Summary

Une méthode rapide pour l’imagerie multispectrale de fluorescence des sections de tissu congelé

Published: March 30, 2020
doi:

Summary

Nous décrivons une méthode de coloration rapide pour effectuer l’imagerie multispectrale sur les tissus congelés.

Abstract

L’imagerie multispectrale de fluorescence sur les tissus formalin-fixes de paraffine-embedded (FFPE) permet la détection de marqueurs multiples dans un seul échantillon de tissu qui peut fournir des informations sur la coexpression d’antigène et la distribution spatiale des marqueurs. Cependant, un manque d’anticorps appropriés pour les tissus formalin-fixes peut restreindre la nature des marqueurs qui peuvent être détectés. En outre, la méthode de coloration prend beaucoup de temps. Ici, nous décrivons une méthode rapide pour effectuer la formation image de fluorescence multispectrale sur les tissus congelés. La méthode comprend les combinaisons de fluorophore utilisées, des étapes détaillées pour la coloration des tissus congelés de souris et humains, et les procédures de numérisation, d’acquisition et d’analyse. Pour l’analyse des colorants, un système d’imagerie multispectral de fluorescence semi-automatique disponible dans le commerce est utilisé. Grâce à cette méthode, jusqu’à six marqueurs différents ont été tachés et détectés dans une seule section de tissu congelé. Le logiciel d’analyse de l’apprentissage automatique peut cellules phénotype qui peuvent être utilisés pour l’analyse quantitative. La méthode décrite ici pour les tissus congelés est utile pour la détection de marqueurs qui ne peuvent pas être détectés dans les tissus de la FFPE ou pour lesquels les anticorps ne sont pas disponibles pour les tissus FFPE.

Introduction

Les progrès récents dans les techniques d’imagerie microscopique ont considérablement amélioré nos connaissances et notre compréhension des processus biologiques et des états pathologiques. La détection in situ des protéines dans les tissus par immunohistochimie chromogénique (IHC) est régulièrement effectuée en pathologie. Cependant, la détection de marqueurs multiples utilisant la coloration chromogénique de LHC est difficile1 et de nouvelles méthodes pour employer des approches de coloration d’immunofluorescence multiplex (mIF), où plusieurs marqueurs biologiques sont étiquetés sur un seul échantillon de tissu, sont en cours de développement. La détection de marqueurs biologiques multiples est utile, parce que les informations liées à l’architecture des tissus, la distribution spatiale des cellules, et la co-expression des antigènes sont tous capturés dans un seul échantillon de tissu2. L’utilisation de la technologie d’imagerie par fluorescence multispectrale a rendu possible la détection de plusieurs marqueurs biologiques. Dans cette technologie, en utilisant des optiques spécifiques les spectres de fluorescence de chaque fluorophore individuel peuvent être séparés ou «non mélangés», permettant la détection de marqueurs multiples sans aucune traque spectrale3. L’imagerie multispectrielle de fluorescence devient une approche critique dans la biologie cellulaire, le développement préclinique de drogue, la pathologie clinique, et le profilage immunitaire de tumeur4,,5,6. Fait important, la distribution spaciale des cellules immunitaires (en particulier les lymphocytes T CD8) peut servir de facteur pronostique pour les patients atteints de tumeurs existantes7.

Diverses approches de coloration de fluorescence multiplex ont été développées et peuvent être effectuées simultanément ou séquentiellement. Dans la méthode de coloration simultanée, tous les anticorps sont ajoutés ensemble comme un cocktail en une seule étape pour étiqueter le tissu. La technologie UltraPlex utilise un cocktail d’anticorps primaires conjugués à l’hapten, suivi d’un cocktail d’anticorps secondaires anti-hapten conjugués au fluorophore. InSituPlex technology8 utilise un cocktail d’anticorps primaires conjugués à l’ADN uniques qui sont simultanément ajoutés au tissu suivis d’une étape d’amplification et enfin de sondes épurées au fluorophore qui sont complémentaires à chaque séquence d’ADN unique sur l’anticorps primaire. Ces deux technologies permettent la détection de quatre marqueurs plus 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) pour la coloration nucléaire. Deux autres approches pour la coloration simultanée de multiplex sont basées sur la spectrométrie secondaire de masse d’ion9. Le système d’imagerie Hyperion utilise la cytométrie de massed’imagerie 10 pour détecter jusqu’à 37 marqueurs. Cette technologie utilise un cocktail d’anticorps conjugués au métal pour tacher les tissus, et des zones spécifiques des tissus sont ablés par un laser et transférées à un cytomètre de masse où les ions métalliques sont détectés. Une autre technologie similaire est l’IONPath, qui utilise la technologie d’imagerie à faisceau d’ions multiplexed11. Cette technologie utilise un instrument de spectrométrie de masse modifié et une source d’ions d’oxygène au lieu d’un laser pour abler les anticorps conjugués au métal. Bien que toutes ces approches simultanées de coloration multiplexe permettent la détection de marqueurs multiples, les coûts impliqués pour conjuguer l’ADN, les haptens ou les métaux aux anticorps, la perte de tissu due à l’ablation, et le traitement d’image étendu pour le semage ne peut pas être sous-estimé. En outre, les kits et les protocoles de coloration ne sont actuellement disponibles que pour les tissus FFPE et le développement de panneaux personnalisés implique plus de temps et de dépenses.

La méthode séquentielle de coloration multiplex, en revanche, comprend l’étiquetage du tissu avec un anticorps à un marqueur, le décapage pour enlever l’anticorps, suivi par des répétitions séquentielles de ce processus pour étiqueter plusieurs marqueurs12. L’amplification du signal de tyramide (TSA) est la méthode de multiplexe séquentielle la plus fréquemment utilisée. Deux autres technologies de multiplexage utilisent une combinaison de méthodes de coloration simultanées et séquentielles. La plate-forme CODEX13 utilise un cocktail d’anticorps conjugués à des séquences uniques d’oligonucléotide d’ADN qui sont finalement étiquetés avec un fluorophore à l’aide d’une étape de polymérisation indexée suivie de l’imagerie, le décapage et la répétition du processus pour détecter jusqu’à 50 marqueurs. L’approche de coloration multiplexe MultiOmyx14 est une itération de colorant avec un cocktail de trois à quatre anticorps fluorophore-conjugués, imagerie, étanchéité des fluorophores, et répétant ce cycle pour détecter jusqu’à 60 marqueurs sur une seule section. Semblable à la méthode simultanée de coloration multiplex, tandis qu’un large éventail de marqueurs peuvent être détectés, le temps impliqué dans la coloration, l’acquisition d’image, le traitement, et l’analyse est étendu. L’étape de décapage/étanchéité consiste à chauffer et/ou à blanchir l’échantillon de tissu et, par conséquent, l’approche séquentielle de coloration multiplexe est couramment pratiquée sur les tissus ffPE qui maintiennent l’intégrité des tissus lors du chauffage ou du blanchiment.

La fixation de formaline et l’intégration subséquente de paraffine sont facilement exécutées dans un arrangement clinique, les blocs de tissu sont faciles à stocker, et plusieurs protocoles de coloration de multiplexe sont disponibles. Cependant, le traitement, l’intégration et la deparaffinisation des tissus FFPE, ainsi que la récupération d’antigène15, un processus par lequel les anticorps peuvent mieux accéder aux épitopes, prend beaucoup de temps. En outre, le traitement impliqué dans les tissus FFPE contribue à l’autofluorescence16 et les masques ciblent les épitopes, résultant en la variabilité et le manque de clone d’anticorps disponibles pour détecter les antigènes dans les tissus FFPE17,18,19. Un exemple est l’antigène leucocyte humain (HLA) classe I allèles20. En revanche, la congélation rapide des tissus n’implique pas d’étapes de traitement étendues avant ou après la fixation, contournant le besoin de récupération d’antigène21,22, et le rendant bénéfique pour détecter un plus large éventail de cibles. Par conséquent, l’utilisation de tissus congelés pour l’imagerie multispectrale de fluorescence peut être utile pour détecter des cibles pour des études précliniques et cliniques.

Étant donné les limites mentionnées ci-dessus lors de l’utilisation des tissus FFPE, nous avons demandé si l’imagerie multispectrale de fluorescence peut être effectuée sur les tissus congelés. Pour répondre à cette question, nous avons testé une méthode simultanée de coloration multiplexe à l’aide d’un panel d’anticorps fluorophore-conjugués pour détecter de multiples antigènes et analysé la coloration à l’aide d’un système d’imagerie multispectral semi-automatique. Nous avons pu tacher simultanément jusqu’à six marqueurs dans une seule section tissulaire dans un rayon de 90 min.

Protocol

La rate de souris et les tissus de tumeur de souris de HLF1623 ont été obtenus de notre laboratoire. Des tissus d’amygdale humaine ont été achetés auprès d’un vendeur commercial. Les détails sont fournis dans la Table des Matériaux. 1. Embedding tissu Intégrer le tissu frais dans la solution OCT (température de coupe optimale) et geler les cheveux à l’aide de glace sèche ou d’azote liquide. Conserver les tissus à…

Representative Results

Détection de marqueurs à une seule téale sur des sections de rate congeléesComme le système d’imagerie semi-automatique utilise un système de filtre à thon en cristal liquide (LCTF) qui permet une plus large gamme de détection de longueur d’onde25, et parce qu’aucune étape d’amplification du signal n’a été effectuée ici, nous avons d’abord optimisé la détection de nos anticorps conjugués primaires pour chaque marqueur au microscope. Un exemple est mo…

Discussion

Les tissus congelés ont été largement utilisés pour l’imagerie mIF pour détecter traditionnellement trois à quatre marqueurs31 sur un tissu en utilisant la méthode directe et indirecte32. Dans la méthode directe, les anticorps sont conjugués aux colorants fluoréscing ou points quantiques33 pour étiqueter le tissu, tandis que dans la méthode indirecte, un anticorps primaire non judiciaire est utilisé pour étiqueter le tissu suivi d’u…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Des conseils en imagerie et en analyse ont été fournis par le Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core de l’Université de l’Illinois à Chicago, établi avec le soutien du bureau du vice-chancelier de la recherche. Les travaux ont été soutenus par NIH/NCI RO1CA191317 à CLP, par NIH/NIAMS (subvention du CRST 1P30AR075049-01) au Dr A. Paller, et par le soutien du Centre complet du cancer Robert H. Lurie au centre d’évaluation de l’immunothérapie de l’Université Northwestern.

Materials

Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone – 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone – L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone – UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone – C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone – C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone – GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1X Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone – M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1X ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope

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Cite This Article
Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).

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