستنسخات المضادة من CD3، لأنه في وقت لاحق CD4 و CD8 لا يتم الكشف عن الأجسام المضادة37. وبالمثل، هناك تباين الكشف عن المستضد بين استنساخ الأجسام المضادة المتاحة17،18. ولذلك ، فإن تلطيخ متعدد الأنسجة FFPE يتطلب التحسين من استنساخ الأجسام المضادة ، وتركيزاتها ، والترتيب الذي هي ملطخة ، وكلها تستغرق وقتا طويلا. في المقابل ، فإن عدم معالجة الأنسجة الواسعة للأنسجة المجمدة يسمح باستخدام نسخ مختلفة من الأجسام المضادة ذات خصوصية عالية. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استنساخ الأجسام المضادة المتاحة للأنسجة المجمدة يمكن استخدامها في قياس الخلايا التدفق وELISA، مما يسمح التحقق من الصحة في وقت واحد عبر مختلف المقالات. هندسة الأنسجة هي أيضا مصدر قلق في الأنسجة المجمدة38. تلطيخ متعددة تظهر هنا على الأنسجة المجمدة أسرع بكثير من نهج TSA. تتطلب تركيبات الفلوروفور اختيارًا دقيقًا للعلامات لضمان عدم إعاقة الأجسام المضادة لبعضها البعض بشكل درجي ، خاصة عندما يتم اكتشاف مستضدات مختلفة يتم التعبير عنها في نفس الموقع الخلوي. اخترنا علامات تلطخ خلايا مختلفة على الفلوروفوريات المنفصلة من الناحية الطيفية، مما يتيح الكشف بشكل أفضل. تركيزات الأجسام المضادة تتطلب أيضا التحسين ، ولكن لأن بروتوكول تلطيخ سريع ، والوقت العام الذي استغرقه التحسين ليست مضيعة للوقت. قد يكون التحذير من طريقتنا هو عدم القدرة على اكتشاف علامات التعبير المنخفضة في الأنسجة. بعض أساليب تلطيخ متعددة على أنسجة FFPE تنطوي على خطوة تضخيم الإشارة التي هي مفيدة للكشف عن علامات التعبير منخفضة. ومع ذلك، يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية والثالثة لتعزيز الإشارة. في مثل هذه الحالات، يجب تجنب التفاعل المتبادل مع الأجسام المضادة في الفريق لمنع التفسير غير الصحيح للنتائج.

بالإضافة إلى طحال الفأر والأنسجة اللوزة البشرية، التي هي غنية في الخلايا المناعية، وقد استخدمنا أنسجة الورم كمثال على التصوير الفلوري متعدد الأطياف المقترحة من الأنسجة المجمدة. وقد قدم التصوير الفلوري متعدد الأطياف في الأورام معلومات قيمة، مثل توصيف البيئة الدقيقة الورم (TME)39،وتوقع نجاح نقل الخلايا T بالتبني في الورم الميلانيني الخبيث40،وتميز البروتينات في مسارات نقل إشارة الورم41. باستخدام علامات محددة للخلايا المناعية الموجودة عادة في الأورام، تمكنا من الكشف عن تسلل خلايا CD8 T وTAMs في أنسجة الورم HLF16 المستخدمة في هذه الدراسة. استخدمنا برنامج التعلم الآلي لتقسيم بنجاح وخلايا النمط الظاهري. تعدد تلطيخ لأنسجة FFPE يستخدم خطوة تضخيم إشارة لتعزيز نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) التي تساعد على معالجة الصور والقياس الكمي42،43. وقد استخدم برنامج التعلم الآلي لإجراء تحليلات على أنسجة FFPE الملطخة بتضخيم الإشارة2. المنهجية الحالية هنا لا تستخدم تضخيم الإشارة ، لكننا تمكنا من تقسيم بنجاح والخلايا الظاهرية باستخدام البرنامج. لمزيد من التحليل (على سبيل المثال، التعبير المشترك للنوع الظاهري والعلاقات المكانية) والتفسير الدقيق للكمية، يتطلب التدريب على البرامج التحقق من الصحة باستخدام مجموعة التدريب ومجموعة الاختبار ومجموعة التحقق من الصحة. في عملية تكرارية، يتم استخدام مجموعة واحدة من الصور (أي مجموعة التدريب) لتدريب برنامج التعلم الآلي لتحديد الأنماط الظاهرية حتى تكون تنبؤات النموذج لمجموعة منفصلة من الصور (أي مجموعة الاختبار) دقيقة. بعد اكتمال التدريب ، يتم تحليل دفعة نهائية من الصور (أي مجموعة التحقق من الصحة) لمعرفة ما إذا كان هناك الإفراط في التركيب.

وفي الختام، فإن المنهجية المعروضة هنا هي طريقة سريعة لإجراء تصوير الفلورسينس متعدد الأطياف باستخدام الأنسجة المجمدة. الأسلوب مفيد للكشف عن العلامات التي الأجسام المضادة غير متوفرة أو لا يمكن الكشف عنها في أنسجة FFPE. بالاقتران مع برنامج التعلم الآلي، يمكن أن يسهل الوقت الذي تستغرقه لإجراء التحليلات الكمية بشكل كبير التشخيصات السريرية والسريرية السريعة ويمكن تطبيقها في مجال النسخ المكاني عالي الاستبانة الذي يستخدم الأنسجة المجمدة44.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم توفير التوجيه التصويري والتحليل من قبل مركز موارد البحوث - علم الأنسجة البحثي ومختبر تصوير الأنسجة الأساسية في جامعة إلينوي في شيكاغو التي أنشئت بدعم من مكتب نائب رئيس الجامعة للبحوث. تم دعم العمل من قبل المعاهد القومية للصحة / NCI RO1CA191317 إلى CLP ، من قبل المعاهد القومية للصحة / NIAMS (منحة SBDRC 1P30AR075049-01) إلى الدكتور A. Paller ، وبدعم من مركز روبرت H. Lurie الشامل للسرطان إلى مركز تقييم المناعة في جامعة نورث وسترن.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone - 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone - L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone - UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone - C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone - C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone - GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1x Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone - M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1x ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33, (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70, (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50, (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (1), 13380 (2017).
  6. Wickenhauser, C., et al. Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. Pico de Coaña, Y. Springer. New York. 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, (1), 47 (2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24, (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11, (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20, (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19, (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174, (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51, (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54, (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26, (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21, (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62, (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82, (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125, (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22, (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12, (6), 479 (1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19, (1), 011017 (2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122, (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8, (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32, (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42, (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133, (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2, (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24, (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. 03 (2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65, (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202, (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46, (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244, (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2, (14), 93652 (2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19, (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7, (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120, (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. 563338 (2019).
طريقة سريعة لتصوير الفلورسينس متعدد الأطياف لأقسام الأنسجة المجمدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).More

Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter