Vi beskriver en rask fargingsmetode for å utføre multispektral avbildning på frosne vev.
Multispektral fluorescensavbildning på formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) vev gjør det mulig å oppdage flere markører i en enkelt vevsprøve som kan gi informasjon om antigenkouttrykk og romlig fordeling av markørene. Imidlertid kan mangel på egnede antistoffer for formalin-fikset vev begrense arten av markører som kan oppdages. I tillegg er fargemetoden tidkrevende. Her beskriver vi en rask metode for å utføre multispektral fluorescensavbildning på frosne vev. Metoden inkluderer fluoroforen kombinasjoner som brukes, detaljerte trinn for farging av mus og menneskelig frosset vev, og skanning, oppkjøp og analyse prosedyrer. For fargingsanalyse brukes et kommersielt tilgjengelig semiautomatisert multispektralt fluorescensbildesystem. Gjennom denne metoden ble opptil seks forskjellige markører farget og oppdaget i en enkelt frossen vevsseksjon. Maskinlæringsanalyseprogramvaren kan fenotypeceller som kan brukes til kvantitativ analyse. Metoden som er beskrevet her for frosne vev er nyttig for påvisning av markører som ikke kan oppdages i FFPE vev eller som antistoffer ikke er tilgjengelige for FFPE vev.
Nylige fremskritt innen mikroskopiske bildeteknikker har betydelig forbedret vår kunnskap og forståelse av biologiske prosesser og sykdomstilstander. Ved situ påvisning av proteiner i vev via kromogen immunohistochemistry (IHC) utføres rutinemessig i patologi. Imidlertid er påvisning av flere markører ved hjelp av kromogen IHC farging utfordrende1 og nyere metoder for å bruke multipleks immunofluorescens (mIF) farging tilnærminger, karakterisert ved at flere biologiske markører er merket på en enkelt vevsprøve, blir utviklet. Påvisning av flere biologiske markører er nyttig, fordi informasjon relatert til vevsarkitektur, romlig fordeling av celler og antigenkouttrykk er alle fanget i en enkelt vevsprøve2. Bruken av multispektral fluorescensbildeteknologi har gjort påvisning av flere biologiske markører mulig. I denne teknologien, ved hjelp av spesifikk optikk fluorescensspektra av hver enkelt fluoroforfor kan skilles eller “ublandet”, slik at påvisning av flere markører uten spektral crosstalk3. Multispektral fluorescensavbildning blir en kritisk tilnærming i cellebiologi, preklinisk legemiddelutvikling, klinisk patologi og tumorimmunprofilering4,5,6. Viktigere, spacial fordeling av immunceller (spesielt CD8 T celler) kan tjene som en prognostisk faktor for pasienter med eksisterende svulster7.
Ulike tilnærminger til multipleks fluorescens farging er utviklet og kan utføres enten samtidig eller sekvensielt. I den samtidige fargemetoden legges alle antistoffene sammen som en cocktail i et enkelt trinn for å merke vevet. UltraPlex-teknologi bruker en cocktail av hapten-konjugerte primære antistoffer etterfulgt av en cocktail av fluorofofan-konjugerte anti-hapten sekundære antistoffer. InSituPlex-teknologi8 bruker en cocktail av unike DNA-konjugerte primære antistoffer som samtidig legges til vevet etterfulgt av et forsterkningstrinn og til slutt fluoroforiske konjugerte sonder som er komplementære til hver unike DNA-sekvens på det primære antistoffet. Begge disse teknologiene gjør det mulig å oppdage fire markører pluss 4′,6-diamino-2-fenylindzol (DAPI) for kjernefysisk farging. To andre tilnærminger for samtidig multipleksfarging er basert på sekundær ionmassespektrometri9. Hyperion Imaging System bruker bildemasse cytometri10 for å oppdage opptil 37 markører. Denne teknologien bruker en cocktail av metall-konjugerte antistoffer for å flekke vevet, og bestemte områder av vevet er ablated av en laser og overføres til et massecytometer hvor metallionene oppdages. En annen lignende teknologi er IONPath, som bruker multipleksert ion strålebildeteknologi11. Denne teknologien bruker et modifisert massespektrometriinstrument og en oksygenionkilde i stedet for laser for å ablate metallkonjugerte antistoffer. Mens alle disse samtidige multipleksfargingsmetodene muliggjør påvisning av flere markører, kan kostnadene som er involvert for å konjugere DNA, haptens eller metaller til antistoffer, tap av vev på grunn av ablasjon og omfattende bildebehandling for unmixing ikke undervurderes. Videre er sett og fargingprotokoller for tiden bare tilgjengelige for FFPE-vev, og utvikling av tilpassede paneler innebærer ekstra tid og utgifter.
Den sekvensielle multipleksfarfargingsmetoden, derimot, inkluderer merking av vevet med et antistoff mot en markør, stripping for å fjerne antistoffet, etterfulgt av sekvensielle gjentakelser av denne prosessen for å merke flere markører12. Tyramidsignalforsterkningen (TSA) er den mest brukte sekvensielle multipleksjonsmetoden. To andre multipleksingsteknologier bruker en kombinasjon av samtidige og sekvensielle fargingsmetoder. CODEX-plattformen13 benytter en cocktail av antistoffer som er konjugert til unike DNA oligonucleotide sekvenser som til slutt er merket med en fluorofor i bruk av et indeksert polymeriseringstrinn etterfulgt av avbildning, stripping og gjentaprosessen for å oppdage opptil 50 markører. MultiOmyx multiplex farging tilnærming14 er en iterasjon av farging med en cocktail av tre til fire fluorofor-konjugerte antistoffer, bildebehandling, slukke fluoroforer, og gjenta denne syklusen for å oppdage opptil 60 markører på en enkelt seksjon. I likhet med den samtidige multipleksfargingsmetoden, mens et bredt spekter av markører kan oppdages, er tiden som er involvert i farging, bildeoppkjøp, behandling og analyse omfattende. Stripping / slukking trinn innebærer oppvarming og / eller bleking vevprøven og dermed den sekvensielle multipleks farging tilnærming er ofte utført på FFPE vev som opprettholder vev integritet ved oppvarming eller bleking.
Formalin fiksering og påfølgende parafin innebygging utføres lett i en klinisk setting, vev blokker er lett å lagre, og flere multipleks farging protokoller er tilgjengelig. Imidlertid er behandlingen, innebygging og deparaffinisering av FFPE vev, samt antigen gjenfinning15, en prosess der antistoffer bedre kan få tilgang til epitoper, tidkrevende. Videre bidrar behandlingen involvert i FFPE vev til autofluorescens16 og masker mål epitoper, noe som resulterer i variabilitet og mangel på antistoff klone tilgjengelig for å oppdage antigener i FFPE vev17,18,19. Et eksempel er humant leukocytter antigen (HLA) klasse jeg alleles20. I motsetning innebærer snap frysing av vev ikke omfattende behandlingstrinn før eller etter fiksering, omgå behovet for antigen henting21,22, og gjør det gunstig for å oppdage et bredere spekter av mål. Derfor kan bruk av frosne vev for multispektral fluorescensavbildning være verdifullt for å oppdage mål for prekliniske og kliniske studier.
Gitt de ovennevnte begrensningene ved bruk av FFPE vev, spurte vi om multispektral fluorescensavbildning kan utføres på frosne vev. For å løse dette spørsmålet testet vi en samtidig multipleksfargingsmetode ved hjelp av et panel av fluorofor-konjugerte antistoffer for å oppdage flere antigener og analyserte farging ved hjelp av et halvautomatisert multispektralt bildesystem. Vi var i stand til å samtidig farge opp til seks markører i en enkelt vev seksjon innen 90 min.
Frosne vev har i stor grad blitt brukt til mIF-avbildning for tradisjonelt å oppdage tre til fire markører31 på et vev ved hjelp av den direkte og indirekte metoden32. I den direkte metoden blir antistoffer konjugert til fluorescerende fargestoffer eller kvanteprikker33 for å merke vevet, mens i den indirekte metoden brukes et ukonjugert primært antistoff til å merke vevet etterfulgt av et fluorofhore-konjugert sekundært antistoff som spesifik…
The authors have nothing to disclose.
Imaging og analyse veiledning ble gitt av Research Resources Center – Research Histology og Tissue Imaging Core ved University of Illinois i Chicago etablert med støtte fra kontoret til visekansler for forskning. Arbeidet ble støttet av NIH/NCI RO1CA191317 til CLP, av NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) til Dr. A. Paller, og ved støtte fra Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center til Immunotherapy Assessment Core ved Northwestern University.
Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone – 17A2; primary conjugated antibody |
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone – L26; primary conjugated antibody |
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone – UCHT1; primary conjugated antibody |
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody |
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone – C8/144B; primary conjugated antibody |
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone – C068C2; primary conjugated antibody |
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone – GK1.5; primary conjugated antibody |
C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
Human Serum 1X | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody |
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone – M1/70; primary conjugated antibody |
Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
Superblock 1X | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |