Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

doi: 10.3791/60806 Published: March 30, 2020

Summary

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Abstract

Multispectrale fluorescentiebeeldvorming op formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) weefsels maakt het mogelijk om meerdere markers in één weefselmonster te detecteren die informatie kunnen geven over antigeencoexpressie en ruimtelijke verdeling van de markers. Een gebrek aan geschikte antilichamen voor formaline-vaste weefsels kan echter de aard van de gedetecteerde merkers beperken. Bovendien is de kleurmethode tijdrovend. Hier beschrijven we een snelle methode om multispectrale fluorescentiebeeldvorming uit te voeren op bevroren weefsels. De methode omvat de gebruikte fluorophorecombinaties, gedetailleerde stappen voor het kleuren van muizen- en menselijke bevroren weefsels en de scan-, acquisitie- en analyseprocedures. Voor kleuringsanalyse wordt gebruik gemaakt van een commercieel verkrijgbaar semi-geautomatiseerd multispectral eibeeldbeeldvormingssysteem. Door deze methode werden tot zes verschillende markers gekleurd en gedetecteerd in een enkele bevroren weefsel sectie. De machine learning analyse software kan fenotype cellen die kunnen worden gebruikt voor kwantitatieve analyse. De hier beschreven methode voor bevroren weefsels is nuttig voor de detectie van markers die niet kunnen worden gedetecteerd in FFPE-weefsels of waarvoor antilichamen niet beschikbaar zijn voor FFPE-weefsels.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Recente ontwikkelingen in microscopische beeldvormingstechnieken hebben onze kennis en begrip van biologische processen en ziektetoestanden aanzienlijk verbeterd. In situ detectie van eiwitten in weefsels via chromogene immunohistochemie (IHC) wordt routinematig uitgevoerd in pathologie. Echter, detectie van meerdere markers met behulp van chromogene IHC kleuring is uitdagend1 en nieuwere methoden om multiplex immunofluorescentie (mIF) kleuring benaderingen te gebruiken, waarbij meerdere biologische markers worden gelabeld op een enkel weefsel monster, worden ontwikkeld. De detectie van meerdere biologische markers is nuttig, omdat informatie met betrekking tot weefselarchitectuur, ruimtelijke verdeling van cellen en antigeenco-expressie allemaal worden vastgelegd in één weefselmonster2. Het gebruik van multispectrale fluorescentiebeeldvormingstechnologie heeft detectie van meerdere biologische markers mogelijk gemaakt. In deze technologie kan met behulp van specifieke optiek de fluorescentiespectra van elke afzonderlijke fluorophore worden gescheiden of "ongemengd", waardoor meerdere markers kunnen worden gedetecteerd zonder spectrale kruisspraak3. Multispectrale fluorescentiebeeldvorming wordt een kritische benadering in de celbiologie, preklinische medicijnontwikkeling, klinische pathologie en tumorimmuunprofilering4,5,6. Belangrijk is dat de ruimtelijke verdeling van immuuncellen (met name CD8 T-cellen) kan dienen als een prognostische factor voor patiënten met bestaande tumoren7.

Verschillende benaderingen van multiplex fluorescentie kleuring zijn ontwikkeld en kan gelijktijdig of sequentieel worden uitgevoerd. In de simultaan kleuringmethode worden alle antilichamen als cocktail in één stap bij elkaar opgeteld om het weefsel te labelen. UltraPlex-technologie maakt gebruik van een cocktail van hapten-geconjugeerde primaire antilichamen, gevolgd door een cocktail van fluorophore-geconjugeerde anti-hapten secundaire antilichamen. InSituPlex technologie8 maakt gebruik van een cocktail van unieke DNA-geconjugeerde primaire antilichamen die tegelijkertijd worden toegevoegd aan het weefsel, gevolgd door een versterking stap en ten slotte fluorophore-geconjugeerde sondes die complementair zijn aan elke unieke DNA-sequentie op het primaire antilichaam. Beide technologieën maken de detectie van vier markers plus 4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) voor nucleaire kleuring mogelijk. Twee andere benaderingen voor gelijktijdige multiplex kleuring zijn gebaseerd op secundaire ionenmassaspectrometrie9. Het Hyperion Imaging System maakt gebruik van beeldmassacytometrie10 om tot 37 markers te detecteren. Deze technologie maakt gebruik van een cocktail van met metaal geconjugeerde antilichamen om de weefsels te bevlekken, en specifieke gebieden van de weefsels worden door een laser ontdaan en overgebracht naar een massacytometer waar de metaalionen worden gedetecteerd. Een andere soortgelijke technologie is de IONPath, die multiplexed ionbeam imaging technologiegebruikt 11. Deze technologie maakt gebruik van een gemodificeerde massaspectrometrie instrument en een zuurstof ionen bron in plaats van laser om de metaal-geconjugeerde antilichamen ablate. Hoewel al deze gelijktijdige multiplex vlekken benaderingen de detectie van meerdere markers mogelijk te maken, de kosten die betrokken zijn voor het conjugeren van DNA, haptens, of metalen aan antilichamen, het verlies van weefsel als gevolg van ablatie, en de uitgebreide beeldverwerking voor het niet mengen van de mengmenging kan niet worden onderschat. Bovendien zijn kits en kleuringprotocollen momenteel alleen beschikbaar voor FFPE-weefsels en brengt het ontwikkelen van aangepaste panelen extra tijd en uitgaven met zich mee.

De sequentiële multiplex kleuring methode, in tegenstelling, omvat het etiketteren van het weefsel met een antilichaam aan een marker, strippen om het antilichaam te verwijderen, gevolgd door opeenvolgende herhalingen van dit proces om meerdere markers label12. De tyramide signaalversterking (TSA) is de meest gebruikte sequentiële multiplexing methode. Twee andere multiplexing technologieën maken gebruik van een combinatie van gelijktijdige en sequentiële kleuring methoden. De CODEX platform13 maakt gebruik van een cocktail van antilichamen geconjugeerd om unieke DNA oligonucleotide sequenties die uiteindelijk worden gelabeld met een fluorophore met behulp van een geïndexeerde polymerisatie stap gevolgd door beeldvorming, strippen, en het herhalen van het proces om te detecteren tot 50 markers. De MultiOmyx multiplex kleuring aanpak14 is een iteratie van vlekken met een cocktail van drie tot vier gefluorofe-geconjugeerde antilichamen, beeldvorming, het doven van de fluorophoren, en het herhalen van deze cyclus te detecteren tot 60 markers op een enkele sectie. Vergelijkbaar met de gelijktijdige multiplex kleuring methode, terwijl een breed scala van markers kan worden gedetecteerd, de tijd die betrokken zijn bij kleuring, beeldverwerving, verwerking, en analyse is uitgebreid. De strippen / blussen stap omvat verwarming en / of bleken van het weefsel monster en dus, de sequentiële multiplex kleuring aanpak wordt vaak uitgevoerd op FFPE weefsels die weefsel integriteit te handhaven bij het verwarmen of bleken.

Formaline fixatie en daaropvolgende paraffine inbedding wordt gemakkelijk uitgevoerd in een klinische omgeving, weefselblokken zijn gemakkelijk op te slaan en verschillende multiplex kleuringprotocollen zijn beschikbaar. Echter, de verwerking, inbedding, en deparaffinisatie van FFPE weefsels, evenals antigeen ophalen15, een proces waarbij antilichamen beter toegang epitopes, is tijdrovend. Bovendien draagt de verwerking van FFPE-weefsels bij tot autofluorescentie16 en maskers op epitopen, wat resulteert in de variabiliteit en het gebrek aan antilichaamkloon die beschikbaar is om antigenen in FFPE-weefsels op te sporen17,18,19. Een voorbeeld is de menselijke leukocyteantigeen (HLA) klasse I alleles20. In tegenstelling, snap bevriezing van weefsels omvat geen uitgebreide verwerking stappen voorafgaand aan of na de vaststelling, het omzeilen van de noodzaak voor antigeen terugwinning21,22, en waardoor het gunstig is voor het opsporen van een breder scala van doelen. Daarom kan het gebruik van bevroren weefsels voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming waardevol zijn om doelen voor preklinische en klinische studies te detecteren.

Gezien de bovengenoemde beperkingen bij het gebruik van FFPE weefsels, vroegen we of multispectrale fluorescentie beeldvorming kan worden uitgevoerd op bevroren weefsels. Om deze vraag aan te pakken, hebben we een gelijktijdige multiplex kleurmethode getest met behulp van een paneel van gefluorofe-geconjugeerde antilichamen om meerdere antigenen te detecteren en analyseerden we de kleuring met behulp van een semi-geautomatiseerd multispectral imaging systeem. We waren in staat om tegelijkertijd vlek tot zes markers in een enkel weefsel sectie binnen 90 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Muismilt en HLF16 muistumorweefsels23 werden verkregen uit ons laboratorium. Menselijk tonsillenweefsel werd gekocht bij een commerciële leverancier. Details zijn opgenomen in de tabel van materialen.

1. Weefselinbedding

  1. Sluit vers weefsel in octop (optimale snijtemperatuur) oplossing en snap bevriezen met behulp van droogijs of vloeibare stikstof.
  2. Bewaar weefsels op -80 °C.

2. Cryosectioning

  1. Snijd 8 μm secties in een cryostat met temperaturen ingesteld op -25 °C.
    LET OP: De gewenste sectiedikte kan worden aangepast om scherpere beelden te genereren.
  2. Plaats secties op geladen glazen platen.
  3. Droog de secties 1 uur lang af bij kamertemperatuur (RT) voordat de histologie koud aceton gedurende 10 minuten wordt vastgesteld.
    LET OP: Aceton veroorzaakt stolling van in water oplosbare eiwitten en extracten lipiden, maar heeft geen invloed op koolhydraathoudende componenten. In tegenstelling, formaline behoudt de meeste lipiden en heeft weinig invloed op koolhydraten24. De keuze van fixatief is belangrijk, afhankelijk van de keuze van de marker wordt gedetecteerd.
  4. Bewaar de dia's op -20 °C.

3. Selectie van antilichamen en fluorophoren

LET OP: Vóór weefselkleuring moeten antilichaamklonen die hun antigenen van belang binnen opeenvolgende secties van acetonvast weefsel robuust en specifiek bevlekken, worden gevalideerd. Sommige antilichamen kunnen een andere fixatieve vereisen, en hun verenigbaarheid met andere antilichamen in het paneel zal ook empirisch moeten worden bepaald. Het doel is ook om fluorophoren te identificeren met minimale overlap die kan worden gedetecteerd met de epifluorescentiefilters voor DAPI, FITC, Cy3, Texas Red en Cy5.

  1. Bevestig vlekken door conventionele IHC- of immunofluorescentiedetectie (IF) in weefselsecties met bekend expressiedoelantigeen.
  2. Met behulp van de excitatie- en emissiefiltersets die beschikbaar zijn op het semigeautomatiseerde beeldvormingssysteem en na het testen van verschillende combinaties van gefluorofe-geconjugeerde primaire antilichamen, bereid fluorophoren voor om te worden gebruikt die minimale spectrale overlap hebben (bijvoorbeeld tabel 1).

4. Kleuring

LET OP: Het weefsel rehydratatie en dia wasbeurten werden uitgevoerd in een Coplin pot. De blokkerende en antilichaam incubatiestappen werden uitgevoerd in een bevochtigde diadoos.

  1. Laat de glijbanen 5-10 min opwarmen tot RT.
  2. Rehydrateren in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 min.
  3. Voer een blokkerende stap uit voordat weefsels met antilichamen worden bevlekt. Gebruik voor muissecties gespecialiseerde blokkeringsoplossing (zie Materiaaltafel)gedurende 10 min bij RT. Gebruik voor menselijke secties 10% normaal gepoold menselijk serum (NHS) verdund in PBS gedurende 15 min bij RT.
    LET OP: Verschillende blokkeringsbuffers kunnen zo nodig worden getest om de specifieke eigenschappen van de secties te behouden, afhankelijk van de te gebruiken follow-upprocedures.
  4. Was de dia's gedurende 5 min in PBS na het blokkeren.
  5. Voor multiplex kleuring, bereiden een cocktail van antilichamen met compatibele fluorofofen bij vooraf bepaalde optimale verdunningen.
  6. Voeg de cocktail van fluorophore-geconjugeerde antilichamen toe aan de glijbanen. Voor kleuring met één markering voegt u alleen het primaire geconjugeerde antilichaam toe aan de dia.
  7. Neem een controle onbevlekte dia die dezelfde kleuring procedure ondergaat zonder de toevoeging van een primaire-geconjugeerde antilichaam.
  8. Incubeer de dia's voor 1 uur bij RT in het donker en was vervolgens de dia's 2x met PBS voor 5 min per stuk. Vanaf nu wordt de resulterende dia aangeduid als multiplex-gekleurd.
  9. Om tegenvlekken tegen te gaan, voegt u DAPI toe aan de multiplex-gekleurde dia, incubeert gedurende 7 min in het donker bij RT en was de dia's 2x met PBS voor 5 min per stuk. Niet tegenvlek single-gekleurde en onbevlekte dia's.
  10. Om uit te glijden, voeg een druppel van de montage medium, en voorzichtig plaats het glas coverslip over het weefsel.

5. Voorbereiding van een spectrale bibliotheek

  1. Beeldacquisitie
    1. Stel het lampvermogen in op 100%. Meestal is het vermogen ingesteld op 10%, omdat fluorescentiedetectie op FFPE-weefsels een signaalversterkingsstap bevat.
    2. Begin met het openen van de microscoop werkende software (zie Tabel van materialen).
    3. Selecteer Protocol bewerken en vervolgens Nieuw protocol.
    4. Geef een "Protocolnaam" op en selecteer Fluorescentie onder de imagingmodusen geef een "studienaam" op.
    5. Plaats de enkelbevlekte dia's op het podium en bestudeer elke markering in het bijbehorende fluorescentiekanaal om vlekken te garanderen. Kies een gebied op het weefsel dat het sterkste signaal voor de marker uitdrukt.
    6. Pas de belichtingstijden aan met de opties Autofocus en Autoexpose.
    7. Verwerf momentopnamen voor de dia's met één gekleurd e-bevlekte en niet-bevlekte dia's en sla het protocol op.
      LET OP: De volgende stappen worden uitgevoerd in machine learning software (zie Tabel van materialen),met behulp van de enkele gekleurde en niet-bevlekte dia's om specifieke vlekken te verifiëren en om antilichaam cross talk te bepalen.
    8. Laad onder het tabblad Bibliotheken bouwen in de software elke diaafbeelding met één gekleurde afbeelding, kies de juiste Fluor en klik op Uitpakken. De software haalt automatisch het in de Fluor gekozen fluorescentiesignaal eruit.
    9. Als u de uitgepakte kleur wilt opslaan, klikt u op Opslaan in opslag. Er kan een 'Nieuwe groep' worden gemaakt of de geëxtraheerde kleur kan worden opgeslagen in een bestaande groep.
  2. De spectrale bibliotheek verifiëren
    1. Controleer het emissiespectrale curvevenster, rechts van de geëxtraheerde afbeelding, voor elke filterset.
      LET OP: Het geëxtraheerde signaal is correct als de spectrale curve alleen wordt waargenomen in de filtersets waar de fluoropforen wordt gedetecteerd. Als een spectrale curve wordt waargenomen in de verkeerde filterset, kan dit betekenen dat ofwel het primaire signaal dat in de filterset wordt verwacht niet sterk genoeg is, of dat de software een ander signaal detecteert dat te hoog is, mogelijk als gevolg van spectrale overlap. Probeer in dit geval eerst met het gereedschap Verwerkingsregio's tekenen gebieden te tekenen rond gebieden die de fluorescerende markering en autofluorescentie in de afbeelding uitdrukken. Dit traint de software om het ware signaal te detecteren en storende signalen te verwijderen. Als dit niet werkt, herhaal titratieproces voor de single-gekleurde dia om verschillende antilichaamtitraties te testen.

6. Multispectrale beeldvorming

LET OP: Zodra de spectrale bibliotheek is gemaakt en geverifieerd, voert u de volgende stappen uit voor de met multiplex bevlekte dia.

  1. Hele diascan
    1. Pas de scherpstellings- en belichtingstijden aan op de multiplex-gekleurde dia zoals vermeld in punt 5.1.
    2. Maak onder Dia's scanneneen nieuwe taak en kies het hierboven opgeslagen protocol.
    3. Voer een hele diascan uit op de met multiplex bevlekte dia.
    4. Open de hele diascansoftware met behulp van de hele diascanafbeelding. Dit beeld is niet spectrally ongemengd geweest.
    5. Selecteer interessegebieden (ROI) in de hele diascanafbeelding met het gereedschap Stempel of ROI. Deze ROI's worden gescand met behulp van de in punt 6.1.1 ingestelde blootstellingstijden die moeten worden gebruikt voor spectrale ontmening en analyse.
    6. Klik op Procesdia om ROI's te verwerven bij 20x vergroting
  2. Spectrale unmixing
    1. Zodra de ROI's zijn verworven, in de machine learning-software, onder het tabblad Handmatige analyse, laad de multiplex gekleurde beelden door te klikken op Openen onder Bestand.
    2. Klik in de vervolgkeuzelijst Spectrale bibliotheekbron op Fluor selecteren.
    3. Er gaat een nieuw venster open. Kies hier de spectrale bibliotheek of groep die hierboven is gemaakt.
    4. Laad de niet-bevlekte diaafbeelding. Klik AF op het AF-inktmarkeringspictogram boven de geselecteerde spectrale bibliotheek en teken een lijn of gebied op de niet-bevlekte dia om autofluorescentie in het weefsel te identificeren.
    5. Wijs onder het tabblad Markeringen en kleuren bewerken namen toe voor elke markering. Pseudokleuren kunnen bij deze stap worden toegewezen.
      LET OP: De kleur voor de afbeelding Autofluorescentie standaard wordt ingesteld op DarkSlateGray. Verander dit in Zwart.
    6. Klik op Alles voorbereiden.
  3. Spectrally ongemengde afbeeldingen verifiëren
    OPMERKING:
    Wanneer de spectrale ontmeningsstap is voltooid, wordt een samengestelde afbeelding gemaakt die bestaat uit alle kleuren.
    1. Klik op het oogpictogram Weergeven. Hier kan elke kleur in de "Component Display" worden uitgeschakeld of ingeschakeld om de kleuring van elke afzonderlijke markering te bekijken.
    2. Inspecteer visueel de kleuring en de morfologie van de cellen om ervoor te zorgen dat er geen overlapping van marker is, tenzij het biologisch relevant is. Een patholoog kan helpen bij het verifiëren van de kleuring ook.
      LET OP: De kleuring op de multiplexed slide moet worden gevalideerd door het weglaten van een fluoropfore op een moment en herziening van de kleuring patroon. Bovendien zal de validatie ook helpen bij het identificeren van sterke fluorophoren die verschijnen in aangrenzende spectra als gevolg van antilichaam kruispraat of bleed-through.
    3. Klik voor pathologieweergaven, die brightfield-afbeeldingen simuleren voor elke fluorescerende markering, op de knop Een componentafbeelding selecteren. Kies hier een markering om een gesimuleerde brightfieldafbeelding weer te geven.

7. Multispectrale beelden analyseren via celsegmentatie en fenotypering

LET OP: Na het verifiëren van het spectrale ongemengde beeld kan celsegmentatie worden uitgevoerd met behulp van de machine learning-software, die stapsgewijze instructies zal geven. Weefselsegmentatie werd hier niet uitgevoerd. Als het paneel een of meer weefselspecifieke marker bevat en vooral als het weefsel rommelig is, moet weefselsegmentatie worden uitgevoerd.

  1. Selecteer "Cytoplasma" en "Membraan" onder de optie 'Segment'.
    LET OP: "Kernen" is standaard gekozen.
  2. Selecteer een markering in het deelvenster. Configureer de markering om kernen, cytoplasma of membraan te detecteren. DAPI kan bijvoorbeeld worden geselecteerd om kernen en CD3 voor membraan te detecteren.
  3. Klik op de ellipsknop ('...') om een optie te selecteren onder "gebruik dit signaal om te zoeken". Bijvoorbeeld 'kernen' voor DAPI. Meerdere markeringen uit het deelvenster kunnen worden geselecteerd voor segmentatie.
    LET OP: Voor cytoplasmaof membraanmarkers selecteert u de optie "Gebruik dit signaal om te helpen bij nucleaire segmentatie".
  4. De software detecteert en creëert automatisch een masker voor de kern, cytoplasma en membraan in het beeld.
  5. Zorg ervoor dat alle cellen zijn 'gemaskeerd' voor segmentatie. Als u wilt aanpassen, schakelt u over naar de pathologieweergave voor de specifieke markering die in punt 7.3 isgekozen. en gebruik de configuratie-opties in de software.
  6. Klikop " Segment All" om cellen te segmenteren.
  7. Ga na celsegmentatie verder met fenotyperingscellen. Kies in deze stap de markeringen die nodig zijn voor fenotypering en selecteer handmatig ten minste vijf cellen die helder zijn gekleurd met de gekozen markering. Dit traint de software om vervolgens automatisch alle cellen te detecteren die zijn gekleurd met de gekozen markering in de afbeelding.
  8. Er wordt een fenotypekaart gemaakt. Analyseren om ervoor te zorgen dat de cel bevlekt met de marker correct fenotyped is.
    LET OP: Celfenotypering kan een iteratief proces zijn. Als de software niet in staat is om de cellen correct te fenotype, betekent dit dat de training ontoereikend of onjuist is. In dit geval moet de gebruiker handmatig meer cellen selecteren en de software omscholen en deze stap herhalen totdat de gebruiker tevreden is met de training.
  9. Maak een groep met de naam 'Anderen' en voeg cellen toe die niet gekleurd zijn voor een van de markeringen.
    LET OP: Deze stap is belangrijk om de software te trainen om alle niet-gekleurde cellen uit te sluiten van fenotypering.

8. Afbeeldingen en analysetabellen exporteren

  1. Klik op de knop Exporteren om het deelvenster Exportinstellingen weer te geven.
  2. Klik in de map Exporteren op Bladeren om een locatie te selecteren om de afbeeldingen te exporteren.
  3. Kies in de opties voor afbeeldingsexport de indeling Afbeeldingsuitvoer.
  4. Selecteer in de lijst 'Afbeeldingen exporteren' de afbeeldingen die moeten worden geëxporteerd. "Composite image" is het uiteindelijke pseudogekleurde ongemengde beeld. "Pathologieweergaven" zijn de individuele gesimuleerde brightfield-beelden en de "Component Images (multi-image TIFF)" is een TIFF-bestand met meerdere afbeeldingen met componentgegevens dat kan worden gebruikt door analysesoftware van derden.
  5. Klikop deknop Exporteren voor iedereen om de afbeeldingen te exporteren.
    LET OP: Tabellen uit analyse kunnen ook worden geselecteerd en geëxporteerd bij deze stap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detectie van enkelbevlekte markeringen op bevroren miltsecties
Aangezien het semi-geautomatiseerde beeldvormingssysteem gebruik maakt van een vloeistofkristaltable filter (LCTF) systeem dat een breder bereik van golflengtedetectie25mogelijk maakt , en omdat hier geen signaalversterkingsstappen zijn uitgevoerd, hebben we eerst de detectie geoptimaliseerd van onze primaire geconjugeerde antilichamen voor elke marker op de microscoop. Een voorbeeld wordt weergegeven in figuur 1, waar elke single-gekleurde marker is pseudo-gekleurd rood. De Alexa Fluor geconjugeerde antilichamen die hier worden gebruikt zijn gevalideerd door de bedrijven voor immunofluorescentie en stromingcytometrie. De Per-CP-Cy5.5 fluorophore wordt echter alleen gevalideerd voor flowcytometrie. We waren in staat om deze kleur te detecteren in onze single-gekleurde dia's, ter ondersteuning van de geschiktheid van flow cytometrie gevalideerde antilichamen voor gebruik in multispectrale beeldvorming en het verstrekken van het voordeel van het gebruik van dergelijke antilichamen om waarnemingen te valideren met behulp van twee verschillende technieken (dat wil zeggen, flow cytometrie en multispectrale beeldvorming). Vervolgens zijn we overgegaan tot het uitvoeren van multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels.

Multicolor fluorescentiedetectie op bevroren muismilt
Om de multiplex kleuringsmethode en spectrale beeldvorming te testen, gebruikten we muizenbevroren miltweefsel, dat een overvloed aan immuuncellen heeft. Figuur 2 toont een spectrale ongemengde afbeelding van verschillende markers in een sectie van bevroren muismilt. De antilichamen, klonen en concentraties die voor kleuring worden gebruikt, worden beschreven in tabel 2. De vastgelegde afbeelding toont een deel van de T-celzone die wordt geïdentificeerd door de aanwezigheid van CD3-, CD4- en CD8-markeringen, omgeven door myeloïdecellen die CD11b uitdrukken die meestal worden waargenomen in de marginale zone. Regio's van zich vermenigvuldigende cellen uitdrukken Ki67 worden voornamelijk waargenomen in kiemcentra. De optie "Pathologieweergaven" voor elke marker toonde zijn individuele kleurpatroon in het weefsel. Verschillende kleurpatronen voor CD11b, Ki67 en de CD3-, CD4- en CD8-markers samen werden waargenomen, wat suggereert dat de multiplex kleuringsmethode en spectrale beeldvorming werkten op het bevroren weefsel.

Multi-color fluorescentie detectie op bevroren menselijke amandel
Na het testen van een kleurpaneel geschikt voor muisweefsel, hebben we vervolgens beoordeeld een apart paneel voor bevroren menselijk tonsillenweefsel. Figuur 3 toont een spectral ongemengd beeld van de verschillende gebruikte markers. De antilichamen, klonen en concentraties die voor kleuring worden gebruikt, worden beschreven in tabel 2. De vastgelegde afbeelding toont een folliculaire kiemcentrum26 uitdrukken B-cellen geïdentificeerd door de CD20 marker. Prolifererende cellen in het folliculaire kiemcentrum werden geïdentificeerd door Ki67. Sommige van deze zich vermenigvuldigende cellen costained met CD20 en kan centroblasten27, naïeve B-cellen die actieve somatische hypermutatie ondergaan. De follicular kiemcentra werden omringd door het interfollicular T celgebied dat door de uitdrukking van CD3, CD4, en CD8 wordt geïdentificeerd. Ook hier werden verschillende kleurpatronen waargenomen, wat bevestigt dat de methodologie werkte aan een bevroren weefsel.

Toepassing van multispectrale fluorescentiebeeldvorming op bevroren muistumorweefsel
Multispectrale beeldvorming is een nuttig hulpmiddel voor het monitoren van immuuncelinfiltratie bij tumoren als prognose voor immunotherapieën. Hiertoe wilden we een bevroren weefselmonster van de muizentumor bevlekken en immuuncellen infiltreren detecteren. De HLF16 cellijn wordt gebruikt als humaan papillomavirus (HPV)+ tumormodel van baarmoederhalskanker bij HLA-A*0201 transgene muizen28. De transgene cellijn werd ontwikkeld door het transfecting hart longfibroblasten van HLA-A *0201 met HPV16 E6 en E7 oncogenes en H-Ras V1228. T-cellen en tumor geassocieerde macrofagen zijn de meest voorkomende immuun infiltreert aanwezig in tumoren29. Figuur 4 toont een spectrale ongemengde afbeelding op een bevroren HLF16-tumorsectie, samen met de pathologieweergaven; de individuele kleurpatronen worden weergegeven in aanvullend figuur 1. De antilichamen, klonen en concentraties die voor kleuring worden gebruikt, worden beschreven in tabel 2. Het vastgelegde beeld toont regio's van tumor-infiltrerende T-cellen geïdentificeerd door de CD3 en CD8 markers samen met de aanwezigheid van andere myeloïde cellijnen geïdentificeerd door de CD11b marker. Het vastgelegde gebied toont ook tumor geassocieerde macrofagen (TAMs), mogelijk van de M2 fenotype, gedetecteerd door de CD206 marker30, die nauw verbonden is met verschillende vermenigvuldigende cellen gedetecteerd als Ki67+.

De machine learning software2 wordt geleverd met functies zoals weefsel- en celanalyses. Deze analyses worden vaak uitgevoerd op FFPE weefsels gekleurd met signaalversterking. Omdat onze methodologie geen signaalversterking gebruikt, wilden we testen of de software kan worden gebruikt om vlekken op bevroren weefsels te analyseren. Met behulp van de adaptieve functie van de software, waren we in staat om cellen te segmenteren op basis van een nucleaire en membraan marker en fenotype cellen op basis van de markers gebruikt voor kleuring. Figuur 5 toont de celsegmentatie- en fenotypekaarten en het aantal gekleurde cellen voor elke marker die door de software wordt geanalyseerd, waaruit blijkt dat de software kan worden gebruikt voor het kwantificeren van multispectrale kleuring op bevroren weefsels.

Figure 1
Figuur 1: Het detecteren van primaire geconjugeerde antilichamen met behulp van een vloeibare kristallen tunable filter microscoop. Primair geconjugeerde antilichamen tegen de aangegeven markers werden gekleurd op een bevroren muismilt en gedetecteerd met behulp van het Vectra 3.0 multispectrale beeldvormingssysteem onder 20x doelstellingen. CD3 op Alexa Fluor 488, CD8 op Alexa Fluor 594, CD11b op Per-CP Cy5.5, CD206 op Alexa Fluor 647 en Ki67 op Alexa Fluor 555 werden gebruikt. Elke markering is pseudo-gekleurd rood. Geen tegenvlek werd gebruikt op deze dia's. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Multispectrale beeldvorming op een bevroren muismilt. (A) Hele diascan van de multiplexed gekleurde dia genomen onder 4x doelstellingen. Een 2 x 2 stempel in verschillende gebieden van het weefsel werd gekozen voor multispectrale beeldvorming. Schaalbalk = 100 μm. (B) Samengestelde afbeelding genomen onder een 20x doelstelling na spectrale unmixing. De pseudo-gekleurde markeringen worden aangegeven en een vergroot beeld in het rode vak wordt naast de afbeelding weergegeven. Schaalbalk = 20 μm. (C) Pathologie weergaven voor elke individuele marker. Naast de afbeelding wordt een vergroot beeld voor elke markering in het rode vak weergegeven. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Multispectrale beeldvorming op een bevroren menselijke amandel. (A) Hele diascan van de multiplexed gekleurde dia genomen onder een 4x doelstelling. Voor multispectrale beeldvorming werd gekozen voor een 1 x 1 stempel (669 μm x 500 μm) in verschillende delen van het weefsel. Schaalbalk = 100 μm. (B) Samengestelde afbeelding na spectrale unmixing genomen onder een doelstelling van 20x. De pseudo-gekleurde markeringen worden aangegeven en een vergroot beeld in het rode vak wordt naast de afbeelding weergegeven. Schaalbalk = 20 μm. (C) Pathologie weergaven voor elke individuele marker. Naast de afbeelding wordt een vergroot beeld voor elke markering in het rode vak weergegeven. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Multispectrale beeldvorming over een bevroren muizentumor. Multispectrale beeldvorming werd uitgevoerd op een 1 x 1 regio van een bevroren muis HLF16 tumor genomen onder een 20x doelstelling. De samengestelde afbeelding (hierboven). De pseudo-gekleurde markeringen worden aangegeven en de pathologieweergaven (onder) voor elke individuele markering worden afgebeeld. Naast de oorspronkelijke afbeelding wordt een vergroot beeld voor elke markering in het rode vak weergegeven. Schaalbalk = 20 μm Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Analyse van een bevroren muistumorsectie. (A) Celsegmentatiekaart. Adaptieve celsegmentatie met inForm is uitgevoerd. De software werd getraind om kernen (groen) en membraan (rood) te identificeren. (B) Fenotype kaarten voor elke gekleurde marker. De software werd getraind om fenotypes te identificeren op basis van de kleuring. Gekleurde stip vertegenwoordigt de aangegeven markering. "Andere" (zwart) verwijst naar cellen die niet werden gekleurd voor de aangegeven marker. (C) Staafplot (gemiddelde ± STDEV) die het aantal gekleurde cellen voor elke marker in twee multispectrale beelden weergeeft. Het getal geeft cellen aan die in elke afbeelding fenotyped zijn, maar geeft niet aan of de markeringen worden gecotoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Fluorophore Excitatiemaximum (nm) Emissiemaximum (nm) Verwachte detectie in filterset (naam)
Alexa Fluor 488 488 519 Fitc
Alexa Fluor 555 555 580 Cy3 en Texas Rood
Alexa Fluor 594 590 617 Texas Rood
Alexa Fluor 647 650 668 Texas Rood en Cy5
DAPI 350 470 DAPI
PerCP-Cy 5.5 482 690 Cy3, Texas Red en Cy5

Tabel 1: Lijst van fluorofen met hun maximale excitatie- en emissiegolflengten en verwachte detectie in geschikte filtersets.

Bevroren muis milt
Antilichaam/kleurstof Kloon Concentratie (μg/mL)
Alexa Fluor 594 anti-muis CD8a 53-6.7 10
Alexa Fluor 488 anti-muis CD3 17A2 20
Alexa Fluor 647 anti-muis CD4 GK1.5 10
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b M1/70 2
Alexa Fluor 555 Muis anti-Ki-67 B56 10
DAPI 0.1
Bevroren muistumor
Antilichaam/kleurstof Kloon Concentratie (μg/mL)
Alexa Fluor 594 anti-muis CD8a 53-6.7 20
Alexa Fluor 488 anti-muis CD3 17A2 20
Alexa Fluor 647 anti-muis CD206 (MMR) C068C2 5
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-CD11b M1/70 1
Alexa Fluor 555 Muis anti-Ki-67 B56 0.25
DAPI 0.1
Bevroren menselijke amandel
Antilichaam/kleurstof Kloon Concentratie (μg/mL)
Alexa Fluor 594 anti-menselijke CD3 UCHT1 (UCHT1) 10
PerCP/Cyanine5.5 anti-menselijke CD4 RPA-T4 4
Alexa Fluor 647 anti-menselijke CD8a C8/144B 10
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-menselijke CD20 L26 10
Alexa Fluor 555 Muis anti-Ki-67 B56 1
DAPI 0.1

Tabel 2: Lijst van gebruikte antilichamen, klonen en concentraties.

Aanvullende figuur 1: Individuele kleurpatronen van de bevroren HLF16-tumor na spectrale unmixing. Schaalbalk = 20 μm Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bevroren weefsels zijn op grote schaal gebruikt voor mIF-beeldvorming om traditioneel drie tot vier markers31 op een weefsel te detecteren met behulp van de directe en indirecte methode32. In de directe methode worden antilichamen geconjugeerd tot fluorescerende kleurstoffen of quantumdots33 om het weefsel te labelen, terwijl in de indirecte methode een niet-geconjugeerd primair antilichaam wordt gebruikt om het weefsel te labelen, gevolgd door een door fluorophore geconjugeerd secundair antilichaam dat specifiek het primaire antilichaam herkent. Sommige van de recente gelijktijdige multiplex kleuring benaderingen eerder besproken kan ook worden gebruikt om bevroren weefsels vlek en detecteren meer dan vier markers. Maar de kosten voor de reagentia en de tijd die nodig is voor kleuring worden intensief, afhankelijk van het aantal markers wordt gedetecteerd. Een andere multiplex techniek voor bevroren weefsels is de multi-epitoop-ligand-cartografie (MELC)34. De techniek omvat het bevlekken van het monster met gefluorofe-geconjugeerde antilichamen, beeldvorming, en fotobleekte van de fluoropforen. Een belangrijk voorbehoud van deze techniek is dat slechts een veld of gebied van het weefsel kan worden multiplexed. Om andere velden of regio's te multiplexen moet de techniek handmatig worden uitgevoerd, wat tijdrovend is, of automatisering vereist, wat kostbaar is. Een groep35 was in staat om zes kleuren op bevroren weefsels te detecteren met behulp van een combinatie van directe, indirecte en TSA-kleuring. Echter, het weefsel vlekken duurde 2 dagen. Ter vergelijking, onze methodologie maakt gebruik van een gelijktijdige multiplex kleuring methode waarbij de toepassing van een cocktail van vijf direct geconjugeerde antilichamen plus DAPI te vlekken bevroren weefsels binnen 90 min. Bovendien konden we met behulp van een semi-geautomatiseerd multispectral eibeeldbeeldvormingssysteem zes markers in bevroren milt, amandelen en tumorweefsels spectral scheiden en detecteren met behulp van deze vereenvoudigde multiplex kleuringstechniek. De Cy3, Texas Red, en de Cy5 filter sets beschikbaar op de microscoop bieden mogelijkheden voor het opsporen van extra fluorophores, waardoor potentieel het aantal markers die gelijktijdig kunnen worden gedetecteerd in bevroren weefsels.

Multiplex vlekken met behulp van de TSA aanpak op FFPE weefsels vereist een antigeen ophalen stap gevolgd door sequentiële etikettering, wassen, en strippen stappen. Het uitvoeren van de procedure varieert van 1-2 dagen, afhankelijk van de incubatietijd die wordt gebruikt voor de antilichamen6. Onlangs, met behulp van een microfluïdische weefselprocessor, een vier-plex kleuring met behulp van de TSA aanpak werd uitgevoerd op FFPE weefsels onder 90 min. Andere multiplex technieken voor FFPE weefsels kunnen worden uitgevoerd onder 4-5 uur met behulp van een geautomatiseerde vlek. De juiste antigeenterugwinningsstappen moeten echter worden geoptimaliseerd om de beschikbaarheid van epitoop voor de antilichamen36te garanderen, die op hun beurt afhankelijk zijn van de zorgvuldige afweging van de antilichaamklonen en de volgorde van de markers die worden gedetecteerd. Sommige antilichaamklonen van CD3 kunnen bijvoorbeeld niet worden gebruikt, omdat vervolgens CD4- en CD8-antilichamen niet worden gedetecteerd37. Evenzo is er variabiliteit van de antigeendetectie onder de beschikbare antilichaamklonen17,18. Daarom, multiplex kleuring van FFPE weefsels vereist optimalisatie van antilichaam klonen, hun concentraties, en de volgorde waarin ze zijn gekleurd, die allemaal tijdrovend is. In tegenstelling, het ontbreken van uitgebreide weefselverwerking van bevroren weefsels maakt het gebruik van verschillende antilichaam klonen met een hoge specificiteit. Bovendien kunnen antilichaamklonen die beschikbaar zijn voor bevroren weefsels ook worden gebruikt in flowcytometrie en ELISA, waardoor gelijktijdige validatie over verschillende tests mogelijk is. Weefsel architectuur is ook een punt van zorg in bevroren weefsels38. De multiplex kleuring hier op bevroren weefsels is aanzienlijk sneller dan de TSA aanpak. De fluorophorecombinaties vereisen een zorgvuldige selectie van markers om ervoor te zorgen dat antilichamen elkaar niet sterisch hinderen, vooral wanneer verschillende antigenen uitgedrukt in dezelfde cellulaire locatie worden gedetecteerd. We kozen voor markers die verschillende cellen bevlekken op fluorophoren die spectraal gescheiden zijn, waardoor een betere detectie mogelijk is. De concentraties antilichamen vereisen ook optimalisatie, maar omdat het kleurprotocol snel is, is de totale tijd die nodig is voor optimalisatie niet tijdrovend. Een voorbehoud aan onze methode kan het onvermogen zijn om lage uitdrukkende tellers in weefsels te ontdekken. Sommige van de multiplex vlekken benaderingen op FFPE weefsels omvatten een signaal versterking stap die nuttig is om lage uitdrukken markers detecteren. Het gebruik van secundaire en tertiaire antilichamen kan echter worden gebruikt om het signaal te stimuleren. In dergelijke gevallen moet kruisreactiviteit op antilichamen in het paneel worden vermeden om onjuiste interpretatie van de resultaten te voorkomen.

Naast muismilt en menselijke tonsillenweefsels, die rijk zijn aan immuuncellen, hebben we tumorweefsel gebruikt als voorbeeld voor de voorgestelde multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefsels. Multispectrale fluorescentiebeeldvorming in tumoren heeft waardevolle informatie opgeleverd, zoals het karakteriseren van de tumormicroomgeving (TME)39, het voorspellen van het succes van adoptieve T-celoverdrachten in kwaadaardig melanoom40, en het karakteriseren van eiwitten in tumorsignaaltransductietrajecten41. Met behulp van markers die specifiek zijn voor immuuncellen die vaak in tumoren worden aangetroffen, konden we infiltrerende CD8 T-cellen en TAMs detecteren in het HLF16-tumorweefsel dat in deze studie wordt gebruikt. We gebruikten de machine learning software om cellen succesvol te segmenteren en te fenotype. Multiplex vlekken voor FFPE weefsels maakt gebruik van een signaal versterking stap om signaal-ruis (SNR) ratio die helpt beeldverwerking en kwantificering42,43. De machine learning software is gebruikt voor analyses op FFPE weefsels gekleurd met signaalversterking2. De hier aanwezige methodologie maakt geen gebruik van signaalversterking, maar we konden met succes cellen segmenteren en fenotype met behulp van de software. Voor verdere analyse (bijvoorbeeld fenotype coexpressie en ruimtelijke relaties) en nauwkeurige interpretatie van de kwantitatie vereist de softwaretraining validatie met behulp van een trainingsset, testset en validatieset. In een iteratief proces wordt één set afbeeldingen (d.w.z. de trainingsset) gebruikt om de machine learning-software te trainen om de fenotypes te identificeren totdat de voorspellingen van het model voor een afzonderlijke set afbeeldingen (d.w.z. de testset) nauwkeurig zijn. Nadat de training is voltooid, wordt een laatste braakleggingsbatch met afbeeldingen (d.w.z. de validatieset) geanalyseerd om te zien of er sprake is van overmontage.

Tot slot is de hier gepresenteerde methode een snelle manier om multispectrale fluorescentiebeeldvorming uit te voeren met bevroren weefsels. De methode is nuttig om markers te detecteren waarvan antilichamen niet beschikbaar zijn of niet kunnen worden gedetecteerd in FFPE-weefsels. In combinatie met de machine learning-software kan de tijd die nodig is om kwantitatieve analyses uit te voeren, snelle preklinische en klinische diagnoses aanzienlijk vergemakkelijken en kan worden toegepast op het gebied van ruimtelijke transcripties met hoge resolutie die gebruik maken van bevroren weefsels44.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

Imaging en analyse begeleiding werd verstrekt door het Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core aan de Universiteit van Illinois in Chicago opgericht met de steun van het kantoor van de vice-kanselier voor onderzoek. Het werk werd ondersteund door NIH/NCI RO1CA191317 aan CLP, door NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) aan Dr. A. Paller, en door ondersteuning van het Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center aan de Immunotherapy Assessment Core aan de Northwestern University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone - 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone - L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone - UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone - C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone - C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone - GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1x Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone - M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1x ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33, (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70, (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50, (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (1), 13380 (2017).
  6. Wickenhauser, C., et al. Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. Pico de Coaña, Y. Springer. New York. 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, (1), 47 (2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24, (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11, (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20, (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19, (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174, (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51, (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54, (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26, (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21, (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62, (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82, (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125, (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22, (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12, (6), 479 (1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19, (1), 011017 (2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122, (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8, (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32, (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42, (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133, (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2, (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24, (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. 03 (2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65, (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202, (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46, (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244, (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2, (14), 93652 (2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19, (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7, (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120, (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. 563338 (2019).
Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).More

Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter