Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Быстрый метод многоспектральной флуоресценции Визуализация замороженных секций тканей

doi: 10.3791/60806 Published: March 30, 2020

Summary

Мы описываем быстрый метод окрашивания для выполнения многоспектральной визуализации замороженных тканей.

Abstract

Многоспектральная флуоресценция на ткани с фиксированным парафином (FFPE) позволяет обнаружить несколько маркеров в одном образце ткани, которые могут предоставить информацию о антигенной коэкспрессии и пространственном распределении маркеров. Однако отсутствие подходящих антител для формалино-фиксированных тканей может ограничить характер маркеров, которые могут быть обнаружены. Кроме того, метод окрашивания занимает много времени. Здесь мы описываем быстрый метод выполнения многоспектральной флуоресценции изображения замороженных тканей. Метод включает в себя используемые комбинации фторофора, подробные шаги для окрашивания мыши и замороженных тканей человека, а также процедуры сканирования, приобретения и анализа. Для анализа окрашивания используется коммерчески доступная полуспектральная многоспектральная флуоресценционная система визуализации. С помощью этого метода, до шести различных маркеров были окрашены и обнаружены в одном разделе замороженных тканей. Программное обеспечение для анализа машинного обучения может использовать фенотипные клетки, которые могут быть использованы для количественного анализа. Описанный здесь метод для замороженных тканей полезен для обнаружения маркеров, которые не могут быть обнаружены в тканях FFPE или для которых антитела не доступны для тканей FFPE.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Последние достижения в области микроскопических методов визуализации значительно улучшили наши знания и понимание биологических процессов и состояний болезней. При анализе белков в тканях с помощью хромогенной иммуногистохимии (МГК) обычно проводится при патологии. Тем не менее, обнаружение нескольких маркеров с использованием хромогенных iHC окрашивания является сложнойзадачей 1 и новые методы для использования мультиплекс иммунофлуоресценции (mIF) окрашивания подходов, в котором несколько биологических маркеров помечены на одном образце ткани, разрабатываются. Обнаружение нескольких биологических маркеров полезно, потому что информация, связанная с архитектурой тканей, пространственным распределением клеток и антигеном, все они запечатлены в одной образце ткани2. Использование многоспектральной технологии визуализации флуоресценции сделало возможным обнаружение нескольких биологических маркеров. В этой технологии, используя определенную оптику флуоресценции спектры каждого отдельного флюорофора могут быть разделены или "несмешанные", что позволяет обнаружение нескольких маркеров без каких-либо спектральныхперекрестного3 . Многоспектральная флуоресценция становится критическим подходом в клеточной биологии, доклиническом развитии лекарственных средств, клинической патологии и иммунном профилировании опухоли4,,5,6. Важно отметить, что пространственное распределение иммунных клеток (в частности, CD8 Т-клеток) может служить прогностическим фактором для пациентов с существующими опухолями7.

Разработаны различные подходы к расклеиванию мультиплексной флуоресценции, которые могут выполняться одновременно или последовательно. В методе одновременного окрашивания все антитела добавляются вместе, как коктейль в один шаг, чтобы обозначить ткани. Технология UltraPlex использует коктейль из хаптен-конъюгированных первичных антител, за которым и коктейль из флюорофора-конъюгированных анти-хаптеновых вторичных антител. Технология InSituPlex8 использует коктейль из уникальных ДНК-конъюгированных первичных антител, которые одновременно добавляются в ткани с последующим шагом усиления и, наконец, флюорофор-конъюгированными зондами, которые дополняют каждую уникальную последовательность ДНК на первичном антителе. Обе эти технологии позволяют обнаружить четыре маркера плюс 4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) для ядерного окрашивания. Два других подхода к одновременному окрашиванию мультиплексного окрашиваемого основанного на вторичной ионной масс-спектрометрии9. Система визуализации Hyperion использует цитометрию массы изображения10 для обнаружения до 37 маркеров. Эта технология использует коктейль из металлических конъюгированных антител, чтобы запятнать ткани, а определенные участки тканей абляции лазером и передаются в массовый цитометр, где обнаружены ионы металла. Другой аналогичной технологией является IONPath, который использует мультиплексный ионный луч изображения технологии11. Эта технология использует модифицированный инструмент масс-спектрометрии и источник ионного кислорода вместо лазера, чтобы абляции металлических конъюгированных антител. В то время как все эти одновременные мультиплексные подходы к окрашиванию позволяют обнаруживать несколько маркеров, нельзя недооценивать затраты на спряжение ДНК, гастенили или металлов к антителам, потерю ткани из-за абляции и обширную обработку изображений для несмешивания. Кроме того, комплекты и протоколы окрашивания в настоящее время доступны только для тканей FFPE и разработка пользовательских панелей влечет за собой дополнительное время и расходы.

Последовательный метод окрашивания мультиплексов, напротив, включает в себя маркировку ткани антителом к одному маркеру, зачистку для удаления антител, а затем последовательные повторы этого процесса для обозначения нескольких маркеров12. Усиление сигнала тирамад (TSA) является наиболее часто используемым методом последовательного мультиплексирования. Две другие технологии мультиплексирования используют сочетание одновременных и последовательных методов окрашивания. Платформа CODEX13 использует коктейль антител, спрягаемых с уникальными последовательностями олигонуклеотидов ДНК, которые в конечном итоге помечены флюорофором с помощью индексируемого шага полимеризации, за которым следуют визуализация, зачистка и повторение процесса обнаружения до 50 маркеров. Мультиомикс мультиплексок окрашивания подход14 является итерация окрашивания с коктейлем из трех-четырех флюорофор-конъюгированных антител, изображения, угасание фторфоров, и повторение этого цикла для обнаружения до 60 маркеров на одном разделе. Подобно методу одновременного мультиплексного окрашивания, в то время как широкий спектр маркеров может быть обнаружен, время, связанное с окрашиванием, приобретением изображений, обработкой и анализом, обширено. Зачистка / закалка шаг включает в себя отопление и / или отбеливание образца ткани и, таким образом, последовательный мультиплекс окрашивания подход обычно осуществляется на ткани FFPE, которые поддерживают целостность тканей при нагревании или отбеливание.

Формалин фиксации и последующего встраивания парафина легко выполняется в клинических условиях, ткани блоки легко хранить, и несколько протоколов мультиплекс окрашивания доступны. Тем не менее, обработка, встраивание и депарафинизация тканей FFPE, а также антигена поиска15, процесс, с помощью которого антитела могут лучше получить доступ к эпитопам, занимает много времени. Кроме того, обработка, связанная с тканями FFPE, способствует аутофлуоресценции16 и маски целевых эпитопов, что приводит к изменчивости и отсутствию клона антител, доступных для обнаружения антигенов в тканях FFPE17,18,19. Примером является человеческий лейкоцит антиген (HLA) класса я аллелей20. В отличие от этого, оснастки замораживания тканей не включает в себя обширные шаги обработки до или после фиксации, в обход необходимости поиска антигена21,22, и делает его полезным для обнаружения более широкого круга целей. Поэтому использование замороженных тканей для многоспектральной флуоресценции может быть полезным для выявления целей для доклинических и клинических исследований.

Учитывая вышеупомянутые ограничения при использовании тканей FFPE, мы спросили, можно ли проводить многоспектральную флуоресценцию на замороженных тканях. Для решения этого вопроса мы протестировали метод одноразового мультиплексного окрашивания с помощью панели флюорофор-конъюгированных антител для обнаружения нескольких антигенов и проанализировали окрашивание с помощью полуавтоматической многоспектральной системы визуализации. Мы смогли одновременно пятно до шести маркеров в одной секции ткани в течение 90 минут.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Мышь селезенки и HLF16 мыши опухоли тканей23 были получены из нашей лаборатории. Ткань миндалин человека была приобретена у коммерческого поставщика. Подробности приведены в таблице материалов.

1. Встраивание тканей

  1. Встраивай свежую ткань в раствор OCT (оптимальная температура резки) и замораживай с помощью сухого льда или жидкого азота.
  2. Храните ткани при -80 градусах по Цельсию.

2. Криосекция

  1. Вырезать 8 мкм разделов в криостате с температурой, установленной на -25 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительная толщина секции может быть скорректирована для создания более четких изображений.
  2. Разместите разделы на заряженных стеклянных слайдах.
  3. Воздушно-сухие секции на 1 ч при комнатной температуре (RT) до фиксации в гистологии класса ледяного ацетона в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ацетон вызывает коагуляцию водорастворимых белков и экстракты липидов, но не влияет на углеводосодержащие компоненты. В отличие от этого, формалин сохраняет большинство липидов и имеет небольшое влияние на углеводы24. Выбор фиксатора важен в зависимости от выбора обнаруженного маркера.
  4. Храните слайды при -20 градусов по Цельсию.

3. Выбор антител и флюорофоров

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед окрашиванием тканей, клоны антител, которые будут надежно и специально пятно их антигенов интерес в последовательных разделов из ацетона фиксированной ткани должны быть проверены. Некоторые антитела могут потребовать различных фиксаторов, и их совместимость с другими антителами в панели также должны быть эмпирически определены. Цель состоит также в выявлении фторофоров с минимальным перекрытием, которые могут быть обнаружены с помощью фильтров эпифлюоресценции для DAPI, FITC, Cy3, Texas Red и Cy5.

  1. Подтвердите окрашивание обычным IHC или иммунофлуоресценцией (IF) обнаружение в секциях тканей с известным экспрессией целевого антигена.
  2. Используя наборы фильтров возбуждения и выбросов, доступные в полуавтоматической системе визуализации, и после тестирования различных комбинаций флюорофоров-конъюгированных первичных антител, приготовьте флюорофоры для использования, которые имеют минимальное спектральное перекрытие (например, см. таблицу 1).

4. Окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Регидратация тканей и спускные горки были выполнены в банке Коплина. Шаги по инкубации блокирующих и антител выполнялись в увлажненной слайд-боксе.

  1. Разрешить слайды, чтобы тепло RT в течение 5-10 мин.
  2. Регидратация в фосфатбуферный солен (PBS) в течение 5 мин.
  3. Выполните блокирующий шаг до окрашивания тканей антителами. Для секций мыши используйте специализированное блокирующее решение (см. Таблицу Материалов)в течение 10 минут на RT. Для человеческих секций, использовать 10% нормальной объединенной человеческой сыворотки (NHS) разбавленной в PBS в течение 15 минут на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные блокирующие буферы могут быть протестированы по мере необходимости для сохранения специфических свойств секций в зависимости от процедур последующего наблюдения, которые будут использоваться.
  4. Вымойте слайды в течение 5 минут в PBS после блокировки.
  5. Для мультиплексного окрашивания приготовьте коктейль из антител с совместимыми флюорофорами при заранее определенных оптимальных разбавлениях.
  6. Добавьте на горки коктейль из флюорофор-конъюгированных антител. Для одномаркерного окрашивания добавьте к слайду только первично-конъюгированные антитела.
  7. Включите контроль незапятнанной слайд, который проходит ту же процедуру окрашивания без добавления каких-либо первичного конъюгированного антитела.
  8. Инкубировать слайды в течение 1 ч на RT в темноте, а затем мыть слайды 2x с PBS в течение 5 минут каждый. С этого момента, в результате слайд называется мультиплекс-окрашенных.
  9. Чтобы противозачаточно, добавьте DAPI в мультиплекс окрашенных слайд, инкубировать в течение 7 минут в темноте на RT, и мыть слайды 2x с PBS в течение 5 минут каждый. Не противопойте одноцветные и незапятнанные горки.
  10. Для того чтобы coverslip, добавьте каплю устанавливая среды, и нежно устанавливают стеклянную крышку над тканью.

5. Подготовка спектральной библиотеки

  1. Приобретение изображения
    1. Установите мощность лампы до 100%. Обычно мощность установлена до 10%, потому что обнаружение флуоресценции на тканях FFPE включает в себя шаг усиления сигнала.
    2. Начните с открытия микроскопа операционного программного обеспечения (см. Таблица материалов).
    3. Выберите протокол edit, а затем новый протокол.
    4. Предоставьте "Имя протокола" и выберите флуоресценцию в режиме визуализациии предоставьте "Имя исследования".
    5. Поместите одноцветные слайды на сцене и изучить каждый маркер в соответствующем канале флуоресценции для обеспечения окрашивания. Выберите область на ткани, выражающую сильнейший сигнал для маркера.
    6. Отрегулируйте время экспозиции, используя параметры Автофокуса и Автоэкспонса.
    7. Приобретите снимки для одноцветных и незапятнанных слайдов и сохраните протокол.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются в программном обеспечении машинного обучения (см. Таблица материалов),используя один окрашенные и незапятнанные слайды для проверки конкретных окрашивания, а также для определения антитела перекрестный разговор.
    8. Под вкладкой Build Libraries в программном обеспечении загрузите каждое одноцветное изображение слайда, выберите подходящий Fluor и нажмите Extract. Программное обеспечение будет автоматически извлекать сигнал флуоресценции, выбранный в Fluor.
    9. Чтобы сохранить извлеченный цвет, нажмите на Сохранить в хранилище. Может быть создана «Новая группа» или извлеченный цвет может быть сохранен в существующей группе.
  2. Проверка спектральной библиотеки
    1. Проверьте окно спектральной кривой выбросов, расположенное справа от извлеченного изображения, для каждого набора фильтров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеченный сигнал является правильным, если спектральная кривая наблюдается только в наборах фильтров, где обнаружен флюорофор. Если спектральная кривая наблюдается в неправильном наборе фильтров, это может означать, что либо основной сигнал, ожидаемый в наборе фильтров, недостаточно силен, либо программное обеспечение обнаруживает другой слишком высокий сигнал, возможно, из-за спектрального перекрытия. В этом случае сначала попробуйте использовать инструмент Draw Processing Regions, чтобы нарисовать области вокруг областей, выражающих флуоресцентный маркер и автофлуоресценцию на изображении. Это тренирует программное обеспечение для обнаружения истинного сигнала и удаления любых помех. Если это не работает, повторите процесс окрашивания для одноцветного слайда, чтобы проверить различные титрировки антител.

6. Многоспектральное изображение

ПРИМЕЧАНИЕ: После создания и проверки спектральной библиотеки выполните следующие шаги для запятнанной мультиплексом слайда.

  1. Полное сканирование слайдов
    1. Отрегулируйте фокус и время экспозиции на мультиплекс-окрашенных слайд, как упоминалось в разделе 5.1.
    2. Под scan Slidesсоздайте новую задачу и выберите сохраненный выше протокол.
    3. Выполните полное сканирование слайда на мультиплексе окрашенных слайд.
    4. Используя все программное обеспечение сканирования слайдов, откройте все изображение сканирования слайдов. Это изображение не было спектрально несмешанным.
    5. Выберите области, представляющие интерес (ROI) по всему изображению сканирования слайдов с помощью инструмента Stamp или ROI. Эти ROIs будут отсканированы с использованием времени экспозиции, установленного в 6.1.1 для использования для спектрального несмешивания и анализа.
    6. Нажмите Процесс слайд приобрести рентабельность инвестиций в 20x увеличение
  2. Спектральный несмешивание
    1. После того, как roIs были приобретены, в программном обеспечении машинного обучения, под вкладкой ручного анализа, загрузить мультиплекс окрашенных изображений, нажав Открыть под файлом.
    2. В меню Spectral Library Источник выпадения нажмите Выберите флюоры.
    3. Откроется новое окно. Здесь выберите спектральную библиотеку или группу, созданную выше.
    4. Загрузите неокрашенное изображение слайда. Нажмите значок маркера чернил AF, расположенный над выбранной спектральной библиотекой, и нарисуйте линию или область на неокрашенном слайде, чтобы определить автофлюоресценцию в ткани.
    5. Под вкладкой «Маркеры и цвета отодвиливания» присваивают имена для каждого маркера. Псевдо цвета могут быть назначены на этом этапе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет для изображения Автофлюоресценции по умолчанию DarkSlateGray. Измените это на черный.
    6. Нажмите Подготовьте все.
  3. Проверка спектрально несмешанных изображений
    ПРИМЕЧАНИЕ:
    Когда спектральный шаг unmixing завершен, создается композитное изображение, состоящее из всех цветов.
    1. Нажмите на значок «Оторитиглаза» view. Здесь каждый цвет в "Компонентный дисплей" может быть выключен или на вид окрашивания каждого отдельного маркера.
    2. Визуально проверить окрашивание и морфологии клеток, чтобы убедиться, что нет перекрытия маркера, если это не имеет биологического значения. Патологоанатом может помочь проверить окрашивание, а также.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание на мультиплексном слайде должно быть проверено, оставляя один фторфор в то время, и обзор окрашивания картины. Кроме того, проверка также поможет определить сильные фторфоры, которые появляются в смежных спектров из-за антитела крест говорить или кровоточить через.
    3. Для патологическихпредставлений, которые имитируют яркие изображения для каждого флуоресцентного маркера, нажмите кнопку «Выберите компонентное изображение». Здесь выберите маркер для просмотра смоделированного яркого изображения.

7. Анализ многоспектральных изображений с помощью сегментации клеток и фенотипирования

ПРИМЕЧАНИЕ: После проверки спектрально несмешанного изображения, сегментация клеток может быть выполнена с помощью программного обеспечения машинного обучения, которое будет обеспечивать пошаговые инструкции. Сегментация тканей здесь не проводилась. Если панель включает в себя один или несколько тканей конкретных маркеров и особенно, если ткань грязная, сегментации тканей должны быть выполнены.

  1. Выберите"Цитоплазма"и"Membrane"по опции "Сегмент".
    ПРИМЕЧАНИЕ: "Nuclei" выбирается по умолчанию.
  2. Выберите маркер из панели. Назначай маркер для обнаружения ядер, цитоплазмы или мембраны. Например, DAPI может быть выбран для обнаружения ядер и CD3 для мембраны.
  3. Нажмите на кнопку эллипсис ('...'), чтобы выбрать опцию под "использовать этот сигнал, чтобы найти". Например, "ядра" для DAPI. Несколько маркеров панели могут быть выбраны для сегментации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для цитоплазмических или мембранных маркеров выберите« Используйте этот сигнал для оказания помощи в ядерной сегментации».
  4. Программное обеспечение автоматически обнаруживает и создает маску для ядра, цитоплазмы и мембраны на изображении.
  5. Убедитесь, что все ячейки «замаскированы» для сегментации. Чтобы настроить, переключитесь на вид патологии для конкретного маркера, выбранного в 7.3. и использовать параметры конфигурации в программном обеспечении.
  6. Нажмите "Сегмент Все", чтобы сегментировать ячейки.
  7. После сегментации клеток, приступить к фенотипирования клеток. На этом этапе выберите маркеры, необходимые для фенотипирования, и вручную выберите не менее пяти ячеек, которые ярко окрашены выбранным маркером. Это обучает программное обеспечение, чтобы затем автоматически обнаружить все ячейки, окрашенные выбранным маркером на изображении.
  8. Создается фенотипная карта. Проанализируйте, чтобы убедиться, что ячейка окрашенных маркером правильно фенотипии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фенотипирование клеток может быть итеративным процессом. Если программное обеспечение не в состоянии фенотип клетки правильно, это означает, что обучение является неадекватным или неправильным. В этом случае пользователь должен вручную выбрать больше ячеек и переобучить программное обеспечение и повторить этот шаг до тех пор, пока пользователь не будет удовлетворен обучением.
  9. Создайте группу под названием "Другие" и включите ячейки, которые не окрашены ни для одного из маркеров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для обучения программного обеспечения, чтобы исключить все неокрашенные ячейки из фенотипирования.

8. Экспорт изображений и аналитических таблиц

  1. Нажмите кнопку Экспорт, чтобы просмотреть панель экспортных настроек.
  2. В "Экспортном каталоге" нажмите "Обзор", чтобы выбрать место для экспорта изображений.
  3. В "Опциях экспорта изображений" выберите формат вывода изображений.
  4. В списке "Изображения для экспорта" выберите изображения, которые будут экспортироваться. "Композитное изображение" является окончательным псевдоцветным несмешанным изображением. "Патология Просмотров" являются отдельные моделируемые яркие изображения и "Компонентные изображения (многообразие TIFF)" является многообразным TIFF файл данных компонентов, которые могут быть использованы сторонних анализа программного обеспечения.
  5. Нажмите кнопку"Экспорт для всех",чтобы экспортировать изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Таблицы из анализа также могут быть выбраны и экспортированы на этом этапе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Обнаружение одноразовых маркеров на замороженных секциях селезенки
Поскольку полуавтоматизированная система визуализации использует систему жидкокристаллического tunable filter (LCTF), которая позволяет более широкий диапазон обнаружения длинволн25,и потому, что не было выполнено никаких шагов по усилению сигнала, мы сначала оптимизировали обнаружение наших первичных конъюгированных антител для каждого маркера на микроскопе. Пример показан на рисунке 1, где каждый одноцветный маркер псевдо-цветной красный. Alexa Fluor конъюгированных антител, используемых здесь были проверены компаниями для иммунофлуоресценции и потока цитометрии. Тем не менее, per-CP-Cy5.5 фторофор атедлян только для цитометрии потока. Мы смогли обнаружить этот цвет в наших одноцветных слайдов, поддерживая пригодность потока цитометрии проверенных антител для использования в многоспектральной визуализации и обеспечивая преимущество использования таких антител для проверки наблюдений с использованием двух различных методов (т.е. цитометрии потока и многоспектральной визуализации). Затем мы приступили к выполнению многоспектральной визуализации замороженных тканей.

Обнаружение многоцветной флуоресценции на замороженной селезенке мыши
Для проверки метода окрашивания мультиплексов и спектральной визуализации мы использовали мышь замороженных селезенки ткани, которая имеет обилие иммунных клеток. На рисунке 2 показано спектрально несмешанное изображение различных маркеров в разделе замороженной мышиной селезенки. Антитела, клоны и концентрации, используемые для окрашивания, описаны в таблице 2. На захваченном изображении показана часть зоны Т-клеток, идентифицированная наличием маркеров CD3, CD4 и CD8, окруженных миелоидными клетками, выражающими CD11b, в основном наблюдаемые в маргинальной зоне. Регионы размножающихся клеток, выражающих Ki67, наблюдаются в основном в зародышевых центрах. Вариант "Патология Просмотров" для каждого маркера показал свою индивидуальную картину окрашивания в ткани. Различные модели окрашивания для CD11b, Ki67 и CD3, CD4, и CD8 маркеры вместе были замечены, предполагая, что метод окрашивания мультиплексов и спектральной визуализации работал на замороженных тканей.

Многоцветное обнаружение флуоресценции на замороженных миндалинах человека
После тестирования окрашивания панели подходит для ткани мыши, мы затем оценили отдельную панель для замороженных человеческих миндалин ткани. На рисунке 3 показано спектрально несмешанное изображение различных используемых маркеров. Антитела, клоны и концентрации, используемые для окрашивания, описаны в таблице 2. На снимке показан фолликулярный зародышевой центр26, выражающий В-клетки, идентифицированные маркером CD20. Пролиферирующие клетки в фолликулярном зародышевом центре были выявлены Ki67. Некоторые из этих размножающихся клеток costained с CD20 и может быть центропластика27, наивные В-клетки, которые подвергаются активной соматической гипермутации. Фолликулярные зародышевые центры были окружены межфолликулярной областью Т-клеток, идентифицированной экспрессией CD3, CD4 и CD8. Опять же, различные модели окрашивания наблюдались здесь, подтверждающие, что методология работала на замороженные ткани.

Применение многоспектральной флуоресценционной визуализации на замороженной ткани опухоли мыши
Многоспектральная визуализация является полезным инструментом для мониторинга инфильтрации иммунных клеток в опухолях в качестве прогноза для иммунотерапии. С этой целью мы решили испачкать замороженный образец опухолевой ткани мыши и обнаружить инфильтры иммунных клеток. Линия клеток HLF16 используется в качестве вируса папилломы человека (ВПЧ)- опухолевая модель рака шейки матки у трансгенных мышей HLA-A-020128. Трансгенная клеточная линия была разработана путем трансфектирования фибробластов легких сердца от HLA-A-0201 с oncogenes HPV16 E6 и E7 и H-Ras V1228. Т-клетки и опухоли, связанные макрофаги являются наиболее распространенными иммунными инфильтратов, присутствующих в опухолях29. На рисунке 4 показано спектрально несмешанное изображение на замороженном участке опухоли HLF16 вместе с видами патологии; индивидуальные модели окрашивания показаны на дополнительной рисунке 1. Антитела, клоны и концентрации, используемые для окрашивания, описаны в таблице 2. На снимке показаны области инфильтрационных Т-клеток, идентифицированных маркерами CD3 и CD8, а также наличие других линий миелоидных клеток, выявленных маркером CD11b. Захваченный регион также показывает опухолевые макрофаги (TAMs), возможно, фенотипа M2, обнаруженного маркером CD20630, который тесно связан с несколькими размножающимися клетками, обнаруженными какKi67.

Программное обеспечение машинного обучения2 поставляется с функциями, такими как анализ тканей и клеток. Эти анализы обычно проводятся на тканях FFPE, окрашенных усиливающимся сигналом. Поскольку наша методология не использует усиливание сигнала, мы хотели проверить, можно ли использовать программное обеспечение для анализа окрашивания замороженных тканей. Используя адаптивную функцию программного обеспечения, мы смогли сегментировать клетки на основе ядерного и мембранного маркера и фенотипные клетки на основе маркеров, используемых для окрашивания. На рисунке 5 показаны карты сегментации клеток и фенотипа и количество окрашенных клеток для каждого маркера, проанализированных программным обеспечением, демонстрируя, что программное обеспечение может быть использовано для количественной оценки многоспектрального окрашивания замороженных тканей.

Figure 1
Рисунок 1: Обнаружение первичных конъюгированных антител с помощью жидкокристаллического фильтра микроскопа. Первичные конъюгированные антитела к указанным маркерам были окрашены на замороженную селезенку мыши и обнаружены с помощью многоспектральной системы визуализации Vectra 3.0 под 20x целями. CD3 на Alexa Fluor 488, CD8 на Alexa Fluor 594, CD11b на Per-CP Cy5.5, CD206 на Alexa Fluor 647 и Ki67 на Alexa Fluor 555. Каждый маркер псевдо-красный цвет. На этих слайдах не использовалось противокосяние. Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Многоспектральное изображение на замороженной селезенке мыши. (A) Целый слайд сканирования мультиплексированных окрашенных слайд, принятых под 4x целей. Для многоспектральной визуализации была выбрана марка 2 x 2 в разных регионах ткани. Шкала бар 100 мкм. (B) Композитное изображение, сделанное под 20x цель юбиляра после спектрального unmixing. Псевдоцветные маркеры указаны и увеличенное изображение в красной коробке отображается рядом с изображением. Шкала бар 20 мкм. (C)Патология просмотров для каждого отдельного маркера. Рядом с изображением отображается увеличенное изображение для каждого маркера в красной коробке. Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Многоспектральная визуализация на замороженном миндалинах человека. (A) Весь слайд сканирования мультиплексированных окрашенных слайд, принятых под 4x цели. Для многоспектральной визуализации была выбрана марка 1 x 1 (669 мкм x 500 мкм) в разных регионах ткани. Шкала бар 100 мкм. (B) Композитное изображение после спектрального unmixing принятых под 20x цели. Псевдоцветные маркеры указаны и увеличенное изображение в красной коробке отображается рядом с изображением. Шкала бар 20 мкм. (C)Патология просмотров для каждого отдельного маркера. Рядом с изображением отображается увеличенное изображение для каждого маркера в красной коробке. Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Многоспектральная визуализация на замороженной опухоли мыши. Многоспектральная визуализация была выполнена на 1 х 1 области замороженной опухоли мыши HLF16, взятой под 20-x целью. Композитное изображение (см. выше). Указано псевдоцветные маркеры и изображены виды патологии (см. ниже) для каждого отдельного маркера. Увеличенное изображение для каждого маркера в красной коробке отображается рядом с исходным изображением. Шкала бар 20 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Анализ раздела опухоли замороженной мыши. (A)Карта сегментации ячеек. Была выполнена адаптивная сегментация клеток с использованием inForm. Программное обеспечение было обучено определять ядра (зеленые) и мембраны (красный). (B) Фенотип карты для каждого окрашенных маркера. Программное обеспечение было обучено для определения фенотипов на основе окрашивания. Цветная точка представляет указанный маркер. "Другие" (черные) относится к клеткам, которые не были окрашены для указанного маркера. (C) Сюжет бара (средний - STDEV), изображающий количество окрашенных ячеек для каждого маркера в двух многоспектральных изображениях. Это число указывает на фенотипные клетки в каждом изображении, но не указывает, являются ли маркеры coexpressed. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Флюрофор Максимум эксцирования (нм) Максимальная эмиссия (нм) Ожидаемое обнаружение в наборе фильтров (имя)
Алекса Флюор 488 488 519 FITC
Алекса Флюор 555 555 580 Cy3 и Техас Ред
Алекса Флюор 594 590 617 Техас Красный
Alexa Fluor 647 650 668 Техас Красный и Cy5
ДАПИ 350 470 ДАПИ
PerCP-Cy 5.5 482 690 Cy3, Техас Красный и Cy5

Таблица 1: Список фторофоров с их максимальным возбуждением и длиной волн выбросов и ожидаемым обнаружением в соответствующих наборах фильтров.

Замороженная мышь селезенка
Антитела/краситель Клон Концентрация (мкг/мл)
Alexa Fluor 594 против мыши CD8a 53-6.7 10
Alexa Fluor 488 анти-мышь CD3 17A2 20
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 GK1.5 10
PerCP-Cy 5.5 Крыса Anti-CD11b M1/70 2
Alexa Fluor 555 Мышь против Ки-67 B56 10
ДАПИ 0.1
Замороженная опухоль мыши
Антитела/краситель Клон Концентрация (мкг/мл)
Alexa Fluor 594 против мыши CD8a 53-6.7 20
Alexa Fluor 488 анти-мышь CD3 17A2 20
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) C068C2 5
PerCP-Cy5.5 Крыса Anti-CD11b M1/70 1
Alexa Fluor 555 Мышь против Ки-67 B56 0.25
ДАПИ 0.1
Замороженные человеческие миндалины
Антитела/краситель Клон Концентрация (мкг/мл)
Alexa Fluor 594 анти-человеческий CD3 UCHT1 10
PerCP/Cyanine5.5 анти-человеческий CD4 РПА-Т4 4
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a C8/144B 10
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 L26 10
Alexa Fluor 555 Мышь против Ки-67 B56 1
ДАПИ 0.1

Таблица 2: Список используемых антител, клонов и концентраций.

Дополнительная рисунок 1: Индивидуальные модели окрашивания замороженной опухоли HLF16 после спектрального несмешивания. Шкала бар 20 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Замороженные ткани широко используются для визуализации mIF традиционно обнаружить от трех до четырех маркеров31 на ткани с помощью прямого и косвенногометода 32. В прямом методе, антитела спрягаются к флуоресцентным красителям или квантовым точкам33 для обозначения ткани, в то время как в косвенном методе, неконъюгированные первичные антитела используются для обозначения ткани, а затем фторофора-конъюгированных вторичных антител, которые конкретно распознает первичное антитело. Некоторые из недавних одновременных мультиплексных подходов, обсуждавшихся ранее, также могут быть использованы для окрашивания замороженных тканей и обнаружения более четырех маркеров. Но стоимость реагентов и время, задеваемые на окрашивание, становятся интенсивными в зависимости от количества обнаруженных маркеров. Другой мультиплекс ный метод мультиплексдлядлять ткани - мультиэпитоп-лиганд-картография (MELC)34. Техника включает в себя окрашивание образца с флюорофором-конъюгированных антител, изображения, и photobleaching флюорофора. Основным предостережением этой техники является то, что только одно поле или область ткани может быть мультиплексирована. Для того, чтобы мультиплекс других полей или регионов техника должна быть выполнена вручную, что занимает много времени, или требует автоматизации, которая является дорогостоящим. Одна группа35 смогла обнаружить шесть цветов на замороженных тканях, используя сочетание прямого, косвенного и TSA окрашивания. Тем не менее, окрашивание тканей заняло 2 дня. Для сравнения, наша методология использует одновременный метод окрашивания мультиплекса, включающий применение коктейля из пяти непосредственно спряженные антитела плюс DAPI для окрашивания замороженных тканей в течение 90 минут. Кроме того, используя полуавтоматизированную многоспектральную систему визуализации флуоресценции, мы смогли спектрально отделить и обнаружить шесть маркеров в замороженной селезенке, миндалинах и опухолевых тканях с помощью этой упрощенной методики окрашивания мультиплексов. Cy3, Texas Red и наборы фильтров Cy5, доступные на микроскопе, предоставляют возможности для обнаружения дополнительных фторфоров, тем самым потенциально увеличивая количество маркеров, которые могут быть обнаружены одновременно в замороженных тканях.

Мультиплексок окрашивания с использованием подхода TSA на ткани FFPE требует антигена поиска шаг с последующим последовательной маркировки, стирки и зачистки шаги. Выполнение процедуры колеблется от 1-2 дней в зависимости от времени инкубации, используемых для антител6. Недавно, используя микрофлюидный процессор ткани, четыре плисс ыок с использованием подхода TSA было выполнено на ткани FFPE под 90 мин. Другие методы мультиплекса для тканей FFPE могут быть выполнены под 4-5 h с помощью автоматизированного пятен. Тем не менее, соответствующие антигена поиска шаги должны быть оптимизированы для обеспечения доступности эпитопа для антител36, который, в свою очередь, опирается на тщательное рассмотрение клонов антител, а также порядок маркеров обнаруживаются. Например, некоторые клоны антител CD3 не могут быть использованы, потому что впоследствии CD4 и CD8 антитела не обнаружены37. Аналогичным образом, есть изменчивость обнаружения антигена среди доступных клонов антител17,18. Поэтому мультиплексное окрашивание тканей FFPE требует оптимизации клонов антител, их концентраций и порядка, в котором они окрашены, что отнимает много времени. Напротив, отсутствие обширной обработки тканей замороженных тканей позволяет использовать различные клоны антител с высокой специфичностью. Кроме того, клоны антител, доступные для замороженных тканей, также могут быть использованы в цитометрии потока и ELISA, что позволяет одновременно йвалитья через различные анализы. Ткань архитектуры также озабоченность в замороженных тканях38. Мультиплексное окрашивание, показанное здесь на замороженных тканях, значительно быстрее, чем подход TSA. Комбинации фторофора требуют тщательного отбора маркеров, чтобы антитела не стерически мешали друг другу, особенно когда обнаружены различные антигены, выраженные в одном и том же клеточном месте. Мы выбрали маркеры, которые окрашивают различные клетки на фторфоры, которые являются спектрально отдельными, что позволяет лучше обнаружить. Концентрации антител также требуют оптимизации, но из-за того, что протокол окрашивания быстр, общее время, заехаваемые на оптимизацию, не отнимает много времени. Предостережением к нашему методу может быть неспособность обнаружить низкие экспрессивные маркеры в тканях. Некоторые из мультиплексных подходов к окрашиванию тканей FFPE включают шаг усиления сигнала, который полезен для обнаружения низковыражающих маркеров. Тем не менее, использование вторичных и третичных антител могут быть использованы для повышения сигнала. В таких случаях следует избегать перекрестной реактивности антител в панели, чтобы предотвратить неправильное толкование результатов.

В дополнение к селезенке мыши и человеческим тонзильт тканей, которые богаты иммунными клетками, мы использовали ткани опухоли в качестве примера для предлагаемой многоспектральной флуоресценции изображения замороженных тканей. Многоспектральная флуоресценция визуализации в опухолях предоставила ценную информацию, такие как характеристика микроокружения опухоли (TME)39, прогнозирование успеха приемных Т-клеток передачи в злокачественной меланомы40, и характеристики белков в опухолевых сигналов трансдукции пути41. Используя маркеры, характерные для иммунных клеток, обычно встречающихся в опухолях, мы смогли обнаружить проникновение CD8 Т-клеток и TAMs в опухолевой ткани HLF16, используемой в этом исследовании. Мы использовали программное обеспечение машинного обучения для успешного сегмента и фенотипных ячеек. Multiplex окрашивание для тканей FFPE использует шаг усиления сигнала для повышения соотношения сигнала к шуму (SNR), который помогает обработке изображений и количественной оценке42,43. Программное обеспечение машинного обучения было использовано для анализа тканей FFPE, окрашенных усиливанием сигнала2. Присутствуемая здесь методология не использует усиливание сигнала, но мы смогли успешно сегментировать и фенотипные клетки с помощью программного обеспечения. Для дальнейшего анализа (например, фенотипного коэкспрессии и пространственных отношений) и точного толкования количественной оценки обучение программному обеспечению требует проверки с помощью учебного набора, набора тестов и набора валидации. В итеративном процессе один набор изображений (т.е. набор обучения) используется для обучения программного обеспечения машинного обучения для определения фенотипов до тех пор, пока прогнозы модели для отдельного набора изображений (т.е. тестового набора) не будут точными. После завершения обучения анализируется окончательная партия изображений (т.е. набор проверки), чтобы увидеть, была ли чрезмерной установки.

В заключение, представленная здесь методология представляет собой быстрый способ выполнения многоспектральной флуоресценции с использованием замороженных тканей. Метод полезен для обнаружения маркеров, к которым либо антитела отсутствуют, либо не могут быть обнаружены в тканях FFPE. В сочетании с программным обеспечением машинного обучения, время, затрачиваемое на выполнение количественного анализа, может значительно облегчить быстрые доклинические и клинические диагнозы и может быть применено в области пространственной транскриптомики высокого разрешения, которая использует замороженные ткани44.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Acknowledgments

Руководство по визуализации и анализу было предоставлено Исследовательским центром ресурсов - Научно-исследовательская гистологическая и тканевая визуализация ядра в Университете Иллинойса в Чикаго, созданная при поддержке офиса вице-канцлера по исследованиям. Работа была поддержана NIH/NCI RO1CA191317 в CLP, NIH/NIAMS (SBDRC грант 1P30AR075049-01) д-р А. Паллер, а также при поддержке Роберт Х. Лурье Всеобъемлющий онкологический центр для иммунотерапии оценки ядра в Северо-Западном университете.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone - 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone - L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone - UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone - C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone - C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone - GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1x Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone - M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1x ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33, (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70, (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50, (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (1), 13380 (2017).
  6. Wickenhauser, C., et al. Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. Pico de Coaña, Y. Springer. New York. 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, (1), 47 (2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24, (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11, (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20, (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19, (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174, (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51, (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54, (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26, (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21, (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62, (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82, (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125, (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22, (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12, (6), 479 (1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19, (1), 011017 (2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122, (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8, (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32, (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42, (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133, (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2, (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24, (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. 03 (2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65, (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202, (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46, (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244, (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2, (14), 93652 (2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19, (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7, (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120, (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. 563338 (2019).
Быстрый метод многоспектральной флуоресценции Визуализация замороженных секций тканей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).More

Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter