Summary
Bu yöntemin amacı, eritrosit CR1 yoğunluğu bilinen üç denek ile karşılaştırarak herhangi bir deneğin eritrositlerinde CR1 yoğunluğunu belirlemektir. Yöntem, deneklerin eritrositlerinin phycoerythrin (PE) kullanılarak güçlendirilmiş bir sisteme bağlı bir anti-CR1 monoklonal antikor ile immünoboya dan sonra akış sitometrisini kullanır.
Abstract
CR1 (CD35, C3b/C4b için Kompleman Reseptör tip 1) aktivasyonu tamamlayan, bağışıklık komplekslerini taşıyan ve humoral ve hücresel immün yanıtlara katılan yaklaşık 200 kDa'lık yüksek molekül ağırlıklı membran glikoproteindir. CR1 eritrositler de dahil olmak üzere birçok hücre tipinin yüzeyinde bulunur ve uzunluk, yapı (Knops veya KN, kan grubu) ve yoğunluk polimorfizmleri sergiler. Eritrosit başına CR1 (CR1/E) başına ortalama yoğunluk eritrosit başına 500 moleküldür. Bu yoğunluk bir bireyden diğerine (100-1.200 CR1/E) ve aynı bireyde bir eritrositten diğerine değişir. Burada cr1/E'nin yoğunluğunu ölçmek için sağlam bir akış sitometrisi yöntemi sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometrisi, düşük yoğunluklu olarak ifade eden denekler de dahil olmak üzere, güçlendirici bir immünboyama sistemi yardımıyla sitometri yöntemi ni sintometri sitometrisi sitometrisi sitometrisi sitometri sitometrisi sitometrisi sitometrisi sitometris Bu yöntem, Alzheimer hastalığı (AD), sistemik lupus eritematosus (SLE), AIDS veya sıtma gibi hastalıklarda CR1 eritrosit ekspresyonunun alçaltıcılığını göstermemizi sağlamıştır.
Introduction
CR1 (kompleman reseptör tip 1, CD35) eritrositler1,B lenfositler2, monosit hücreler, bazı T hücreleri, foliküler dendritik hücreler3, fetal astrositler4ve glomerüler podositler5gibi birçok hücre tipinin yüzeyinde bulunan 200 kDa transmembran glikoproteindir. CR1 onun ligands C3b müdahale, C4b, C3bi6,7,8,9, ilk kompleman bileşeni bir alt birim, C1q10 ve MBL (mannan bağlayıcı lektin)11 kompleman aktivasyonunu inhibe ve humoral ve hücresel immün yanıt katılır.
Primatlar, insanlar da dahil olmak üzere, eritrosit CR1 karaciğer ve dalak bağışıklık komplekslerinin taşınması nda yer almaktadır, kan arındırmak ve deri veya böbrekler gibi savunmasız dokularda birikimini önlemek için12,13,14. Bağışıklık kompleksleri ve eritrositler arasındaki immün yapışı olgusu CR1 moleküllerinin sayısına bağlıdır15. İnsanlarda CR1/E'nin ortalama yoğunluğu sadece 500'dür (yani eritrosit başına 500 CR1 molekülü). Bu yoğunluk bir bireyden diğerine (100-1.200 CR1/E) ve aynı bireyde bir eritrositten diğerine değişir. "Null" fenotip bazı bireyler az ifade 20 CR1/E16.
CR1/E'nin yoğunluğu, CR1*117,18için gen kodlamasının intron 27'sinde bir nokta mutasyonuna bağlı iki eş-dominant otozomal alel tarafından düzenlenir. Bu mutasyon HindIII enzimi için ek bir kısıtlama alanı üretir. Bu durumda HindIII ile sindirim sonrası elde edilen kısıtlama parçaları CR1 güçlü bir ifade bağlı alel için 7.4 kb (H: yüksek alel) ve alel düşük CR1 ekspresyonu (L: düşük alel) bağlı alel için 6.9 kb. Bu bağlantı Kafkaslar ve Asyalılar bulunur ama Afrika kökenliinsanlarda 19.
Eritrosit CR1'in ekspresyon düzeyi, ekson 13 kodlama SCR 10 (I643T) ve ekson 19 kodlama SCR16 (Q981H) ile nokta nükleotit mutasyonlarının varlığı ile de ilişkilidir. Homozigot 643I/981Q'da yüksek, homozigot 643T/981H bireylerde düşüktür20. Böylece, "düşük" bireyler 150 CR1/E, "orta" bireyler 500 CR1/E, "yüksek" bireyler ise 1.000 CR1/E civarında ifade eder.
Bu eritrosit yoğunluğu polimorfizmine ek olarak CR1, farklı boyutlardaki dört allotipe karşılık gelen bir uzunluk polimorfizmi ile karakterizedir: CR1*1 (190 kDa), CR1*2 (220 kDa), CR1*3 (160 kDa) ve CR1*4 (250 kDa)21 ve kan grubu KN22'yekarşılık gelen bir antijenik polimorfizm .
CR1/E yoğunluğu bilinen üç denek kullanarak CR1/E'nin yoğunluğunu belirlemek için akış sitometrisine dayalı yöntemimizi sintometriye dayanarak sintometrisi, düşük yoğunluklu bir seviye (180 CR1/E), orta yoğunlukseviyesi (646 CR1/E) ve yüksek yoğunluklu bir seviye (966 CR1/E) ifade ederek, akış sitometresi kullanarak anti-CR1 immünoboyalamadan sonra eritrositveya kırmızı kan hücrelerinin (RBC) ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) ölçmek kolaydır. Daha sonra CR1/E yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak MFI'yi temsil eden standart bir çizgi çizilebilir. CR1/E yoğunluğu bilinmemektedir deneklerin MFI ölçümü ve bu standart çizgi ile karşılaştırılması, bireylerin CR1/E yoğunluğunu belirlemek mümkündür. Bu teknik laboratuvarda uzun yıllardır kullanılmaktadır ve sistemik lupus eritematosus (SLE)23, Edinsel immün yetmezlik sendromu (AIDS)24, sıtma25, ve son zamanlarda Alzheimer hastalığı (AD)26,27 gibi birçok patolojide eritrosit CR1 ekspresyonunda bir azalma tespitetmemizisağlamıştır . Anti-trombotik ilaçlar28'de olduğu gibi CR1'i eritrositlerle çifte hedefleyen ilaçların geliştirilmesi, CR1/E yoğunluğunun değerlendirilmesi ve CR1'i ölçmek için sağlam bir tekniğin kullanılabilirliği gerektirmektedir.
Sunulan protokol tek tekçalışır. Belirli ticari olarak kullanılabilen 96 kuyu plakası kullanan birçok kişide CR1/E'nin yoğunluğunu belirlemek için uyarlanabilir (Bkz. Malzeme Tablosu). Bu amaçla, herhangi bir 96 iyi plaka bizim yöntem adapte etmek kolaydır. Her örnek için eritrositlerin hücre süspansiyonu (0.5 x 106–1 x 10 6 eritrosit) kuyu başına dağıtılır.6 Her kuyu için, ilk birincil anti-CR1 antikor eklenir, sonra streptavidin PE, ikincil anti-streptavidin antikor, ve yine streptavidin PE, bizim yöntem aynı seyreltme kullanarak, ancak hacimleri adapte ve orantılılık saygı.
Cr1 için ölçülecek deneklerin ve deneklerden alınan kan örnekleri aynı anda çekilmeli, buzdolabında 4 °C'de saklanmalı ve 4 °C'de (buz ve/veya buzdolabında) kullanılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan kanı toplama ve işleme protokolü bölgesel etik komitesi (CPP Est II) tarafından gözden geçirildi ve onaylandı ve protokol numarası 2011-A00594-37'dir. Aşağıdaki protokolinsan kanının işlenmesini açıkladığı için, biyolojik tehlikeli maddelerin atılması na yönelik kurumsal kurallara uyulmalıdır. Laboratuvar önlükleri ve eldivenler gibi laboratuvar güvenlik ekipmanları giyilmelidir.
1. Eritrosit yıkama
NOT: İşlemden bir gün önce, büyükbaş hayvan serum albumininin (BSA) %0,15'ini içeren fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir PBS-BSA tamponu hazırlayın ve 4 °C'de buzdolabına koyun. Bu tampon bir yıkama tamponve seyreltme tampon olarak kullanılacaktır.
- 50 mL'lik bir tüpiçine 20 mL PBS-BSA pipet.
- Aspire 250 μL sodyum etilendirmin tetraasetik asit (EDTA) kan depolama tüplerinden tam kan antikoagüle ve PBS-BSA 20 mL içeren tüp ekleyin. Kapağı vidalayarak tüpü kapatın. Tüpü 2x ters çevirerek hafifçe karıştırın.
- 4 °C'de 10 dk 430 x g'datüpü santrifüj edin. 10 mL'lik pipet kullanarak supernatant'ı çıkarın ve atın. Nazik ve dikkatli pipetleme ile supernatant artık hacminde pelet resuspend.
- Pelet içeren tüpiçine 20 mL soğuk PBS-BSA (4 °C) ekleyin. 4 °C'de 10 dk 430 x g'datüpü santrifüj edin. 10 mL'lik pipet kullanarak supernatant'ı çıkarın ve atın.
- Pelet içeren tüpiçine 20 mL soğuk PBS-BSA (4 °C) ekleyin. 4 °C'de 10 dk 430 x g'datüpü santrifüj edin. Tüpü 4 °C'de santrifüjde bırakın ve bölüm 2'ye gidin.
2. Eritrosit seyreltme
- Pipet 3 mL soğuk PBS-BSA 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve 4 °C'de buz içinde bir rafta saklayın.
- Eritrositleri içeren santrifüjlü tüpü (adım 1.4) buza yerleştirilen bir rafa koyun.
- Pipet 8 μL peletli eritrositler pipet kullanarak ve eritrosit seyreltme elde etmek için PBS-BSA 3 mL içeren 50 mL tüp ekleyin. Eritrositlerin homojen hücre süspansiyonu elde etmek için tüpü elle hafifçe karıştırın.
3. Eritrosit immünostaining
- Pipet 100 μL eritrosit seyreltme (bölüm 4 elde) ve 1.4 mL tüpler ekleyin.
- 4 °C'de 4 30 x g'da5 dk tüpleri santrifüj edin. Santrifüj sırasında, PBS-BSA tamponunda 0,05 g/μL konsantrasyonda biyotinylated anti-CR1 J3D3 antikor seyreltme hazırlayın.
- Santrifüj yapıldıktan sonra supernatant'ı çıkarın ve atın.
- Doğrudan pelete 20 μL biyotinylated anti-CR1 J3D3 ekleyin. Negatif denetimi hazırlamak için, bunun yerine 20 μL PBS-BSA arabelleği ekleyin. Tüpleri hafifçe karıştırın ve 4 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.
- Kuluçka 45 dk sonra tüplere 750 μL PBS-BSA ekleyin. 4 °C'de 4 30 x g'da5 dk tüpleri santrifüj edin. Supernatant'ı çıkarın ve atın. Tekrar.
- Bu arada, PBS-BSA tampon seyreltilmiş streptavidin-phycoerythrin bir 1:10 seyreltme hazırlayın. Pipet 20 μL streptavidin-phycoerythrin 1:10 seyreltme ve tüpler eklemek. Tüpleri hafifçe karıştırın ve 4 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.
- Tüplere 750 μL PBS-BSA tamponu ekleyin. 4 °C'de 4 30 x g'de5 dk boyunca iyice karıştırın ve santrifüj edin. Supernatant'ı çıkarın ve atın. Tekrar.
- Santrifüj sırasında, PBS-BSA tampon seyreltilmiş biyotinylated anti-streptavidin antikor 1:100 seyreltme hazırlayın.
- Santrifüj yapıldıktan sonra supernatant'ı çıkarın ve atın.
- Pipet 20 μL 1:100 biyotinylated anti-streptavidin tüpler içine seyreltilmesi. Tüpleri hafifçe karıştırın. Tüpleri 4 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.
- 45 dk inkübasyondan sonra, pipet 750 μL PBS-BSA tamponu ve tüplere ekleyin. 4 °C'de 4 30 x g'da5 dk tüpleri santrifüj edin. Supernatant'ı çıkarın ve atın. Tekrar.
- Pipet 20 μL streptavidin-phycoerythrin 1:10 seyreltme ve tüpler içine ekleyin. Tüpleri hafifçe karıştırın. Tüpleri 4 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.
- Pipet 750 μL PBS-BSA tampon ve tüpler içine ekleyin. İyice karıştırın ve 430 x g4 °C'de 5 dk tüpleri santrifüj. Supernatant'ı çıkarın ve atın. Bu adımı 2x tekrarlayın.
4. İmmünosli eritrosit fiksasyonu
- Son santrifüj sırasında, yıkama tamponu PBS-BSA kullanarak% 37 formaldehit 1:100 seyreltme fiksasyon tampon uy.
- Pipet 450 μL fiksasyon tamponve 5 s için girdap ise immünosülereriterit tüpleri (adım 3.13) ekleyin.
- Pipet 5 mL yuvarlak alt tüpler içine tüm sabit hücreleri ve buzdolabında saklayın.
NOT: Protokol burada 48 saate kadar duraklatılabilir.
5. Lekeli eritrositlerin akış sitometri analizi
NOT: Sitometrik okumaların nasıl yapılacağını bilmek için sitometre (Bkz. Malzemeler Tablosu)için operatör kılavuzuna başvurmanız tavsiye edilir. Aşağıdaki önerilen parametreler kullanılan alete uygulanır ve her sitometre için optimize edilmelidir.
- Akış sitometresini açın, sonra bilgisayarı açın. Optik sistem sıcaklığını 30 dakika açık bırakarak sabitlesin. Sitometrenin iş istasyonuna bağlı olduğundan emin olmak için yazılımdaki sitometre penceresini kontrol edin (Sitometre Bağlı İleti görüntülenir).
- Arabellek kabının dolu olup olmadığını ve atık kabın boş olduğundan kontrol edin. Temizleme sistemini kullanarak arabellek filtresindeki ve tampon hattındaki hava kabarcıklarını çıkarın. Sitometrenin konsolundaki Prime düğmesine basarak akışkan sistemi prime. Gösterge ışığı kırmızıdan yeşile değişene kadar bekleyin.
- Akışkanları temizlemek için, numune enjeksiyon portuna 3 mL'lik bir temizleme çözeltisi içeren bir tüp yerleştirin ve temizleme solüsyonunun yüksek numune akış hızıyla 5 dk boyunca çalışmasını bekleyin. Distile su ile durulama çözeltisi ile tekrarlayın. Numune enjeksiyon portuna su içeren tüpü bırakın.
- Kalibrasyon boncukları hazırlamak için, pipet 400 μL PBS yuvarlak bir alt tüpün altına. 30 s. PBS içeren yuvarlak alt tüp bir damla ekleyin girdap tarafından güçlü boncuk stokları karıştırın. 30 s için girdap tarafından dikkatle karıştırın.
- Performans denetimini çalıştırın. Yazılımdaki sitometre Kurulum ve İzleme modülünü açın ( Şekil1A). PE immünoleme kullanarak deney için sitometre yapılandırmasının doğru olduğunu doğrulayın. Kalibrasyon boncuk toplu yapılandırma ile doğru olduğunu doğrulayın.
- Boncuk tüpünü numune enjeksiyon portuna takın ve düşük numune akış hızıyla çalıştırın. Tamamlanması yaklaşık 5 dakika süren performans denetimini çalıştırın). Performans denetimi tamamlandıktan sonra, sitometre performansının tatmin edici olduğunu doğrulayın(Şekil 1B). Yazılımdaki sitometre Kurulum ve İzleme modüllerini kapatın.
- Deneme ayarlamak ve uygulama ayarları oluşturmak için tarayıcı araç çubuğundaki Yeni Deneme düğmesini tıklatın ve yeni denemeyi açın. Uygun sitometre ayarlarını seçerek parametreleri belirtin: İleri Dağılım (FSC), Yan Dağılım (SSC) ve PE denemenin açılır menüsünden(Şekil 1C). FSC parametresi için Doğrusal Mod'u ve SSC ve PE parametreleri için Logaritma Modu'nu seçin.
- Açık denemede, Sitometre Ayarları 'nı(Şekil 1D)seçin, ardından Uygulama Ayarları'nıseçin ve genel bir çalışma sayfası oluşturun (Şekil 1E). Optimizasyona rehberlik etmek için gri kutuları ve artı işaretini kullanın.
- Lekesiz kontrol tüpünü sitometreye yükleyin ve Edinme'yiçalıştırın. FSC ve SSC gerilimlerini optimize ederek ilgi alanının (örn. RBC) ölçekte olduğundan emin olun. İlgi alanıyla karışmadan enkazı ortadan kaldırmak için FSC eşik değerini optimize edin.
- FSC vs SSC arsa Üzerinde RBC'lerin etrafına bir kapı çizin. RBC popülasyonunu PE floresan'ın nokta çiziminde görüntüleyin. Gerekirse, negatif popülasyonu gri kutulara yerleştirmek için fotoçarpan tüpünün (PMT) gerilimlerinin floresanını artırın. Lekelenmemiş kontrol tüpünü sitometreden boşaltın.
- Pozitif popülasyonların ölçekte olduğunu doğrulayın. Lekeli kontrol tüpünü sitometreye yükleyin ve Edinme'yi çalıştırın. Pozitif popülasyon tamamen ölçekte görülene kadar pozitif popülasyon için PMT gerilimini küçültün. Sonra lekeli örnek boşaltın.
- Örnekleri kaydetmek ve analiz etmek için, yeni bir küresel çalışma sayfasında, verileri önizlemek için aşağıdaki çizimleri oluşturun: 1) FSC vs SSC ve 2) PE floresan histogram. İlk örneği sitometreye yükleyin ve Edinme'yiçalıştırın.
- FSC vs SSC arsa eritrositler etrafında bir RBC kapısı çizin. Pe floresan histogramında RBC popülasyonunu görüntüleyin. İstatistik görünümünde, GR popülasyonlarında PE floresan parametrelerinin ortalamasını seçin (Şekil 1F).
- Edinme panosunda, durdurma kapısındaki tüm olayları ve kaydedilecek 10.000 olayı seçin (Şekil 1G). Verileri Kaydet'itıklatın. Olay kaydı tamamlandığında, ilk tüpü sitometreden çıkarın. Genel çalışma sayfası çizimleri Şekil 2'dekigibi görünmelidir.
- Aşağıdaki örnekleri yükleyin ve kaydedin.
6. Eritrosit CR1 yoğunluğunun belirlenmesi
- "Düşük" öznesine karşılık gelen örneklerin ortalama floresan yoğunluklarının değerlerini alın(Şekil 3, Tablo I, RBC MFI), "orta" konu(Şekil 4, Tablo D, RBC MFI), "yüksek" özne(Şekil 4, Tablo I, RBC MFI) ve negatif kontrol örneğine(Şekil 3, Tablo I, RBC MFI).
- CR1 yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak ortalama floresan yoğunluğunu temsil eden bir grafikte, negatif kontrole karşılık gelen dört noktayı, "düşük" özneyi, "orta" özneyi ve "yüksek" özneyi (mavi noktalar, Şekil 6)yerleştirin.
- Kalibrasyon çizgisini ve denklemini almak için regresyon çizgisini çizin.
- Yoğunluğu belirlenecek deneklere karşılık gelen numunelerin ortalama floresan yoğunluğudeğerlerini alın. (Şekil 5, Tablo D ve I, RBC MFI).
- Ortalama floresan yoğunluklarının değerlerini kullanarak "Y" yerine "Y" yerine denklemi edinin ve CR1/E'nin yoğunluğunu hesaplayın (Şekil 6).
- Ortalama floresan yoğunluk değerlerinin ve belirlenen CR1/E yoğunluğunun kalibrasyon hattındaki bir noktaya karşılık geldiğini grafikte kontrol edin(Şekil 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CR1 yoğunluğu bilinen üç deneğin eritrositleri ("düşük" özne [180 CR1/E], "orta" konu [646 CR1/E], ve "yüksek" konu [966 CR1/E]) ve CR1 yoğunluğu nun belirlenmesi gereken iki deneğin eritrositleri, fikotorin flukromoru kullanarak bir anti-CR1 antikor ile birleştirilmiş bir anti-CR1 antikor ile immünosiye edildi. Başlangıçta, düşük-yüksek aralıktaki deneklerin CR1 yoğunluğu radiolabeled antikorlar kullanılarak Scatchard yöntemi29 ile belirlendi. Belirlenen standartlar (düşük, orta ve yüksek) bir kalibrasyon eğrisi için kullanılmıştır ve sitometri30yöntemimiz ile yeni standartların veya alt standartların ölçülmesini mümkün kılmıştır. Akış sitometresinde immünosisanerin geçişinden sonra, etiketlemenin yoğunluğu gözlendi ve her bir özne için ortalama floresan yoğunluğu olarak ölçüldü (RBC MFI) (Şekil 3F,I; Şekil 4B,D,F,I; Şekil 5B,D,F,I). Bir eğri eritrosit CR1 bilinen yoğunluğu ile deneklerin değerleri kullanılarak çizildi ("düşük" için "yüksek") ortalama floresan yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak rapor layarak. Bu eğriden kaynaklanan regresyon çizgisinin diğer deneklerin ortalama floresan yoğunluğu değerleri ile karşılaştırılması CR1/E yoğunluğunu belirlemiştir(Şekil 6). Şekil 7 genel iş akışını gösterir.
Şekil 1: Akış sitometri protokolü sırasında görünen sitometre konsolu ve pencereleri. (A) Protokolün 5.5. (B) Protokolün 5.6. (C) Protokolün 5.7. (D) Protokolün 5.8. (E) Protokolün 5.8. (F) Protokolün 5.13. (G) Protokolün 5.14. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Genel çalışma sayfası çözümleme nesnelerinin görünümü. Protokolün 5.14. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Negatif kontrole karşılık gelen eritrositlerin anti-CR1 immünostaining ve düşük CR1 yoğunluğunu (180 CR1/E) ifade eden aralıktan ("düşük" özne) deneğe akış sitometri analizi sonuçları. Her konu için: (A,E) boyut ve granülometri parametrelerine göre edinilen olayların görünümünü gösteren nokta lekesi, (G) olaylar arasında eritrosit popülasyonunu seçen kapı, (B,F) etiketlemenin yoğunluğunu gösteren bir histogram, (C,H) eritrositlere karşılık gelen olayların sayısını ve bunların yüzdesini gösteren ilişkili bir istatistiksel tablo, (D,I) ortalama floresan yoğunluğunu veren ilişkili bir tablo (RBC MFI). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Diziden gelen deneklere karşılık gelen eritrositlerin anti-CR1 immünboyamı akım sitometri analizinin sonuçları: ORTA CR1 yoğunluğunu ifade eden "orta" konu (646 CR1/E) ve YÜKSEK CR1 yoğunluğunu ifade eden "yüksek" özne (966 CR1/E). Her konu için: (A, E) boyut ve granülometri parametrelerine göre edinilen olayların görünümünü gösteren nokta lekesi, (G) olaylar arasında eritrosit popülasyonunu seçen kapı, (B, F) etiketlemenin yoğunluğunu gösteren bir histogram, (C, H) eritrositlere karşılık gelen olayların sayısını ve bunların yüzdesini gösteren ilişkili bir istatistiksel tablo, (D, I) ortalama floresan yoğunluğunu veren ilişkili bir tablo (RBC MFI). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Eritrositlerin anti-CR1 immünostaining'inin, CR1 yoğunluğu belirlenecek olan deneklere karşılık gelen akış sitometri analizi sonuçları. Her konu için: (A, E) boyut ve granülometri parametrelerine göre edinilen olayların görünümünü gösteren nokta lekesi, (G) olaylar arasında eritrosit popülasyonunu seçen kapı, (B, F) etiketlemenin yoğunluğunu gösteren bir histogram, (C, H) eritrositlere karşılık gelen olayların sayısını ve bunların yüzdesini gösteren ilişkili bir istatistiksel tablo, (D, I) ortalama floresan yoğunluğunu veren ilişkili bir tablo (RBC MFI). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: CR1 yoğunluğunun belirlenmesini sağlayan kalibrasyon eğrisi ve regresyon çizgisi. (A), (B) Aralık deneklerin bilinen CR1 yoğunluğuna göre çekilen kalibrasyon eğrisi ve regresyon çizgisi (negatif kontrol: 0 CR1, "düşük" konu [180 CR1/E], "orta" özne [646 CR1/E], ve "yüksek" özne [966 CR1/E]) ve akış sitometrisi tarafından elde edilen ortalama floresan yoğunluğunun ilgili değerleri. (C), (D) Bu regresyon çizgisinin denkleminden, ortalama floresan şiddeti akış sitometrisi ile ölçülen denekler için eritrosit CR1'in yoğunluğunu hesapladık: turuncu oklar, Konu 1 (ortalama floresan yoğunluğu = 1,334; CR1/E yoğunluğu = 459) ve Özne 2 (ortalama floresan yoğunluğu = 2820; CR1/E yoğunluğu = 1.000). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: İnsan kan örneklerinden eritrosit CR1 yoğunluğunu belirlemek için protokolün akış şeması. İnsan kanı örneği al. Eritrosit elde etmek için santrifüj ile insan kan örneğini yıkayın. Anti-CR1 antikor kullanarak eritrositleri lekele. Bir kalibrasyon eğrisine göre eritrosit CR1 yoğunluğunu belirlemek için akış sitometrisini kullanın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eritrosit CR1 (CR1/E) yoğunluğunu belirlemek için çeşitli teknikler mevcuttur. Kullanılan ilk teknikler anti-CR1 antikorları31 ile kırmızı kan hücrelerinin agglutinasyonu ve C3b32ile kaplanmış eritrosit varlığında rozet oluşumudur. Bu temel teknikler hızla radiolabeled anti-CR1 antikorlar kullanılarak immünboyama yöntemleri ile değiştirildi1,33. Ayrıca enzime bağlı immünosorbent tsay (ELISA)34ile membran ekstrelerinde CR1 konsantrasyonu ölçmek mümkündür. Doğru olmasına rağmen, bu teknikler sadece CR1/E yoğunluğunun ortalama değerini sağlar. CR1/E yoğunluğunun tüm eritrosit popülasyonu üzerinde dağılımı ancak immünboyama sonrası akış sitometrik analizi ile mümkündür. Cr1/E'nin düşük yoğunluklu olması nedeniyle bu teknik zordur. Bununla birlikte, bir amplifikasyon yöntemi artık CR1/E30yoğunluğunu kolayca ölçmeyi mümkün kılmıştır.
Burada, immünolekeli hücrelerin floresan sinyalinin amplifikasyonuna dayalı akış sitometrisi ile CR1/E'yi ölçme yöntemisi siniflenme yöntemini satıyoruz. Amplifikasyon sistemi biyotinylated anti-CR1 monoklonal antikor J3D3 kullanarak boyama dört ardışık katmanları içerir; phycoerythrin-streptavidin; bir biyotinylated keçi anti-streptavidin antikor; ve yine phycoerythrin-streptavidin. J3D3 CR135üç antijenik siteleri tanır , aynı anda birden fazla olmasına rağmen. Biyotinylated keçi anti-streptavidin antikor streptavidin birden fazla epitopya tanır ve biyotin-streptavidin tek başına daha iki streptavidin katmanları arasında daha iyi bir köprü sağlar poliklonal bir antikordur. Bu süreç aynı zamanda phycoerythrin36 yüksek floresan verim ve streptavidin nonspesifik bağlayıcı düşük düzeyde yararlanır37. Bu kadar güçlü bir güçlendirilmiş sinyalile, sitometre fotoçarpan tüplerin düşük ayarları mükemmel doğrusallık sağlar. Mükemmel duyarlılık ve tekrarlanabilirlik ile karakterize olan bu yöntem, 100 CR1/hücreden daha az algılamayı sağlar.
Ancak bu yöntem, eritrosit CR1 yoğunluğu bilinen üç denekten örnekler gerektirir: bir konu düşük düzeyde eritrosit CR1 (180 CR1/E), bir konu orta düzeyde eritrosit CR1 (646 CR1/E) ve yüksek düzeyde eritrosit CR1 (966 CR1/E) ifade eden bir konu ifade eder. Çalışmamızda kullanılan üç deneğin eritrositlerini kullanarak, birkaç bireyin eritrosit CR1 yoğunluğunun ilk ölçümlerini yapmak mümkündür. Cr1 için ölçülecek olan deneklerve deneklerin kan örnekleri aynı anda çekilmeli, buzdolabında 4 °C'de depolanmalıdır ve 4 °C38'dekullanılmalıdır. EDTA tüplerinde çekilen kan kolayca routable ve 4 ° C'de 5 gün boyunca saklanabilir, eritrosit CR1 sayısallaştırma için zaman sağlar. Bundan sonra, eritrosit CR1 yoğunluğu azalmaya başlar ve standart CR1 eğrisi bir çöküş var, özellikle eritrosit CR1 yüksek düzeyde ifade konuya karşılık gelen noktada. Elde edilen regresyon çizgisi bozulduğu için CR1 yoğunluğunun ölçüsü artık doğru değildir. Bu in vitro depolama, kullanım koşulları ve çok katmanlı boyama CR1 kümelenme ve CR1 moleküllerinin sayısının hafif bir aşırı tahmin yol unutulmamalıdır. Bununla birlikte, amplifikasyon sistemi ile J3D3 gibi üç epitops hedefleyen bir anti-CR1 antikor kullanımı, cr1 yoğunluğu39doğru ölçüm sağlayan kümeleme tam olarak yapılmasını sağlar.
Aslında, CR1/E yoğunluğu eritrosit ömrü boyunca azalır40. Bu, aynı bireydeki CR1/E yoğunluğunun heterojenliğini açıklar. Bazı yazarlara göre, CR1 katabolizma yoğunluğu CR1/E41başlangıç yoğunluğu ile ilişkili değildir , diğer yazarlar için ise, daha yüksek ilk yoğunluğu, katabolizma yoğunluğu daha büyük42. ERitrosit yüzeyinde CR1 yarı ömrü 11-32 gün42.
Burada sunulan yöntemin çeşitli avantajları vardır. Birincisi, akış sitometrisi sayesinde aynı kan örneği içinde çalışılacak hücre alt popülasyonlarını seçebilmektir. Geçit fonksiyonu kullanılarak eritrosit popülasyonu seçilerek eritrosit yoğunluğunun ölçülmesi münhasıran garanti edilir. Beyaz kan hücreleri gibi diğer hücresel alt popülasyonların varlığından kaynaklanan eritrosit CR1 ölçümünde bir sapma önlenir. Bu yöntemin ikinci avantajı, yoğunluğu düşük olan diğer hücresel reseptörlerin sayısallaştırılmasına uyarlanabilir olmasıdır. Ayrıca düşük kan ve reaktif hacimleri25,,38gerektiren tüp raflar yerine 96 kuyu plakaları kullanarak uyarlanabilir. Bu yöntemin üçüncü avantajı esnek olmasıdır. Cr1 çok yüksek yoğunluklu hücreler ile ilgili çalışmalarda, örneğin, insan lenfositler (10.000 CR1 / hücre), veya CR1 yoğunluğu 10-100x insanlar (10.000-100.100.000 CR1/hücre)43,44daha büyük olan insan dışı primat eritrositler, amplifikasyon sistemi sayısını azaltmak mümkündür, sadece biyotinylated anti-CR1 monoklonal antikor kullanarak, phycoerythrin-streptavidin veya biyotinylated anti-CR1 monoklonal antikor, biyotinylated anti-fare antikor, ve phycoerythrin-streptavidin, böylece CR1 yüksek yoğunluğu için floresan düzeyi adapte. Bu yöntemin dördüncü avantajı sabit veya dondurulmuş eritrositler için kullanılabilir, kan örnekleri akış sitometri için tesisleri yoksun alanlarda toplanması ve CR138daha sonra doğru niceleme için saklanan sağlayan.
Daha genel olarak, yeni parlak florokromlar ile, artık dolaylı amplifikasyon sistemi kullanmak zorunlu görünüyor. Ayrıca, akış sitometrisi kullanarak hücresel reseptörlerin yoğunluğunu değerlendirmek ve ölçü birimleri (yani ABC veya antikor bağlama kapasitesi) olarak ölçmek için mümkün hale diğer yöntemler vardır. Hücre başına ABC de antikor ve kalibre boncuk doyurucu konsantrasyonları kullanılarak belirlenebilir. Çeşitli ticari sistemler mevcuttur. Bazı kitleri boncuk başına PE bağlı gibi florokrom moleküllerin bilinen düzeylerini içeren önceden kalibre standart boncukvardır. Tek tek hasta örnekleri ile aynı cihaz ayarlarında aynı gün bir akış sitometre üzerinde edinilen boncuklar, floresan geometrik ortalamayı boncukların bilinen PE içeriğiyle karşılaştıran standart bir eğri çizmeyi mümkün kılar. Regresyon analizi, eğim, kesişme ve korelasyon katsayısı belirlenir ve ABC değerleri standart eğri45,46kullanarak hücrelerin ölçülen geometrik ortalama floresan hesaplanır.
Boncuk testinin bir başka türü, parçanın kristalize kısmı (Fc) aracılığıyla spesifik antikor bağlama kapasite düzeylerine sahip boncuklara konjuge bir antikor un bağlanmasına dayanır. Boncuklar, antijen yoğunluğu ölçülecek hücreleri etiketlemek için kullanılan antikorla etiketlenir. Böylece, tek bir deneyde, aynı florofor/protein oranına (F/P oranı) sahip aynı parti hem boncukları hem de hücreleri lekelemek için kullanıldığı sürece, konjuge antikor kullanılabilir47. Bazı kitleri dolaylı immünoffloresan tahlilleri kullanarak akış sitometri hücre yüzeyi antijenlerinin kantitatif belirlenmesi için daha iyidir48,49.
Sonuç olarak, yöntemimiz çok hassas algılama sağlama ve sıradan akış sitometri malzeme üzerinde uygulanması kolay olma avantajı vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
PROTOKOLÜn optimizasyonuna ve doğrulanmasına katkıda bulunan TÜM URCACyt üyelerine, akış sitometri teknik platformuna, İmmünoloji Anabilim Dalı personeline ve İç Hastalıkları ve Geriatri Anabilim Dalı personeline teşekkür ederiz. Bu çalışma Reims Üniversitesi Hastaneleri (hibe numarası AOL11UF9156) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| 1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
| Blouse | protection | ||
| Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
| Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
| Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
| 10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
| Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
| Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman - type M25 - | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
| Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
| powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
| Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
| Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
References
- Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
- Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
- Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
- Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
- Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
- Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
- Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
- Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
- Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
- Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
- Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
- Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
- Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
- Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
- Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
- Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
- Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
- Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
- Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
- Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
- Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
- Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
- Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
- Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
- Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
- Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
- Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
- Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
- Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
- Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
- Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
- Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
- Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
- Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
- Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
- Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
- Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
- Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
- Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
- Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
- Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
- Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
- Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
- Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
- Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).
