Vi beskriver en hurtig farvningmetode til at udføre multispektral billeddannelse på frosset væv.
Multispektraderende fluorescensbilleddannelse på formalin-fast paraffin-indlejret (FFPE) væv gør det muligt at påvise flere markører i en enkelt vævsprøve, der kan give oplysninger om antigen samekspression og rumlig fordeling af markørerne. Manglen på egnede antistoffer mod formalinfast væv kan dog begrænse arten af markører, der kan påvises. Desuden er farvningsmetoden tidskrævende. Her beskriver vi en hurtig metode til at udføre multispektral fluorescensscanning på frosset væv. Metoden omfatter fluorophore kombinationer, der anvendes, detaljerede trin til farvning af mus og menneskelige frosne væv, og scanning, erhvervelse og analyse procedurer. Til farvningsanalyse anvendes et kommercielt tilgængeligt halvautomatisk multispektral fluorescensbilledsystem. Ved hjælp af denne metode blev op til seks forskellige markører farves og detekteret i en enkelt frossen vævssektion. Machine learning analysis software kan fænotypeceller, der kan bruges til kvantitativ analyse. Den metode, der er beskrevet her for frosset væv, er nyttig til påvisning af markører, der ikke kan påvises i FFPE-væv, eller for hvilke der ikke er antistoffer til rådighed for FFPE-væv.
De seneste fremskridt inden for mikroskopiske billeddannelsesteknikker har forbedret vores viden og forståelse af biologiske processer og sygdomstilstande betydeligt. In situ påvisning af proteiner i væv via kromoogen immunhistokemi (IHC) udføres rutinemæssigt i patologi. Påvisning af flere markører ved hjælp af kromoogen IHC-farvning er imidlertid udfordrende1, og nyere metoder til anvendelse af multiplex immunofluorescens (mIF) farvningsmetoder, hvor flere biologiske markører er mærket på en enkelt vævsprøve, er under udvikling. Påvisning af flere biologiske markører er nyttig, fordi oplysninger om vævsarkitektur, rumlig fordeling af celler og antigen-samekspression alle er fanget i en enkelt vævsprøve2. Brugen af multispektral fluorescensbilleddannelsesteknologi har gjort det muligt at påvise flere biologiske markører. Ved hjælp af specifik optik kan fluorescenssen for hver enkelt fluorophore adskilles eller “ublandede”, hvilket gør det muligt at påvise flere markører uden spektralkrydstale3. Multispektraderende fluorescens imaging er ved at blive en kritisk tilgang i cellebiologi, præklinisk lægemiddeludvikling, klinisk patologi, og tumor immun-profilering4,5,6. Vigtigere er det, den spacial fordeling af immunceller (specielt CD8 T-celler) kan tjene som en prognosefaktor for patienter med eksisterende tumorer7.
Forskellige tilgange til multiplex fluorescens farvning er blevet udviklet og kan udføres enten samtidigt eller sekventialt. I den samtidige farvningsmetode tilsættes alle antistofferne sammen som en cocktail i et enkelt trin for at mærke vævet. UltraPlex-teknologi bruger en cocktail af hapten-konjugerede primære antistoffer efterfulgt af en cocktail af fluorophore-konjugerede anti-hapten sekundære antistoffer. InSituPlex teknologi8 bruger en cocktail af unikke DNA-konjugerede primære antistoffer, der samtidig føjes til vævet efterfulgt af en forstærkning trin og endelig fluorophore-konjugerede sonder, der supplerer hver unik DNA-sekvens på det primære antistof. Begge disse teknologier gør det muligt at påvise fire markører plus 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) til nuklear farvning. To andre metoder til samtidig multiplexfarvning er baseret på sekundært ionmassespektrometri9. Hyperion Imaging System bruger billeddannelse masse cytometri10 til at opdage op til 37 markører. Denne teknologi bruger en cocktail af metal-konjugerede antistoffer til pletter væv, og specifikke områder af væv er ablated af en laser og overføres til en masse cytometer, hvor metalioner detekteres. En anden lignende teknologi er IONPath, som bruger multiplexed ion stråle imaging teknologi11. Denne teknologi bruger et modificeret massespektrometriinstrument og en iltionskilde i stedet for laser til at ablatede de metalkonjugerede antistoffer. Mens alle disse samtidige multiplex farvning tilgange gør det muligt at påvise flere markører, omkostningerne forbundet med konjugering DNA, haptens, eller metaller til antistoffer, tab af væv på grund af ablation, og den omfattende billedbehandling for unmixing kan ikke undervurderes. Desuden er kits og farvningprotokoller i øjeblikket kun tilgængelige for FFPE-væv, og udvikling af brugerdefinerede paneler medfører yderligere tid og udgifter.
Den sekventielle multiplex farvning metode, derimod, omfatter mærkning af vævet med et antistof til en markør, stripning at fjerne antistoffet, efterfulgt af sekventielle gentagelser af denne proces til at mærke flere markører12. Forstærkningen af tyramidsignalet (TSA) er den hyppigst anvendte sekventielle multipleksingmetode. To andre multipleksing teknologier bruger en kombination af samtidige og sekventielle farvning metoder. CODEX-platformen13 anvender en cocktail af antistoffer, der er konjugeret til unikke DNA-oligonukleotidsekvenser, der i sidste ende mærkes med en fluorophore ved hjælp af et indekseret polymeriseringstrin efterfulgt af billeddannelse, stripning og gentagelse af processen for at detektere op til 50 markører. MultiOmyx multiplex-farvningsmetoden14 er en gentagelse af farvning med en cocktail af tre til fire fluorophore-konjugerede antistoffer, billeddannelse, dæmpning af fluorophores og gentagelse af denne cyklus for at detektere op til 60 markører på en enkelt sektion. Svarende til den samtidige multiplex farvning metode, mens en bred vifte af markører kan detekteres, den tid, der er involveret i farvning, billede erhvervelse, behandling og analyse er omfattende. Stripping / quenching trin indebærer opvarmning og / eller blegning af vævsprøve og dermed den sekventielle multiplex farvning tilgang er almindeligt udført på FFPE væv, der opretholder væv integritet ved opvarmning eller blegning.
Formalin fiksering og efterfølgende paraffin indlejring er let udføres i en klinisk indstilling, væv blokke er nemme at gemme, og flere multiplex farvning protokoller er tilgængelige. Men, behandling, indlejring, og deparaffinization af FFPE væv, samt antigen hentning15, en proces, hvorved antistoffer bedre kan få adgang epitoper, er tidskrævende. Desuden bidrager den behandling, der er involveret i FFPE-væv, til autofluorescens16 og masker er rettet mod epitoper, hvilket resulterer i variabilitet og mangel på antistofklon til rådighed til påvisning af antigener i FFPE-væv17,18,19. Et eksempel er det humane leukocytantigen (HLA) klasse I alleler20. I modsætning hertil indebærer fastfrysning af væv ikke omfattende behandlingstrin før eller efter fastsættelse, omgåelse af behovet for antigenudtagning21,22og gør det gavnligt at påvise en bredere vifte af mål. Derfor kan det være værdifuldt at bruge frosset væv til multispektral fluorescensscanning til at påvise mål for prækliniske og kliniske undersøgelser.
I betragtning af ovennævnte begrænsninger ved brug af FFPE-væv spurgte vi, om multispektral fluorescensbilleddannelse kan udføres på frosset væv. For at løse dette spørgsmål, vi testede en samtidig multiplex farvning metode ved hjælp af et panel af fluorophore-konjugerede antistoffer til at opdage flere antigener og analyseret farvning ved hjælp af en semiautomated multispektral imaging system. Vi var i stand til samtidig plette op til seks markører i en enkelt vævssektion inden for 90 min.
Frosset væv er i vid udstrækning blevet anvendt til mIF-billeddannelse til traditionelt at detektere tre til fire markører31 på et væv ved hjælp af den direkte og indirekte metode32. I den direkte metode konjugeres antistoffer til fluorescerende farvestoffer eller kvanteprikker33 for at mærke vævet, mens der i den indirekte metode anvendes et ukonjugeret primært antistof til at mærke vævet efterfulgt af et fluorophore-konjugeret sekundært…
The authors have nothing to disclose.
Imaging og analyse vejledning blev leveret af Research Resources Center – Research Histology og Tissue Imaging Core ved University of Illinois i Chicago etableret med støtte fra kontoret for vicekansler for forskning. Arbejdet blev støttet af NIH/NCI RO1CA191317 til CLP, af NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) til Dr. A. Paller, og med støtte fra Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center til Immunotherapy Assessment Core på Northwestern University.
Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone – 17A2; primary conjugated antibody |
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone – L26; primary conjugated antibody |
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone – UCHT1; primary conjugated antibody |
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody |
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone – C8/144B; primary conjugated antibody |
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone – C068C2; primary conjugated antibody |
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone – GK1.5; primary conjugated antibody |
C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
Human Serum 1X | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody |
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone – M1/70; primary conjugated antibody |
Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
Superblock 1X | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |