Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Måle Erytrocytt Komplement reseptor 1 ved hjelp av flow cytometri

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/60810
Automatic Translation
1,2, 3, 2,4, 2,4, 2, 5,6
1Oncogeriatric Coordination Unit, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform, University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

Målet med denne metoden er å bestemme CR1 tetthet i erytrocytter av ethvert emne ved å sammenligne med tre hvis erytrocytt CR1 tetthet er kjent. Metoden bruker flow cytometri etter immunfarging av forsøkspersonenes erytrocytter av et anti-CR1 monoklonalt antistoff koblet til et forsterket system ved hjelp av phycoerythrin (PE).

Abstract

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) er en høy molekylvekt membran glykoprotein på ca 200 kDa som styrer komplement aktivering, transporterer immunkomplekser, og deltar i humoral og cellulær immunresponser. CR1 er til stede på overflaten av mange celletyper, inkludert erytrocytter, og viser polymorfismer i lengde, struktur (Knops, eller KN, blodgruppe) og tetthet. Den gjennomsnittlige tettheten av CR1 per erytrocytt (CR1/E) er 500 molekyler per erytrocytt. Denne tettheten varierer fra ett individ til en annen (100–1200 CR1/E) og fra en erytrocytt til en annen i samme person. Vi presenterer her en robust flytcytometrimetode for å måle tettheten av CR1/E, inkludert hos personer som uttrykker lav tetthet, ved hjelp av et forsterkende immunfargingssystem. Denne metoden har gjort oss i stand til å vise senking av CR1 erytrocytt uttrykk i sykdommer som Alzheimers sykdom (AD), systemisk lupus erythematosus (SLE), AIDS, eller malaria.

Introduction

CR1 (komplement reseptor type 1, CD35) er en 200 kDa transmembrane glykoprotein tilstede på overflaten av mange celletyper, for eksempel erytrocytter1, B lymfocytter2, monocytiske celler, noen T-celler, follikulære dendrittiske celler3, fosterastrocytter4, og glomerulære podocytes5. CR1 forstyrrer sin ligands C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, en underenhet av den første komplementkomponenten, C1q10 og MBL (mannanbindende lectin)11 hemmer aktiveringen av komplement og er involvert i humoral og cellulær immunrespons.

I primater, inkludert mennesker, erytrocytt CR1 involvert i transport av immunkomplekser til lever en og milt, for å rense blodet og forhindre akkumulering i sårbare vev som hud eller nyrer12,13,14. Dette fenomenet immunvedhesjon mellom immunkomplekser og erytrocytter avhenger av antall CR1 molekyler15. Hos mennesker er gjennomsnittlig tetthet av CR1/E bare 500 (dvs. 500 molekyler av CR1 per erytrocytt). Denne tettheten varierer fra ett individ til en annen (100–1200 CR1/E) og fra en erytrocytt til en annen i samme person. Noen individer av "null" fenotype uttrykker færre enn 20 CR1/E16.

Tettheten av CR1/E reguleres av to co-dominerende autosomale alleler knyttet til en punktmutasjon i intron 27 av genkodingen for CR1 * 117,18. Denne mutasjonen gir et ekstra restriksjonssted for HindIII-enzymet. Begrensningsfragmentene oppnådd etter fordøyelsen med HindIII i dette tilfellet er 7,4 kb for allelen knyttet til et sterkt uttrykk for CR1 (H: høy allele) og 6,9 kb for allelen knyttet til lavt CR1-uttrykk (L: lav allele). Denne linken finnes i kaukasiere og asiater, men ikke hos personer av afrikansk avstamning19.

Uttrykket av erytrocytt CR1 er også korrelert med tilstedeværelsen av punkt nukleotid mutasjoner i exon 13 koding SCR 10 (I643T) og i exon 19 koding SCR16 (Q981H). Det er høyt i homozygot 643I/981Q og lav i homozygot 643T/981H individer20. Dermed uttrykker "lave" individer rundt 150 CR1 / E, "medium" individer uttrykker rundt 500 CR1 / E, og "høye" individer uttrykker rundt 1000 CR1 / E.

I tillegg til denne erytrocytttettheten polymorfisme, er CR1 preget av en lengde polymorfisme som tilsvarer fire allotyper av forskjellige størrelser: CR1* 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), og CR1 * 4 (250 kDa)21 og en antigen polymorfisme tilsvarende blodgruppen KN22.

Vi presenterer vår metode basert på flow cytometri for å bestemme tettheten av CR1 /E. Ved hjelp av tre med CR1/E tetthet er kjent, uttrykker et lavt tetthetsnivå (180 CR1/E), et middels tetthetsnivå (646 CR1/E) og et høyt tetthetsnivå (966 CR1/E), er det lett å måle gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av deres erytrocytter eller røde blodlegemer (RBC), eller RBC MFI, etter anti-CR1 immunfarging ved hjelp av et strømningscytometer. Man kan deretter tegne en standardlinje som representerer MFI som en funksjon av CR1/E-tetthet. Måling av MFI av personer med CR1/E tetthet ikke er kjent og sammenligne den med denne standardlinjen, er det mulig å bestemme individets CR1/E tetthet. Denne teknikken har blitt brukt i mange år i laboratoriet, og har gjort oss i stand til å oppdage en reduksjon i uttrykket av erytrocytt CR1 i mange patologier som systemisk lupus erythematosus (SLE)23, Ervervet immunsvikt syndrom (AIDS)24, malaria25, og nylig Alzheimers sykdom (AD)26,27. Utviklingen av legemidler rettet mot CR1 til par med erytrocytter, som i tilfelle av antitrombotiske legemidler28 krever evaluering av CR1 / E tetthet, og tilgjengeligheten av en robust teknikk for å kvantifisere CR1.

Protokollen som presenteres går i singlicate. Det kan tilpasses til å bestemme tettheten av CR1/E på mange personer som bruker spesifikke kommersielt tilgjengelige 96 brønnplater (se Materialtabellen). For dette formål er det lett å tilpasse vår metode til en hvilken som helst 96 brønnplate. For hver prøve fordeles en cellesuspensjon av erytrocytter (0,5 x 106–1 x 106 erytrocytter) per brønn. For hver brønn, først den primære anti-CR1 antistoff legges til, deretter streptavidin PE, sekundær anti-streptavidin antistoff, og igjen streptavidin PE, ved hjelp av de samme fortynninger som de av vår metode, men ved å tilpasse volumer og respektere proporsjonalitet.

Blodprøvene fra personer i området og fra forsøkspersoner som skal kvantifiseres for CR1 skal trekkes samtidig, oppbevares i kjøleskapet ved 4 °C, og håndteres ved 4 °C (på is og/eller i kjøleskapet).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen for innsamling og håndtering av menneskelig blod ble gjennomgått og godkjent av den regionale etikkkomiteen (CPP Est II), og protokollnummeret er 2011-A00594-37. Fordi følgende protokoll beskriver håndteringen av menneskelig blod, bør institusjonelle retningslinjer for avhending av biologisk farlig materiale følges. Laboratoriesikkerhetsutstyr, som laboratoriefrakker og hansker, bør brukes.

1. Erytrocyttvask

MERK: Dagen før håndtering, klargjør en PBS-BSA-buffer med fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder 0,15 % av storfeserumalbumin (BSA) og plasser den i kjøleskapet ved 4 °C. Denne bufferen vil bli brukt som en vaskebuffer og som en fortynningsbuffer.

  1. Pipette 20 ml PBS-BSA i et 50 ml rør.
  2. Aspirer 250 μL natriumetylendiamin tetraeddiksyre (EDTA) antikoagulert fullblod fra blodlagringsrør og legg til røret som inneholder 20 ml PBS-BSA. Lukk røret ved å skru hetten. Bland forsiktig ved å snu røret 2x.
  3. Sentrifuge røret i 10 min ved 4 °C ved 430 x g. Fjern og kast supernatanten med en 10 ml pipette. Resuspendpelleten i det gjenværende volumet av supernatant ved skånsom og forsiktig pipettering.
  4. Tilsett 20 ml kald PBS-BSA (4 °C) i røret som inneholder pelleten. Sentrifuge røret i 10 min ved 4 °C ved 430 x g. Fjern og kast supernatanten med en 10 ml pipette.
  5. Tilsett 20 ml kald PBS-BSA (4 °C) i røret som inneholder pelleten. Sentrifuge røret i 10 min ved 4 °C ved 430 x g. La røret stå i sentrifugen ved 4 °C og gå til avsnitt 2.

2. Erytrocyttfortynning

  1. Pipette 3 ml kald PBS-BSA i et 50 ml rør og oppbevar den ved 4 °C på et stativ i is.
  2. Sett sentrifugertrøret som inneholder erytrocytter (trinn 1.4) på et stativ plassert i is.
  3. Pipette 8 μL pelleted erytrocytter ved hjelp av pipetten og legg til 50 ml rør som inneholder 3 ml PBS-BSA for å oppnå erytrocyttfortynning. Bland røret forsiktig for hånd for å oppnå en homogen cellesuspensjon av erytrocytter.

3. Erytrocytt immunfarging

  1. Pipette 100 μL erytrocyttfortynning (innhentet i avsnitt 4) og tilsett 1,4 ml rør.
  2. Sentrifugerrørene i 5 min ved 4 °C ved 430 x g. Under sentrifugering, forberede en fortynning av biotinylated anti-CR1 J3D3 antistoff med en konsentrasjon på 0,05 μg / μL i PBS-BSA buffer.
  3. Når sentrifugeringen er ferdig, fjern og kast supernatanten.
  4. Tilsett 20 μL biotinylated anti-CR1 J3D3 direkte til pellet. For å klargjøre den negative kontrollen, legg til 20 μL av PBS-BSA-buffer i stedet. Bland rørene forsiktig og inkuber i 45 min ved 4 °C.
  5. Etter 45 min inkubasjon, tilsett 750 μL PBS-BSA til rørene. Sentrifugerrørene i 5 min ved 4 °C ved 430 x g. Fjern og kast supernatanten. Gjenta.
  6. I mellomtiden, forberede en 1:10 fortynning av streptavidin-phycoerythrin fortynnet i PBS-BSA buffer. Pipette 20 μL av 1:10 fortynning av streptavidin-phycoerythrin og legg til rørene. Bland rørene forsiktig og inkuber i 45 min ved 4 °C.
  7. Tilsett 750 μL PBS-BSA-buffer i rørene. Bland godt og sentrifuge i 5 min ved 4 °C ved 430 x g. Fjern og kast supernatanten. Gjenta.
  8. Under sentrifugering, forberede en 1:100 fortynning av biotinylated anti-streptavidin antistoff fortynnet i PBS-BSA buffer.
  9. Når sentrifugeringen er ferdig, fjern og kast supernatanten.
  10. Pipette 20 μL av 1:100 fortynning av biotinylated anti-streptavidin inn i rørene. Bland rørene forsiktig. Inkuber rørene i 45 min ved 4 °C.
  11. Etter 45 minutter inkubasjon, pipette 750 μL PBS-BSA buffer og tilsett i rørene. Sentrifugerrørene i 5 min ved 4 °C ved 430 x g. Fjern og kast supernatanten. Gjenta.
  12. Pipette 20 μL av 1:10 fortynning av streptavidin-phycoerythrin og legg i rørene. Bland rørene forsiktig. Inkuber rørene i 45 min ved 4 °C.
  13. Pipette 750 μL PBS-BSA buffer og legg til i rørene. Bland godt og sentrifuger rørene i 5 min ved 4 °C ved 430 x g. Fjern og kast supernatanten. Gjenta dette trinnet 2x.

4. Immunfarget erytrocytt fiksering

  1. Under den siste sentrifugeringen, forberede fikseringsbufferen, en 1:100 fortynning på 37% formaldehyd ved hjelp av vaskebufferen PBS-BSA.
  2. Pipette 450 μL fikseringsbuffer og tilsett immunfargede erytrocyttrør (fra trinn 3.13) mens du vortexing i 5 s.
  3. Pipette alle faste celler i 5 ml runde bunnrør og oppbevar i kjøleskapet.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her i opptil 48 timer.

5. Flow cytometri analyse av farget erytrocytter

MERK: Det anbefales å se bruksanvisningen for cytometeret (se materialtabellen) for å vite hvordan du utfører cytometriske avlesninger. De foreslåtte parametrene nedenfor gjelder for instrumentet som brukes og må optimaliseres for hvert cytometer.

  1. Slå på flytcytometeret, og slå deretter på datamaskinen. La den optiske systemtemperaturen stabilisere seg ved å la den stå på i 30 min. Kontroller cytometervinduet i programvaren for å sikre at cytometeret er koblet til arbeidsstasjonen (meldingen Cytometer Connected vises).
  2. Kontroller at bufferbeholderen er full og at avfallsbeholderen er tom. Fjern luftbobler i bufferfilteret og bufferlinjen ved hjelp av rensesystemet. Prime fluidics-systemet ved å trykke på Prime-knappen på konsollen på cytometeret. Vent til indikatorlampen endres fra rødt til grønt.
  3. For å rengjøre fluidics, installere et rør som inneholder 3 ml av en rengjøringsløsning på prøveinjeksjonsporten og la rengjøringsløsningen kjøre i 5 min med høy prøvestrømningshastighet. Gjenta dette med skylleoppløsningen med destillert vann. La røret inneholde vann på prøveinjeksjonsporten.
  4. For å forberede de kalibrerende perlene, pipette 400 μL PBS i bunnen av et rundt bunnrør. Bland perlebestandene sterkt ved å vortexing for 30 s. Legg til en dråpe til det runde bunnrøret som inneholder PBS. Bland forsiktig ved å vortexing i 30 s.
  5. Kjør ytelseskontrollen. Åpne cytometeroppsett- og sporingsmodulen i programvaren (figur 1A). Kontroller at cytometerkonfigurasjonen er riktig for eksperimentet ved hjelp av PE-immunfarging. Kontroller at den kalibrerende perlebatchen er riktig med konfigurasjonen.
  6. Installer perlerøret på prøveinjeksjonsporten og la det kjøre med en lav samplingsstrømningshastighet. Kjør ytelseskontrollen, som tar ca. 5 min å fullføre). Når ytelseskontrollen er fullført, må du kontrollere at cytometerytelsen er tilfredsstillende (figur 1B). Lukk cytometeroppsett- og sporingsmodulen i programvaren.
  7. Hvis du vil konfigurere et eksperiment og opprette programinnstillinger, klikker du Nytt eksperiment-knappen på verktøylinjen i nettleseren og åpner det nye eksperimentet. Angi parameterne ved å velge passende cytometerinnstillinger: Forward Scatter (FSC), Side Scatter (SSC) og PE fra rullegardinmenyen for eksperimentet (Figur 1C). Velg Lineær modus for FSC-parameter- og logaritmmodus for Parametere for SSC og PE.
  8. I det åpne eksperimentet velger du Cytometer Innstillinger (Figur 1D), velger deretter Programinnstillingerog oppretter et globalt regneark (Figur 1E). Bruk de grå boksene og trådkorset til å veilede optimaliseringen.
  9. Legg det ufargede kontrollrøret på cytometeret og kjør Acquisition. Sørg for at befolkningen av interesse (dvs. RBCer) er i stor skala ved å optimalisere FSC- og SSC-spenningene. Optimaliser FSC-terskelverdien for å eliminere rusk uten å forstyrre befolkningen av interesse.
  10. Tegn en port rundt RbCene på FSC vs. SSC-plottet. Vis RBC-populasjonen i punktplottet til PE-fluorescens. Hvis det er nødvendig, øk fluorescensen til fotomultiplikatorrøret (PMT) spenninger for å plassere den negative populasjonen i de grå boksene. Loss det ufargede kontrollrøret fra cytometeret.
  11. Kontroller at de positive populasjonene er i stor skala. Legg det beisede kontrollrøret på cytometeret og kjør oppkjøp. Senk PMT-spenningen for den positive befolkningen hvis den er av skala til den positive befolkningen kan sees helt i stor skala. Deretter losser du den beisede prøven.
  12. Hvis du vil registrere og analysere eksempler, oppretter du følgende tegneplaner i et nytt globalt regneark for å forhåndsvise dataene: 1) FSC vs. SSC og 2) PE-fluorescenshistogram. Last den første prøven på cytometeret og kjør Anskaffelse.
  13. Tegn en RBC-port rundt erytrocytter på FSC vs. SSC-plottet. Vis RBC-populasjonen i PE-fluorescenshistogramet. I Statistikk-visningen velger du gjennomsnittet for PE-fluorescensparametere på GR-populasjoner (figur 1F).
  14. I instrumentbordet for anskaffelse velger du alle hendelser i stoppeporten og 10 000 hendelser som skal registreres (Figur 1G). Klikk Postdata. Når hendelsesopptaket er fullført, fjerner du det første røret fra cytometeret. De globale regnearkplottene skal se ut som de i figur 2.
  15. Last inn følgende eksempler og ta dem opp.

6. Bestemmelse av tettheten av erytrocytt CR1

  1. Ta verdiene av gjennomsnittlig fluorescensintensitet av prøvene som tilsvarer det "lave" motivet (Figur 3, Tabell I, RBC MFI), "medium" emne ( Figur4, Tabell D, RBC MFI), "høy" motiv ( Figur4, Tabell I, RBC MFI) og til negativ kontrollprøve ( Figur3, Tabell I, RBC MFI).
  2. På en graf som representerer gjennomsnittlig fluorescensintensitet som en funksjon av tettheten av CR1, plasser de fire punktene som tilsvarer den negative kontrollen, "lavt" motiv, "middels" motiv og "høy" motiv (blå punkter, figur 6).
  3. Tegn regresjonslinjen for å få kalibreringslinjen og ligningen.
  4. Ta verdiene av gjennomsnittlig fluorescensintensitet av prøvene som tilsvarer forsøkspersonene hvis tetthet skal bestemmes. (Figur 5, Tabell D og Jeg, RBC MFI).
  5. Få ligningen ved å erstatte "Y" ved hjelp av verdiene til gjennomsnittlig fluorescensintensitet, og beregn tettheten av CR1/E (figur 6).
  6. Kontroller grafen at gjennomsnittlige verdier for fluorescensintensitet og den bestemte CR1/E-tettheten tilsvarer et punkt på kalibreringslinjen (figur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Erytrocytter av tre forsøkspersoner hvis tetthet av CR1 er kjent ("lav" subjekt [180 CR1/E], "medium" subjektet [646 CR1/E], og "høy" motiv [966 CR1/E]), og av to personer hvis CR1 tetthet måtte bestemmes ble immunisert av et anti-CR1 antistoff koblet til et forsterkningssystem ved hjelp av fycoerythrinfluorochrome. I begynnelsen ble CR1-tettheten til forsøkspersonene fra det lave høyområdet bestemt av Scatchard-metoden29 ved hjelp av radiomerkede antistoffer. Standardene (lav, middels og høy) bestemt ble brukt for en kalibreringskurve og gjorde det mulig å kvantifisere nye standarder eller understandarder ved vår metode for cytometri30. Etter passering av immunfargede erytrocytter i strømningscytometeret ble intensiteten av merkingen observert og målt som gjennomsnittlig fluorescensintensitet for hvert emne (RBC MFI) (Figur 3F,I; Figur 4B,D,F,I; Figur 5B,D,F,I). En kurve ble plottet ved hjelp av verdiene til forsøkspersonene med den kjente tettheten av erytrocytt CR1 ("lav" til "høy") ved å rapportere dem som en funksjon av gjennomsnittlig fluorescensintensitet. Sammenligning av regresjonslinjen som følge av denne kurven til verdiene av gjennomsnittlig fluorescensintensitet hos de andre forsøkspersonene fastslått deres CR1/E-tetthet (figur 6). Figur 7 viser den generelle arbeidsflyten.

Figure 1
Figur 1: Cytometer konsoll og vinduer vises under flyt cytometri protokollen. (A) Vindu vises etter bruk av trinn 5.5 i protokollen. (B) Vinduet vises etter bruk av trinn 5.6 i protokollen. (C) Vinduet vises etter bruk av trinn 5.7 i protokollen. (D) Vinduet vises etter bruk av trinn 5.8 i protokollen. (E) Vinduet vises etter bruk av trinn 5.8 i protokollen. (F) Vinduet vises etter bruk av trinn 5.13 i protokollen. (G) Vinduet vises etter bruk av trinn 5.14 i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Utseendet til de globale regnearkanalyseobjektene. Utseendet til de globale regnearkanalyseobjektene etter bruk av trinn 5.14 i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Resultater av flow cytometrianalyse av anti-CR1 immunfarging av erytrocytter som tilsvarer negativ kontroll og til motivet fra området ("lavt" emne) som uttrykte LAV CR1 tetthet (180 CR1 / E). For hvert emne: (A,E) en dot blot som viser utseendet på hendelser ervervet i henhold til størrelse og granulometry parametere,(G) porten som velger erytrocyttpopulasjonen blant hendelsene, (B,F) et histogrammet som representerer intensiteten av merkingen, (C,H) en tilhørende statistisk tabell som presenterer antall hendelser som tilsvarer erytrocytter og deres prosentandel, (D,I) en tilknyttet tabell som gir gjennomsnittlig fluorescensintensitet (RBC MFI). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Resultater av flow cytometrianalyse av anti-CR1 immunfarging av erytrocytter som tilsvarer forsøkspersonene fra området: "medium" motiv som uttrykte MEDIUM CR1 tetthet (646 CR1/E) og "høy" motiv som uttrykte HØY CR1 tetthet (966 CR1 / E). For hvert emne: (A, E) en dot blot som viser utseendet på hendelser ervervet i henhold til størrelse og granulometry parametere,(G) porten som velger erytrocyttpopulasjonen blant hendelsene, (B, F) et histogrammet som representerer intensiteten av merkingen, (C, H) en tilhørende statistisk tabell som presenterer antall hendelser som tilsvarer erytrocytter og deres prosentandel, (D, I) en tilknyttet tabell som gir gjennomsnittlig fluorescensintensitet (RBC MFI). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Resultatene av flow cytometrianalyse av anti-CR1 immunfarging av erytrocytter som tilsvarer forsøkspersonene hvis CR1 tetthet skulle bestemmes. For hvert emne: (A, E) en dot blot som viser utseendet på hendelser ervervet i henhold til størrelse og granulometry parametere,(G) porten som velger erytrocyttpopulasjonen blant hendelsene, (B, F) et histogrammet som representerer intensiteten av merkingen, (C, H) en tilhørende statistisk tabell som presenterer antall hendelser som tilsvarer erytrocytter og deres prosentandel, (D, I) en tilknyttet tabell som gir gjennomsnittlig fluorescensintensitet (RBC MFI). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Kalibreringskurve og regresjonslinje muliggjør bestemmelse av CR1-tetthet. (A), (B) Kalibreringskurve og regresjonslinje trukket i henhold til den kjente CR1-tettheten til områdeforsøkspersonene (negativ kontroll: 0 CR1, "lavt" motiv [180 CR1/E], "medium" motiv [646 CR1/E], og "høy" motiv [966 CR1/E]) og deres respektive verdier av gjennomsnittlig fluorescensintensitet oppnådd ved flow cytometri. (C), (D) Fra ligningen av denne regresjonslinjen beregnet vi tettheten av erytrocytt CR1 for personer hvis gjennomsnittlige fluorescensintensitet ble kvantifisert ved strømningcytometri: oransje piler, Emne 1 (gjennomsnittlig fluorescensintensitet = 1334; CR1/E tetthet = 459) og emne 2 (gjennomsnittlig fluorescensintensitet = 2820; CR1/E tetthet = 1000). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Flytskjema for protokollen for å bestemme erytrocytt CR1 tetthet fra menneskelige blodprøver. Samle en menneskelig blodprøve. Vask den menneskelige blodprøven ved sentrifugering for å oppnå erytrocytter. Beis erytrocytter ved hjelp av et anti-CR1 antistoff. Bruk flow cytometri for å bestemme erytrocytt CR1 tetthet i henhold til en kalibreringskurve. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere teknikker er tilgjengelige for å bestemme tettheten av erytrocytt CR1 (CR1/E). De første teknikkene som ble brukt var agglutinering av røde blodlegemer ved anti-CR1 antistoffer31 og dannelsen av rosetter i nærvær av erytrocytter belagt med C3b32. Disse rudimentære teknikkene ble raskt erstattet av immunflekker metoder ved hjelp av radiomerkede anti-CR1 antistoffer1,33. Det er også mulig å måle konsentrasjonen av CR1 i membranekstrakter ved enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA)34. Selv om disse teknikkene er nøyaktige, gir disse teknikkene bare en gjennomsnittlig verdi av CR1/E-tettheten. Fordelingen av CR1/E tetthet over hele erytrocyttpopulasjonen er bare tilgjengelig ved strømningscytometrisk analyse etter immunfarging. Denne teknikken er vanskelig på grunn av lav tetthet av CR1 / E. Likevel gjør en forsterkningsmetode det nå mulig å enkelt måle tettheten av CR1/E30.

Her presenterer vi en metode for å kvantifisere CR1/E ved strømningscytometri basert på forsterkning av fluorescenssignalet til immunfargede celler. Forsterkningssystemet innebærer fire påfølgende lag med farging ved hjelp av det biotinyforsinkede anti-CR1 monoklonalt antistoff J3D3; phycoerythrin-streptavidin; en biotinylated geit anti-streptavidin antistoff; og igjen phycoerythrin-streptavidin. J3D3 gjenkjenner tre antigene nettsteder på CR135, men ikke mer enn én samtidig. Det biotinylated geit anti-streptavidin antistoff er en polyklonalt antistoff som gjenkjenner flere epitoper på streptavidin og gir en bedre bro mellom de to streptavidin lag enn biotin-streptavidin alene. Denne prosessen drar også nytte av det høye fluorescensutbyttet til phycoerythrin36 og det lave nivået av uspesifikk binding av streptavidin37. Med et så sterkt forsterket signal gir de lave innstillingene til cytometerfotomultiplikatorrørene perfekt linearitet. Denne metoden, som er preget av utmerket følsomhet og reproduserbarhet, muliggjør påvisning av færre enn 100 CR1 / celle.

Denne metoden krever imidlertid prøver fra tre forsøkspersoner hvis tetthet av erytrocytt CR1 er kjent: ett emne som uttrykker et lavt nivå av erytrocytt CR1 (180 CR1/E), ett emne som uttrykker et middels nivå av erytrocytt CR1 (646 CR1/E) og ett som uttrykker et høyt nivå av erytrocytt CR1 (966 CR1/E). Det er mulig å ta de første målingene av erytrocytt CR1 tetthet av flere individer, først ved hjelp av erytrocytter fra de tre fagene som brukes i vår studie, som vi kan gi. Blodprøvene fra personer i området og forsøkspersonene som skal kvantifiseres for CR1 skal trekkes samtidig, oppbevares i kjøleskapet ved 4 °C, og håndteres ved 4 °C38. Blodet trukket i EDTA rør er lett rutbar og kan lagres i 5 dager ved 4 °C, slik at tid for kvantifisering av erytrocytt CR1. Etter dette begynner tettheten av erytrocytt CR1 å redusere, og det er en kollaps av standard CR1-kurven, spesielt på det punktet som tilsvarer motivet som uttrykker et høyt nivå av erytrocytt CR1. Fordi den resulterende regresjonslinjen er forvrengt, er målet for CR1 tetthet ikke lenger nøyaktig. Det bør bemerkes at in vitro lagring, håndtering forhold, og flerlags farging føre til klynger av CR1 og en liten overvurdering av antall CR1 molekyler. Likevel, bruk av en anti-CR1 antistoff rettet mot tre epitoper som J3D3 med forsterkning ser at klynger kan utføres fullt ut, noe som muliggjør riktig måling av CR1 tetthet39.

Faktisk reduseres tettheten av CR1 / E i løpet av livet til erytrocytt40. Dette ville forklare heterogeniteten av tettheten av CR1 / E i samme person. Ifølge noen forfattere, intensiteten av katabolisme av CR1 er ikke korrelert med den første tettheten av CR1 / E41, mens for andre forfattere, jo høyere den første tettheten, jo større intensiteten av katabolisme42. Halveringstiden til CR1 på overflaten av erytrocytter er 11–32 dager42.

Metoden som presenteres her har flere fordeler. Den første er å kunne velge, takket være flyt cytometri, celleunderpopulasjoner som skal studeres i samme blodprøve. Ved å velge erytrocyttpopulasjonen ved hjelp av portfunksjonen, garanteres målingen av erytrocytttetthet utelukkende. En skjevhet i målingen av erytrocytt CR1 forårsaket av tilstedeværelsen av andre cellulære underpopulasjoner som hvite blodlegemer unngås. Den andre fordelen med denne metoden er at den er tilpasningsdyktig til kvantifisering av andre cellulære reseptorer hvis tetthet er lav ved ganske enkelt å erstatte det primære anti-CR1 antistoffet med et antistoff spesielt rettet mot et epitop av reseptoren som skal studeres. Det er også tilpasningsdyktig til å bruke 96 brønnplater i stedet for rørstativer, noe som krever lavere blod- og reagensvolumer25,,38. Den tredje fordelen med denne metoden er at den er fleksibel. I studier om celler med svært høy tetthet av CR1, for eksempel humane lymfocytter (10.000 CR1/celle), eller ikke-menneskelige primaterytrocytter hvis CR1 tetthet er 10–100x større enn for mennesker (10 000–100 000 CR1/cell)43,44, er det mulig å redusere antall forsterkningssystemlag, ved hjelp av bare biotinylated anti-CR1 monoklonalt antistoff, phycoerythrin-streptavidin eller biotinylated anti-CR1 monoklonalt antistoff, biotinylated anti-mus antistoff, og phycoerythrin-streptavidin, og dermed tilpasse fluorescensnivået til høyere tetthet av CR1. Den fjerde fordelen med denne metoden er at den kan brukes til faste eller frosne erytrocytter, slik at blodprøver kan samles inn i områder som mangler anlegg for flytcytometri og lagres for senere nøyaktig kvantifisering av CR138.

Mer generelt, med de nye lysere fluorokromene, virker det ikke lenger obligatorisk å bruke systemet for indirekte forsterkning. Dessuten finnes det andre metoder ved hjelp av flow cytometri som gjør det mulig å evaluere tettheten av cellulære reseptorer og å kvantifisere det i enheter av mål (dvs. ABC, eller antistoff bindende kapasitet). ABC per celle kan også bestemmes ved hjelp av mettende konsentrasjoner av antistoff og kalibrerte perler. Flere kommersielle systemer er tilgjengelige. Noen sett er prekalibrert standard perler som inneholder kjente nivåer av fluorokrom molekyler som PE bundet per perle. Perlene ervervet på et strømningscytometer på samme dag på samme instrumentinnstillinger som de enkelte pasientprøvene gjør det mulig å tegne en standardkurve som sammenligner det geometriske gjennomsnittet av fluorescens med kjent PE-innhold av perlene. Regresjonsanalysen, hellingen, avskjæringen og korrelasjonskoeffisienten bestemmes, og ABC-verdiene beregnes fra den målte geometriske gjennomsnittlige fluorescensen til celler ved hjelp av standardkurven45,46.

En ytterligere type perletest er basert på binding av et antistoff som er konjugert til perler med spesifikke antistoffbindingskapasitetsnivåer via den krystalliserbare delen av fragmentet (Fc). Perler er merket med samme antistoff som brukes til å merke cellene hvis antigentetthet skal måles. Dermed, i et enkelt eksperiment, kan etkonjugert antistoff brukes, så lenge det samme partiet med samme fluorofan / proteinforhold (F / P-forhold) brukes til å farge både perler og celler47. Noen sett er bedre for kvantitativ bestemmelse av celleoverflateantigener ved strømningcytometri ved hjelp av indirekte immunfluorescens analyser48,49.

Til slutt har vår metode fordelen av å gi svært sensitiv deteksjon og være lett å implementere på vanlig flyt cytometri materiale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker alle medlemmene av URCACyt, flow cytometri teknisk plattform, de ansatte ved Department of Immunology, og de ansatte ved Institutt for indremedisin og geriatriske, som bidro til å optimalisere og validere protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av Reims Universitetssykehus (stipendnummer AOL11UF9156).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook immunostaining
Blouse protection
Bovin serum albumin (7,5%) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 15260037 cytometry
Centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 11176917 centrifugation
Clean Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340345 cytometry
Comorack-96 Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 944060P rack
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 655051 cytometry
Formaldehyde solution 36.5 % Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France F8775-25ML Fixation
10 µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
LSRFORTESSA Flow Cytometer BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 647788 cytometry
Microman Capillary Pistons Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 067494 sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubes Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath MP32051 mix
Micropipette Microman - type M25 - Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 066379 sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10010031 cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mL Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 391952 sample pipetting
powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
Rinse Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340346 cytometry
Round bottom tube Sarstedt, F-70150 Marnay, France 55.1579 cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
streptavidin R-PE Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France AS-60669 immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mL Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10203001 mix
Vector anti streptavidin biotin Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France BA-0500 immunostaining
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
  3. Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
  4. Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
  5. Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
  6. Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
  7. Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
  8. Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
  9. Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
  10. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  11. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  12. Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
  13. Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
  14. Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
  15. Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
  16. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  17. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
  18. Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
  19. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
  20. Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
  21. Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
  22. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
  23. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  24. Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
  25. Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
  26. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
  27. Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
  28. Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
  29. Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
  30. Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
  31. Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
  32. Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
  33. Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
  34. Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
  35. Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
  36. Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
  37. Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
  38. Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
  39. Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
  40. Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
  41. Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
  42. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  43. Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
  44. Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
  45. Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
  46. Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
  47. Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
  48. Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
  49. Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 159 CR1 CD35 komplement C3b/C4b reseptor CR1 tetthet polymorfisme flow cytometri Alzheimers sykdom Systemisk lupus erythematosus malaria
Måle Erytrocytt Komplement reseptor 1 ved hjelp av flow cytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kisserli, A., Audonnet, S., Duret,… More

Kisserli, A., Audonnet, S., Duret, V., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Mahmoudi, R. Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e60810, doi:10.3791/60810 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter