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Immunology and Infection

Mesurer le récepteur de complément d’érythrocyte 1 à l’aide de la cytométrie des débits

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/60810
Automatic Translation
1,2, 3, 2,4, 2,4, 2, 5,6
1Oncogeriatric Coordination Unit, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform, University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

Le but de cette méthode est de déterminer la densité CR1 dans les érythrocytes de n’importe quel sujet en comparant avec trois sujets dont la densité érythrocyte CR1 est connue. La méthode utilise la cytométrie de flux après immunostaining des érythrocytes des sujets par un anticorps monoclonal anti-CR1 couplé à un système amplifié utilisant la phycoerythrine (PE).

Abstract

CR1 (CD35, Récepteur de complément de type 1 pour C3b/C4b) est une glycoprotéine à forte membrane de poids moléculaire d’environ 200 kDa qui contrôle l’activation de complément, transporte des complexes immunitaires, et participe à des réponses immunitaires humoristiques et cellulaires. CR1 est présent à la surface de nombreux types de cellules, y compris les érythrocytes, et présente des polymorphismes de longueur, de structure (Knops, ou KN, groupe sanguin) et de densité. La densité moyenne de CR1 par érythrocyte (CR1/E) est de 500 molécules par érythrocyte. Cette densité varie d’un individu à l’autre (100 à 1 200 CR1/E) et d’un érythrocyte à un autre chez le même individu. Nous présentons ici une méthode robuste de cytométrie de flux pour mesurer la densité de CR1/E, y compris dans les sujets exprimant une basse densité, avec l’aide d’un système d’immunostaining amplificateur. Cette méthode nous a permis de montrer l’abaissement de l’expression érythrocyte CR1 dans des maladies telles que la maladie d’Alzheimer (SA), le lupus erythematosus systémique (LE), le sida ou le paludisme.

Introduction

CR1 (récepteur de complément de type 1, CD35) est un 200 kDa transmembrane glycoprotéine présente à la surface de nombreux types de cellules, tels que les érythrocytes1, B lymphocytes2, cellules monocytiques, certaines cellules T, cellules dendritiques folliculaires3, astrocytes foetaux4, et podocy glomerular5tes. CR1 interférant avec ses ligands C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, un sous-unité de la première composante de complément, C1q10 et MBL (lectine mannan-contraignant)11 inhibe l’activation du complément et est impliqué dans la réponse immunitaire humoristique et cellulaire.

Chez les primates, y compris les humains, l’érythrocyte CR1 est impliqué dans le transport de complexes immunitaires vers le foie et la rate, pour purifier le sang et prévenir leur accumulation dans les tissus vulnérables tels que la peau ou les reins12,13,14. Ce phénomène d’adhérence immunitaire entre les complexes immunitaires et les érythrocytes dépend du nombre de molécules CR115. Chez l’homme, la densité moyenne de CR1/E n’est que de 500 (c.-à-d. 500 molécules de CR1 par érythrocyte). Cette densité varie d’un individu à l’autre (100 à 1 200 CR1/E) et d’un érythrocyte à un autre chez le même individu. Certaines personnes de phénotype "null" expriment moins de 20 CR1/E16.

La densité de CR1/E est réglementée par deux allèles autosomiques co-dominants liés à une mutation ponctuelle dans l’intron 27 du codage génétique pour CR1-117,18. Cette mutation produit un site de restriction supplémentaire pour l’enzyme HindIII. Les fragments de restriction obtenus après digestion avec HindIII dans ce cas sont 7,4 kb pour l’allèle lié à une expression forte de CR1 (H: allèle élevé) et 6,9 kb pour l’allèle lié à une faible expression CR1 (L: faible allèle). Ce lien se trouve chez les Caucasiens et les Asiatiques, mais pas chez les personnes d’ascendance africaine19.

Le niveau d’expression de l’érythrocyte CR1 est également corrélé avec la présence de mutations nucléotides ponctuelles dans l’exon 13 codant SCR 10 (I643T) et dans l’encodage exon 19 SCR16 (Q981H). Il est élevé en homozygous 643I/981Q et faible en homozygous 643T/981H individus20. Ainsi, les personnes « faibles » expriment environ 150 CR1/E, les individus « moyens » expriment environ 500 CR1/E, et les individus « élevés » expriment environ 1 000 CR1/E.

En plus de ce polymorphisme de densité érythrocyte, CR1 se caractérise par un polymorphisme de longueur correspondant à quatre allotypes de tailles différentes : CR1-1 (190 kDa), CR1-2 (220 kDa), CR1-3 (160 kDa), et CR1-4 (250 kDa)21 et un polymorphisme antigénique correspondant au groupe sanguin KN22.

Nous présentons notre méthode basée sur la cytométrie d’écoulement pour déterminer la densité de CR1/E. À l’aide de trois sujets dont la densité CR1/E est connue, exprimant un faible niveau de densité (180 CR1/E), un niveau de densité moyenne (646 CR1/E) et un niveau de densité élevée (966 CR1/E), il est facile de mesurer l’intensité moyenne de fluorescence (IMF) de leurs érythrocytes ou globules rouges (RBC), ou RBC MFI, après l’immunodétoïx anti-CR1 à l’aide d’un cytomètre. On peut ensuite tracer une ligne standard représentant l’IMF en fonction de la densité CR1/E. En mesurant l’IMF des sujets dont la densité CR1/E n’est pas connue et en la comparant à cette ligne standard, il est possible de déterminer la densité CR1/E des individus. Cette technique a été utilisée pendant de nombreuses années en laboratoire, et nous a permis de détecter une réduction de l’expression de l’érythrocyte CR1 dans de nombreuses pathologies telles que le lupus erythématosus systémique (LLE)23, syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA)24, paludisme25, et récemment la maladie d’Alzheimer (AD)26,27. Le développement de médicaments ciblant CR1 pour coupler avec des érythrocytes, comme dans le cas des médicaments anti-thrombotiques28 nécessite l’évaluation de la densité CR1/E, et la disponibilité d’une technique robuste pour quantifier CR1.

Le protocole présenté fonctionne en singlicate. Il est adaptable de déterminer la densité de CR1/E sur de nombreuses personnes utilisant des plaques de puits 96 disponibles dans le commerce (voir tableau des matériaux). À cette fin, il est facile d’adapter notre méthode à n’importe quelle plaque de puits 96. Pour chaque échantillon, une suspension cellulaire des érythrocytes (0,5 x 106x 1 x 106 érythrocytes) est distribuée par puits. Pour chaque puits, d’abord l’anticorps anti-CR1 primaire est ajouté, puis streptavidin PE, l’anticorps anti-streptavidine secondaire, et encore une fois streptavidin PE, en utilisant les mêmes dilutions que celles de notre méthode, mais en adaptant les volumes et en respectant la proportionnalité.

Les échantillons de sang provenant de sujets de la gamme et des sujets à quantifier pour LE CR1 doivent être prélevés en même temps, stockés au réfrigérateur à 4 oC et manipulés à 4 oC (sur glace et/ou au réfrigérateur).

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Protocol

Le protocole de collecte et de manipulation du sang humain a été examiné et approuvé par le comité régional d’éthique (RPC Est II), et le numéro de protocole est 2011-A00594-37. Étant donné que le protocole suivant décrit la manipulation du sang humain, les lignes directrices institutionnelles pour l’élimination du matériel biorisque devraient être suivies. L’équipement de sécurité de laboratoire, tel que les blouses de laboratoire et les gants, doit être porté.

1. Lavage d’érythrocyte

REMARQUE : La veille de la manipulation, préparez un tampon PBS-BSA avec saline tampon de phosphate (PBS) contenant 0,15 % de l’albumine de sérum bovin (BSA) et placez-le au réfrigérateur à 4 oC. Ce tampon sera utilisé comme tampon de lavage et comme tampon de dilution.

  1. Pipette 20 mL de PBS-BSA dans un tube de 50 mL.
  2. Aspirer 250 l’acide tétratacétique à l’éthylènediamine de sodium (EDTA) anticoagulé du sang des tubes de stockage du sang et ajouter au tube contenant les 20 ml de PBS-BSA. Fermez le tube en visser le bouchon. Mélanger délicatement en inversant le tube 2x.
  3. Centrifuge le tube pendant 10 min à 4 oC à 430 x g. Retirer et jeter le supernatant à l’aide d’une pipette de 10 ml. Réutilisez la pastille dans le volume résiduel de supernatant par tuyauterie douce et soigneuse.
  4. Ajouter 20 ml de PBS-BSA froid (4 oC) dans le tube contenant la granule. Centrifuge le tube pendant 10 min à 4 oC à 430 x g. Retirer et jeter le supernatant à l’aide d’une pipette de 10 ml.
  5. Ajouter 20 ml de PBS-BSA froid (4 oC) dans le tube contenant la granule. Centrifuge le tube pendant 10 min à 4 oC à 430 x g. Laissez le tube dans la centrifugeuse à 4 oC et allez à la section 2.

2. Dilution d’érythrocyte

  1. Pipette 3 ml de PBS-BSA froid dans un tube de 50 ml et le stocker à 4 oC sur une grille dans la glace.
  2. Placez le tube centrifuge contenant les érythrocytes (étape 1.4) sur une grille placée dans la glace.
  3. Pipette 8 ll d’érythrocytes granulés à l’aide de la pipette et ajouter au tube de 50 ml contenant les 3 ml de PBS-BSA pour obtenir la dilution érythrocyte. Mélanger le tube doucement à la main pour obtenir une suspension cellulaire homogène des érythrocytes.

3. Immunostaining d’érythrocyte

  1. Pipette 100 L de dilution érythrocyte (obtenue à la section 4) et ajouter à 1,4 mL tubes.
  2. Centrifuge les tubes pendant 5 min à 4 oC à 430 x g. Pendant la centrifugation, préparer une dilution d’anticorps anti-CR1 J3D3 biotinylé à une concentration de 0,05 g/L dans le tampon PBS-BSA.
  3. Une fois la centrifugation terminée, retirer et jeter le supernatant.
  4. Ajouter 20 L d’anti-CR1 J3D3 biotinylé directement à la pastille. Pour préparer le contrôle négatif, ajoutez plutôt 20 L de tampon PBS-BSA. Mélanger délicatement les tubes et incuber pendant 45 minutes à 4 oC.
  5. Après 45 min d’incubation, ajouter 750 L de PBS-BSA aux tubes. Centrifuge les tubes pendant 5 min à 4 oC à 430 x g. Retirer et jeter le supernatant. Répéter.
  6. En attendant, préparez une dilution de 1:10 de streptavidin-phycoerythrin dilué dans le tampon PBS-BSA. Pipette 20 L de la dilution de 1:10 de streptavidin-phycoerythrin et ajouter aux tubes. Mélanger délicatement les tubes et incuber pendant 45 minutes à 4 oC.
  7. Ajouter 750 L de tampon PBS-BSA dans les tubes. Bien mélanger et centrifugeuse pendant 5 min à 4 oC à 430 x g. Retirer et jeter le supernatant. Répéter.
  8. Pendant la centrifugation, préparez une dilution de 1:100 d’anticorps anti-streptavidin biotinylé dilués dans le tampon PBS-BSA.
  9. Une fois la centrifugation terminée, retirer et jeter le supernatant.
  10. Pipette 20 L de la dilution de 1:100 de l’anti-streptavidine biotinylé dans les tubes. Mélanger délicatement les tubes. Incuber les tubes pendant 45 min à 4 oC.
  11. Après 45 min d’incubation, pipette 750 L de tampon PBS-BSA et ajouter dans les tubes. Centrifuge les tubes pendant 5 min à 4 oC à 430 x g. Retirer et jeter le supernatant. Répéter.
  12. Pipette 20 L de la dilution de 1:10 de streptavidin-phycoerythrin et ajouter dans les tubes. Mélanger délicatement les tubes. Incuber les tubes pendant 45 min à 4 oC.
  13. Pipette 750 L de tampon PBS-BSA et ajouter dans les tubes. Bien mélanger et centrifuger les tubes pendant 5 min à 4 oC à 430 x g. Retirer et jeter le supernatant. Répétez cette étape 2x.

4. Fixation d’érythrocyte immunostained

  1. Au cours de la dernière centrifugation, préparer le tampon de fixation, une dilution de 1:100 de formaldéhyde de 37% à l’aide du tampon de lavage PBS-BSA.
  2. Pipette 450 L de tampon de fixation et ajouter dans les tubes d’érythrocyte immunostained (de l’étape 3.13) tout en vortexing pour 5 s.
  3. Pipette toutes les cellules fixes dans des tubes de fond ronds de 5 ml et se conservent au réfrigérateur.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici pour un lever jusqu’à 48 h.

5. Analyse de cytométrie d’écoulement des érythrocytes tachés

REMARQUE : Il est conseillé de se référer au manuel de l’opérateur pour le cytomètre (voir tableau des matériaux) pour savoir comment effectuer les lectures cytométriques. Les paramètres suggérés ci-dessous s’appliquent à l’instrument utilisé et doivent être optimisés pour chaque cytomètre.

  1. Allumez le cytomètre d’écoulement, puis allumez l’ordinateur. Laissez la température du système optique se stabiliser en la laissant allumée pendant 30 min. Vérifiez la fenêtre cytomètre du logiciel pour vous assurer que le cytomètre est connecté au poste de travail (le message Cytometer Connected est affiché).
  2. Vérifiez que le conteneur tampon est plein et que le conteneur à déchets est vide. Supprimer les bulles d’air dans le filtre tampon et la ligne tampon à l’aide du système de purge. Primez le système de fluidité en appuyant sur le bouton Prime sur la console du cytomètre. Attendez que le voyant indicateur passe du rouge au vert.
  3. Pour nettoyer les fluides, installez un tube contenant 3 ml d’une solution de nettoyage sur le port d’injection de l’échantillon et laissez la solution de nettoyage fonctionner pendant 5 min avec un débit d’échantillon élevé. Répétez cette opération avec la solution de rinçage avec de l’eau distillée. Laissez le tube contenant de l’eau sur le port d’injection de l’échantillon.
  4. Pour préparer les perles d’étalonnage, pipette 400 L de PBS dans le fond d’un tube rond de fond. Mélanger les stocks de perles fortement en vortexing pour 30 s. Ajouter une goutte au tube rond du bas contenant PBS. Mélanger soigneusement en vortexing pendant 30 s.
  5. Exécutez la vérification des performances. Ouvrez le module de configuration et de suivi du cytomètre dans le logiciel ( figure1A). Vérifiez que la configuration du cytomètre est correcte pour l’expérience à l’aide de l’immunostaining PE. Vérifiez que le lot de perles d’étalonnage est correct avec la configuration.
  6. Installez le tube de perle sur le port d’injection de l’échantillon et laissez-le fonctionner avec un faible débit d’échantillon. Exécutez la vérification des performances, qui prend environ 5 minutes pour terminer). Une fois la vérification des performances terminée, vérifiez que les performances du cytomètre sont satisfaisantes(figure 1B). Fermez le module de configuration et de suivi du cytomètre dans le logiciel.
  7. Pour configurer une expérience et créer des paramètres d’application, cliquez sur le bouton Nouvelle Expérience sur la barre d’outils du navigateur et ouvrez la nouvelle expérience. Spécifier les paramètres en sélectionnant les paramètres de cytomètre appropriés : Diffusion vers l’avant (FSC), Scatter latéral (SSC) et PE du menu déroulant de l’expérience(figure 1C). Sélectionnez le mode linéaire pour le paramètre FSC et le mode Logarithm pour les paramètres SSC et PE.
  8. Dans l’expérience ouverte, sélectionnez Cytometer Paramètres (figure 1D), puis sélectionnez Paramètres d’application, et créez une feuille de travail globale (figure 1E). Utilisez les boîtes grises et les réticules pour guider l’optimisation.
  9. Chargez le tube de commande non conservé sur le cytomètre et exécutez Acquisition. Veiller à ce que la population d’intérêts (c.-à-d. les CR) soit à l’échelle en optimisant les tensions FSC et SSC. Optimiser la valeur seuil FSC pour éliminer les débris sans interférer avec la population d’intérêt.
  10. Dessinez une porte autour des CTC sur le terrain FSC vs SSC. Afficher la population rbc dans la parcelle à points de fluorescence PE. Si nécessaire, augmentez la fluorescence des tensions du tube photomultiplier (PMT) pour placer la population négative dans les boîtes grises. Déchargez le tube de commande non contaminé du cytomètre.
  11. Vérifiez que les populations positives sont à l’échelle. Chargez le tube de commande taché sur le cytomètre et exécutez l’acquisition. Abaissez la tension PMT pour la population positive si elle est hors échelle jusqu’à ce que la population positive peut être vu entièrement sur l’échelle. Déchargez ensuite l’échantillon taché.
  12. Pour enregistrer et analyser des échantillons, sur une nouvelle feuille de travail globale, créez les parcelles suivantes pour prévisualiser les données : 1) FSC vs SSC, et 2) histogram de fluorescence PE. Chargez le premier échantillon sur le cytomètre et exécutez l’acquisition.
  13. Dessinez une porte RBC autour des érythrocytes sur la parcelle FSC vs SSC. Afficher la population de RBC dans l’histogramme de fluorescence PE. De l’avis des statistiques, sélectionnez la moyenne des paramètres de fluorescence PE sur les populations de GR(figure 1F).
  14. Dans le tableau de bord d’acquisition, sélectionnez tous les événements de la porte d’arrêt et 10 000 événements à enregistrer(figure 1G). Cliquez sur Les données d’enregistrement. Lorsque l’enregistrement de l’événement est terminé, retirez le premier tube du cytomètre. Les diagrammes de feuille de travail globaux devraient ressembler à ceux de la figure 2.
  15. Chargez les échantillons suivants et enregistrez-les.

6. Détermination de la densité de l’érythrocyte CR1

  1. Prenez les valeurs des intensités moyennes de fluorescence des échantillons correspondant au sujet « faible »(figure 3, tableau I,RBC MFI), sujet « moyen »(figure 4, tableau D,MFI RBC), sujet « élevé »(figure 4, tableau I,RBC MFI) et à l’échantillon de contrôle négatif(figure 3, tableau I, RBC IMF).
  2. Sur un graphique représentant l’intensité moyenne de fluorescence en fonction de la densité de CR1, placez les quatre points correspondant au contrôle négatif, sujet « faible », sujet « moyen » et sujet « élevé » (points bleus, figure 6).
  3. Dessinez la ligne de régression pour obtenir la ligne d’étalonnage et son équation.
  4. Prenez les valeurs de l’intensité moyenne de fluorescence des échantillons correspondant aux sujets dont la densité doit être déterminée. (Figure 5, Tableaux D et I, RBC MFI).
  5. Obtenez l’équation en remplaçant « Y » en utilisant les valeurs des intensités moyennes de fluorescence, et calculez la densité de CR1/E(figure 6).
  6. Vérifiez sur le graphique que les valeurs d’intensité moyenne de fluorescence et la densité CR1/E déterminée correspondent à un point sur la ligne d’étalonnage(figure 6).

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Representative Results

Les érythrocytes de trois sujets dont la densité de CR1 est connue (sujet « faible » [180 CR1/E], sujet « moyen » [646 CR1/E], et sujet « élevé » [966 CR1/E]), et de deux sujets dont la densité CR1 devait être déterminée étaient immunostained par un anticorps anti-CR1 couplé à un système d’amplification utilisant le fluorochrome de phycoerythrine. Au début, la densité CR1 des sujets de la gamme basse-élevée a été déterminée par la méthode de Scatchard29 utilisant des anticorps radiolacdés. Les normes (basses, moyennes et élevées) déterminées ont été utilisées pour une courbe d’étalonnage et ont permis de quantifier de nouvelles normes ou de qualité inférieures par notre méthode de cytométrie30. Après le passage des érythrocytes immunostained dans le cytomètre de débit, l’intensité de l’étiquetage a été observée et mesurée comme intensité moyenne de fluorescence pour chaque sujet (RBC MFI) (figure 3F,I; Figure 4B,D,F,I; Figure 5B,D,F,I). Une courbe a été tracée en utilisant les valeurs des sujets avec la densité connue de l’érythrocyte CR1 (« bas » à « élevé ») en les signalant comme fonction de l’intensité moyenne de fluorescence. La comparaison de la ligne de régression résultant de cette courbe aux valeurs de l’intensité moyenne de fluorescence des autres sujets a déterminé leur densité CR1/E(figure 6). La figure 7 montre le flux de travail global.

Figure 1
Figure 1 : Console cytomètre et fenêtres apparaissant pendant le protocole de cytométrie d’écoulement. (A) Fenêtre apparaissant après l’application de l’étape 5.5 du protocole. (B) Fenêtre apparaissant après l’application de l’étape 5.6 du protocole. (C) Fenêtre apparaissant après l’application de l’étape 5.7 du protocole. (D) Fenêtre apparaissant après l’application de l’étape 5.8 du protocole. (E) Fenêtre apparaissant après l’application de l’étape 5.8 du protocole. (F) Fenêtre apparaissant après l’application de l’étape 5.13 du protocole. (G) Fenêtre apparaissant après l’application de l’étape 5.14 du protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Aspect des objets d’analyse de feuille de travail globaux. Apparition des objets d’analyse de feuille de travail globaux après l’application de l’étape 5.14 du protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Résultats de l’analyse de cytométrie d’écoulement de l’immunostaining anti-CR1 des érythrocytes correspondant au contrôle négatif et au sujet de la gamme (sujet bas ») qui a exprimé la densité LOW CR1 (180 CR1/E). Pour chaque sujet: (A,E) une tache de point montrant l’apparition d’événements acquis en fonction de la taille et les paramètres de granulometry, (G) la porte sélectionnant la population érythrocyte parmi les événements, (B,F) un histogramme représentant l’intensité de l’étiquetage, (C,H) un tableau statistique associé présentant le nombre d’événements correspondant aux érythrocytes et leur pourcentage, (D,I) un tableau associé donnant l’intensité moyenne de fluorescence (RBC MFI). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Résultats de l’analyse de cytométrie d’écoulement de l’immunostaining anti-CR1 des érythrocytes correspondant aux sujets de la gamme : sujet « moyen » qui a exprimé la densité DE CR1 MEDIUM (646 CR1/E) et le sujet « élevé » qui a exprimé la densité DE HIGH CR1 (966 CR1/E). Pour chaque sujet: (A, E) une tache de point montrant l’apparition d’événements acquis en fonction de la taille et les paramètres de granulometry, (G) la porte sélectionnant la population érythrocyte parmi les événements, (B, F) un histogramme représentant l’intensité de l’étiquetage, (C, H) un tableau statistique associé présentant le nombre d’événements correspondant aux érythrocytes et leur pourcentage, (D, I) un tableau associé donnant l’intensité moyenne de fluorescence (RBC MFI). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Résultats de l’analyse de cytométrie d’écoulement de l’immunostaining anti-CR1 des érythrocytes correspondant aux sujets dont la densité de CR1 devait être déterminée. Pour chaque sujet: (A, E) une tache de point montrant l’apparition d’événements acquis en fonction de la taille et les paramètres de granulometry, (G) la porte sélectionnant la population érythrocyte parmi les événements, (B, F) un histogramme représentant l’intensité de l’étiquetage, (C, H) un tableau statistique associé présentant le nombre d’événements correspondant aux érythrocytes et leur pourcentage, (D, I) un tableau associé donnant l’intensité moyenne de fluorescence (RBC MFI). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Courbe d’étalonnage et ligne de régression permettant la détermination de la densité CR1. (A), (B) Courbe de calomnification et ligne de régression tracée en fonction de la densité CR1 connue des sujets de gamme (contrôle négatif : 0 CR1, sujet « faible » [180 CR1/E], sujet « moyen » [646 CR1/E], et sujet « élevé » [966 CR1/E]) et leurs valeurs respectives d’intensité de fluorescence moyenne obtenue par cytométrie de flux. (C), (D) De l’équation de cette ligne de régression, nous avons calculé la densité de l’érythrocyte CR1 pour les sujets dont l’intensité moyenne de fluorescence a été quantifiée par cytométrie de flux : flèches orange, sujet 1 (intensité moyenne de fluorescence - 1 334 ; Densité CR1/E 459) et Sujet 2 (intensité moyenne de fluorescence 2820; Densité CR1/E de 1 000). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Flowchart du protocole pour déterminer la densité érythrocyte CR1 des échantillons de sang humain. Recueillir un échantillon de sang humain. Laver l’échantillon de sang humain par centrifugation pour obtenir des érythrocytes. Tacher les érythrocytes à l’aide d’un anticorps anti-CR1. Utilisez la cytométrie d’écoulement pour déterminer la densité érythrocyte CR1 selon une courbe d’étalonnage. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Plusieurs techniques sont disponibles pour déterminer la densité de l’érythrocyte CR1 (CR1/E). Les premières techniques utilisées étaient l’agglutination des globules rouges par les anticorps anti-CR131 et la formation de rosettes en présence d’érythrocytes enduits de C3b32. Ces techniques rudimentaires ont été rapidement remplacées par des méthodes d’immunostaining à l’aide d’anticorps anti-CR1 radiolactés1,33. Il est également possible de mesurer la concentration de CR1 dans les extraits de membrane par l’essai immunosorbent lié aux enzymes (ELISA)34. Bien qu’elles soient exactes, ces techniques ne fournissent qu’une valeur moyenne de la densité CR1/E. La répartition de la densité CR1/E sur l’ensemble de la population érythrocyte n’est disponible que par analyse cytométrique de débit après immunostaining. Cette technique est difficile en raison de la faible densité de CR1/E. Néanmoins, une méthode d’amplification permet désormais de mesurer facilement la densité de CR1/E30.

Ici, nous présentons une méthode de quantification cr1/E par cytométrie d’écoulement basée sur l’amplification du signal de fluorescence des cellules immunostained. Le système d’amplification implique quatre couches successives de coloration à l’aide de l’anticorps monoclonal biotinylé anti-CR1 J3D3; phycoerythrine-streptavidine; un anticorps anti-streptavidine de chèvre biotinylé; et encore une fois phycoerythrin-streptavidin. J3D3 reconnaît trois sites antigéniques sur CR135, mais pas plus d’un en même temps. L’anticorps anti-streptavidine de chèvre biotinylé est un anticorps polyclonal qui reconnaît les épitopes multiples sur la streptavidine et fournit un meilleur pont entre les deux couches de streptavidin que la biotin-streptavidin seule. Ce processus bénéficie également du rendement élevé de fluorescence de la phycoerythrine36 et du faible niveau de liaison non spécifique de la streptavidine37. Avec un signal amplifié aussi fort, les réglages bas des tubes de photomultiplier cytomètres permettent une linéarité parfaite. Cette méthode, caractérisée par une excellente sensibilité et reproductibilité, permet la détection de moins de 100 CR1/cellule.

Cependant, cette méthode nécessite des échantillons de trois sujets dont la densité de l’érythrocyte CR1 est connue : un sujet exprimant un faible niveau d’érythrocyte CR1 (180 CR1/E), un sujet exprimant un niveau moyen d’érythrocyte CR1 (646 CR1/E) et un sujet exprimant un niveau élevé d’érythrocyte CR1 (966 CR1/E). Il est possible de prendre les premières mesures de la densité érythrocyte CR1 de plusieurs individus, d’abord en utilisant les érythrocytes des trois sujets utilisés dans notre étude, que nous pouvons fournir. Les échantillons de sang provenant de sujets de la gamme et les sujets à quantifier pour CR1 doivent être prélevés en même temps, stockés au réfrigérateur à 4 oC et manipulés à 4 oC38. Le sang prélevé dans les tubes EDTA est facilement routable et peut être stocké pendant 5 jours à 4 oC, ce qui laisse le temps de quantifier l’érythrocyte CR1. Après cela, la densité de l’érythrocyte CR1 commence à diminuer, et il ya un effondrement de la courbe CR1 standard, en particulier au point correspondant au sujet exprimant un niveau élevé d’érythrocyte CR1. Étant donné que la ligne de régression qui en résulte est déformée, la mesure de la densité CR1 n’est plus exacte. Il convient de noter que le stockage in vitro, les conditions de manipulation, et la coloration multicouches conduisent à l’amas de CR1 et une légère surestimation du nombre de molécules CR1. Néanmoins, l’utilisation d’un anticorps anti-CR1 ciblant trois épitopes tels que J3D3 avec le système d’amplification permet d’effectuer un clustering complet, ce qui permet de mesurer correctement la densité CR139.

En fait, la densité de CR1/E diminue au cours de la durée de vie de l’érythrocyte40. Cela expliquerait l’hétérogénéité de la densité de CR1/E chez le même individu. Selon certains auteurs, l’intensité du catabolisme de CR1 n’est pas corrélée avec la densité initiale de CR1/E41, tandis que pour d’autres auteurs, plus la densité initiale est élevée, plus l’intensité du catabolisme42est grande. La demi-vie de CR1 à la surface des érythrocytes est de 11 à 32 jours42.

La méthode présentée ici présente plusieurs avantages. La première est de pouvoir sélectionner, grâce à la cytométrie des débits, les sous-populations cellulaires à étudier dans le même échantillon de sang. En sélectionnant la population érythrocyte à l’aide de la fonction de la porte, la mesure de la densité érythrocyte est garantie exclusivement. Un biais dans la mesure de l’érythrocyte CR1 causé par la présence d’autres sous-populations cellulaires telles que les globules blancs est évité. Le deuxième avantage de cette méthode est qu’elle est adaptable à la quantification d’autres récepteurs cellulaires dont la densité est faible en remplaçant simplement l’anticorps anti-CR1 primaire par un anticorps spécifiquement dirigé contre une épitope du récepteur à étudier. Il est également adaptable à l’utilisation de 96 plaques de puits au lieu de grilles à tube, ce qui nécessite des volumes de sang et de réactifsinférieurs 25,38. Le troisième avantage de cette méthode est qu’elle est flexible. Dans les études sur les cellules à très forte densité de CR1, par exemple, les lymphocytes humains (10 000 CR1/cellule), ou érythrocytes primates non humains dont la densité CR1 est de 10 à 100 fois supérieure à celle des humains (10 000 à 100 000 CR1/cellule)43,44,il est possible de diminuer le nombre de couches de système d’amplification, à l’aide d’anticorps monoclonal biotinylés anti-CR1, de phycoerythrine-streptavidine ou d’anticorps monoclonal anti-CR1 biotinylés, anticorps anticon souris biotinylés, et phycoerythrine-streptavidine, adaptant ainsi le niveau de fluorescence à la densité plus élevée de CR1. Le quatrième avantage de cette méthode est qu’elle peut être utilisée pour les érythrocytes fixes ou congelés, permettant aux échantillons de sang d’être prélevés dans les zones dépourvues des installations de cytométrie des débits et stockés pour la quantification précise ultérieure de CR138.

Plus généralement, avec les nouveaux fluorochromes plus lumineux, il ne semble plus obligatoire d’utiliser le système d’amplification indirecte. En outre, il existe d’autres méthodes utilisant la cytométrie du débit qui permettent d’évaluer la densité des récepteurs cellulaires et de la quantifier en unités de mesure (c.-à-d. ABC, ou capacité de liaison d’anticorps). L’ABC par cellule peut également être déterminée à l’aide de concentrations saturantes d’anticorps et de perles calibrées. Plusieurs systèmes commerciaux sont disponibles. Certains kits sont des perles standard précalibrées contenant des niveaux connus de molécules fluorochromes telles que PE lié par perle. Les perles acquises sur un cytomètre de débit le même jour aux mêmes réglages d’instrument que les spécimens individuels de patients permettent de dessiner une courbe standard comparant la moyenne géométrique de fluorescence à la teneur connue en PE des perles. L’analyse de régression, la pente, l’interception et le coefficient de corrélation sont déterminés, et les valeurs ABC sont calculées à partir de la fluorescence moyenne mesurée des cellules utilisant la courbe standard45,46.

Un autre type de test de perle est basé sur la liaison d’un anticorps conjugué aux perles avec des niveaux spécifiques de capacité de liaison d’anticorps via la partie cristallizable du fragment (Fc). Les perles sont étiquetées avec le même anticorps utilisé pour étiqueter les cellules dont la densité d’antigène doit être mesurée. Ainsi, dans une seule expérience, tout anticorps conjugué peut être utilisé, tant que le même lot avec le même rapport fluorophore/protéine (rapport F/P) est utilisé pour tacher les perles et les cellules47. Certains kits sont meilleurs pour la détermination quantitative des antigènes de surface cellulaire par cytométrie de flux utilisant des essais d’immunofluorescence indirecte48,49.

En conclusion, notre méthode a l’avantage de fournir une détection très sensible et d’être facile à mettre en œuvre sur le matériau de cytométrie de débit ordinaire.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions tous les membres de l’URCACyt, la plate-forme technique de cytométrie des flux, le personnel du Département d’immunologie, et le personnel du Département de médecine interne et de gériatrie, qui ont contribué à l’optimisation et à la validation du protocole. Ces travaux ont été financés par les Hôpitaux Universitaires de Reims (numéro de subvention AOL11UF9156).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook immunostaining
Blouse protection
Bovin serum albumin (7,5%) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 15260037 cytometry
Centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 11176917 centrifugation
Clean Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340345 cytometry
Comorack-96 Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 944060P rack
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 655051 cytometry
Formaldehyde solution 36.5 % Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France F8775-25ML Fixation
10 µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
LSRFORTESSA Flow Cytometer BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 647788 cytometry
Microman Capillary Pistons Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 067494 sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubes Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath MP32051 mix
Micropipette Microman - type M25 - Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 066379 sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10010031 cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mL Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 391952 sample pipetting
powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
Rinse Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340346 cytometry
Round bottom tube Sarstedt, F-70150 Marnay, France 55.1579 cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
streptavidin R-PE Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France AS-60669 immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mL Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10203001 mix
Vector anti streptavidin biotin Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France BA-0500 immunostaining
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix

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Immunologie et infection Numéro 159 CR1 CD35 récepteur de complément C3b/C4b polymorphisme de densité DE CR1 cytométrie de flux maladie d’Alzheimer lupus erythématosus systémique paludisme
Mesurer le récepteur de complément d’érythrocyte 1 à l’aide de la cytométrie des débits
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Kisserli, A., Audonnet, S., Duret,… More

Kisserli, A., Audonnet, S., Duret, V., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Mahmoudi, R. Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e60810, doi:10.3791/60810 (2020).

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