Summary
Целью данного метода является определение плотности CR1 в эритроцитах любого предмета путем сравнения с тремя предметами, плотность которых известна плотность эритроцита CR1. Метод использует цитометрию потока после иммуностоцинирования эритроцитов испытуемых моноклональным антителом, в сочетании с усиленной системой с использованием фикоэритрина (ПЭ).
Abstract
CR1 (CD35, Дополнение Рецептор типа 1 для C3b/C4b) представляет собой большой молекулярный вес мембраны гликопротеин около 200 kDa, который контролирует дополнение активации, транспортирует иммунные комплексы, и участвует в гуморальных и клеточных иммунных реакций. CR1 присутствует на поверхности многих типов клеток, в том числе эритроцитов, и экспонаты полиморфизмов в длину, структуру (Knops, или KN, группа крови), и плотность. Средняя плотность CR1 на эритроцит (CR1/E) составляет 500 молекул на эритроцит. Эта плотность варьируется от одного человека к другому (100-1200 CR1/E) и от одного эритроцита к другому в том же человеке. Мы представляем здесь надежный метод цитометрии потока для измерения плотности CR1/E, в том числе в субъектах, выражающих низкую плотность, с помощью усиливающейся системы иммуностоинга. Этот метод позволил нам показать снижение экспрессии ЭРитроцита CR1 при таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера (АД), системная волчанка эритематоза (СКВ), СПИД или малярия.
Introduction
CR1 (дополнение рецептора типа 1, CD35) является 200 kDa трансмембранного гликопротеина присутствует на поверхности многих типов клеток, таких как эритроциты1, B лимфоцитов2, моноцитные клетки, некоторые Т-клетки, фолликулярные дендритные клетки3, фетальные астроциты4, и glomerular podocytes5. CR1 вмешиваясь в его лиганды C3b, C4b, C3bi6,,7,,8,9, подразделение первого компонента дополнения, C1q10 и MBL (манна-связывающий лектин)11 подавляет активацию дополнения и участвует в гуморальном и клеточном иммунном ответе.
У приматов, в том числе людей, эритроцит CR1 участвует в транспортировке иммунных комплексов в печень и селезенку, очищает кровь и предотвращает их накопление в уязвимых тканях, таких как кожа или почки12,13,14. Это явление иммунной адгезии между иммунными комплексами и эритроцитами зависит от количества молекул CR115. У человека средняя плотность CR1/E составляет всего 500 (т.е. 500 молекул CR1 на эритроцит). Эта плотность варьируется от одного человека к другому (100-1200 CR1/E) и от одного эритроцита к другому в том же человеке. Некоторые лица "нулевой" фенотип выразить менее 20 CR1/E16.
Плотность CR1/E регулируется двумя содоминирующими аутосомными аллелями, связанными с точечной мутацией в интронном 27 кодирования гена для CR1'117,18. Эта мутация создает дополнительный узел ограничения для фермента HindIII. Фрагменты ограничения, полученные после пищеварения с HindIII в данном случае 7,4 кб для аллеля, связанного с сильным выражением CR1 (H: high allele) и 6,9 кб для аллеля, связанного с низким выражением CR1 (L: низкий аллель). Эта связь встречается у кавказцев и азиатов, но не у людей африканского происхождения19.
Уровень экспрессии эритроцита CR1 также коррелирует с наличием точечных нуклеотидных мутаций в экзоне 13 кодирования SCR 10 (I643T) и в экзоне 19 кодирования SCR16 (981H). Он высок в гомозиготных 643I/981 "и низкий в гомозиготных 643T/981H лиц20. Таким образом, "низкие" лица выражают около 150 CR1/E, "средние" лица выражают около 500 CR1/E, а "высокие" лица выражают около 1000 CR1/E.
В дополнение к этому полиморфизму плотности эритроцита, CR1 характеризуется полиморфизмом длины, соответствующим четырем аллотипам разных размеров: CR1'1 (190 kDa), CR1'2 (220 kDa), CR1'3 (160 kDa) и CR1'4 (250 kDa)21 и антигенийский антигенныйантигенистый антигенный антигенный антиген.
Мы представляем наш метод, основанный на цитометрии потока, чтобы определить плотность CR1/E. Используя три предмета, плотность которых известна как CR1/E, выражая низкий уровень плотности (180 CR1/E), средний уровень плотности (646 CR1/E), и высокий уровень плотности (966 CR1/E), легко измерить среднюю интенсивность флуоресценции (МФИ) их эритроцитов или красных кровяных телец (РБК) Затем можно построить стандартную линию, представляющую МФО в зависимости от плотности CR1/E. Измеряя МФО субъектов, плотность CR1/E не известна, и сравнивая ее с этой стандартной линией, можно определить плотность CR1/E. Этот метод был использован в течение многих лет в лаборатории, и позволило нам обнаружить снижение экспрессии эритроцитов CR1 во многих патологиях, таких как системная волчанка эритематоза (СКВ)23, Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД)24, малярия25, и недавно болезнь Альцгеймера (AD)26,27. Разработка препаратов, нацеленных на CR1 в паре с эритроцитами, как и в случае антитромботических препаратов28 требует оценки плотности CR1/E, а также наличия надежной техники количественной оценки CR1.
Представленный протокол проходит в singlicate. Он адаптируется для определения плотности CR1/E на многих людей, использующих конкретные коммерчески доступные 96 пластин скважин (см. Таблицу Материалов). С этой целью, это легко адаптировать наш метод к любой 96 хорошо пластины. Для каждого образца на один колодец распределяется клеточная суспензия эритроцитов (0,5 х 106-1 х 106 эритроцитов). Для каждого колодца сначала добавляются первичные анти-CR1 антитела, затем стрептавидин ПЭ, вторичное антиорганизмы против стрептавидина, и снова стрептавидиновые ПЭ, использующие те же разбавления, что и наш метод, но путем адаптации объемов и соблюдения пропорциональности.
Образцы крови, взятые у субъектов диапазона и от предметов, которые должны быть количественно оценены для CR1, должны быть взяты в то же время, храниться в холодильнике при 4 градусах Цельсия и обрабатываться при 4 градусах Цельсия (на льду и/или в холодильнике).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол по сбору и обработке крови человека был рассмотрен и утвержден региональным комитетом по этике (CPP Est II), а протоколномер 2011-A00594-37. Поскольку в следующем протоколе описывается обработка человеческой крови, должны соблюдаться институциональные руководящие принципы по утилизации биоопасных материалов. Оборудование для обеспечения безопасности лабораторий, такое как лабораторные пальто и перчатки, следует носить.
1. Стила эритроцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: За день до обработки, подготовить pbS-BSA буфер с фосфатами буферного сольного раствора (PBS), содержащий 0,15% бычьего сыворотки альбумина (BSA) и поместите его в холодильник при 4 градусах Цельсия. Этот буфер будет использоваться в качестве буфера для стирки и буфера разбавления.
- Пипетка 20 мл PBS-BSA в трубку 50 мл.
- Аспират 250 л этиленденамин тетраацетическая кислота (ЭДТА) антикоагулят всю кровь из трубок для хранения крови и добавить в трубку, содержащую 20 мл PBS-BSA. Закройте трубку, завинчивая крышку. Смешайте осторожно, инвертируя трубку 2x.
- Центрифуга трубки в течение 10 минут при 4 КК при 430 х г. Удалите и отбросьте супернатант с помощью 10 мл пипетки. Отдохните гранулы в остаточном объеме супернатанта нежным и осторожным пипеткой.
- Добавьте 20 мл холодного PBS-BSA (4 кВ) в трубку, содержащую гранулы. Центрифуга трубки в течение 10 минут при 4 КК при 430 х г. Удалите и отбросьте супернатант с помощью 10 мл пипетки.
- Добавьте 20 мл холодного PBS-BSA (4 кВ) в трубку, содержащую гранулы. Центрифуга трубки в течение 10 минут при 4 КК при 430 х г. Оставьте трубку в центрифуге при 4 градусах по Цельсию и перейдите в раздел 2.
2. Разбавление эритроцитов
- Пипетка 3 мл холодной PBS-BSA в трубку 50 мл и хранить его при 4 градусах По с на стойке во льду.
- Положите центрифугедную трубку, содержащую эритроциты (шаг 1.4) на стойку, помещенную во льду.
- Пипетка 8 л гранулированных эритроцитов с помощью пипетки и добавить в трубку 50 мл, содержащую 3 мл PBS-BSA для получения разбавления эритроцита. Смешайте трубку осторожно вручную, чтобы получить однородную клеточную подвеску эритроцитов.
3. Эритроцит иммуностоина
- Пипетка 100 л эритроцитов разбавления (получено в разделе 4) и добавить к 1,4 мл труб.
- Центрифуга трубки в течение 5 мин при 4 КК при 430 х г. Во время центрифугации подготовьте разбавление биотинилапортовых анти-CR1 J3D3 антитела миочприза в концентрации 0,05 мкг/л в буфере PBS-BSA.
- Как только центрифугация будет сделана, удалите и отбросьте супернатант.
- Добавьте 20 зл биотининатированных анти-CR1 J3D3 непосредственно к грануле. Чтобы подготовить отрицательный контроль, добавьте 20 юл буфера PBS-BSA вместо. Смешайте трубки осторожно и инкубировать в течение 45 минут при 4 градусах Цельсия.
- После 45 минут инкубации добавьте в трубки 750 кЛ PBS-BSA. Центрифуга трубки в течение 5 мин при 4 КК при 430 х г. Удалите и отбросьте супернатант. Повторите.
- В то же время, подготовить 1:10 разбавления стрептавидин-фикерин разбавленной в PBS-BSA буфера. Пипетка 20 л из 1:10 разбавления стрептавидина-фикоэритрина и добавить в трубки. Смешайте трубки осторожно и инкубировать в течение 45 минут при 4 градусах Цельсия.
- Добавьте 750 кл буфера PBS-BSA в трубки. Хорошо перемешайте и центрифугу в течение 5 мин при 4 кв С при 430 х г. Удалите и отбросьте супернатант. Повторите.
- Во время центрифугации, подготовить 1:100 разбавления биотинилаповых антистрептавидина антитела разбавленной в буфере PBS-BSA.
- Как только центрифугация будет сделана, удалите и отбросьте супернатант.
- Пипетка 20 л 1:100 разбавления биотинилаповых антистрептавидина в трубки. Смешайте трубки осторожно. Инкубировать трубки в течение 45 мин при 4 градусах Цельсия.
- После 45 минут инкубации, пипетка 750 л буфера PBS-BSA и добавить в трубки. Центрифуга трубки в течение 5 мин при 4 КК при 430 х г. Удалите и отбросьте супернатант. Повторите.
- Пипетка 20 л из 1:10 разбавления стрептавидина-фикоэритрина и добавить в трубки. Смешайте трубки осторожно. Инкубировать трубки в течение 45 мин при 4 градусах Цельсия.
- Пипетка 750 л буфера PBS-BSA и добавить в трубки. Хорошо перемешать и центрифуги труб в течение 5 мин при 4 КК при 430 х г. Удалите и отбросьте супернатант. Повторите этот шаг 2x.
4. Иммуноокрашенная фиксация эритроцита
- Во время последней центрифугации, подготовить буфер фиксации, 1:100 разбавления 37% формальдегида с помощью стирального буфера PBS-BSA.
- Пипетка 450 л фиксационного буфера и добавить в иммуноокрашенные эритроцитные трубки (от шага 3.13) при вихре в течение 5 с.
- Pipette все фиксированные клетки в 5 мл круглых нижних труб и хранить в холодильнике.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь до 48 ч.
5. Анализ цитометрии потока окрашенных эритроцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется обратиться к руководству оператора для цитометра (см. Таблица материалов), чтобы знать, как выполнять цитометрические показания. Предлагаемые ниже параметры применяются к используемому инструменту и должны быть оптимизированы для каждого цитометра.
- Включите цитометр потока, затем включите компьютер. Пусть температура оптической системы стабилизируется, оставляя ее на 30 мин. Проверьте окно цитометра в программном обеспечении, чтобы убедиться, что цитометр подключен к рабочей станции (сообщение Cytometer Connected отображается).
- Убедитесь, что буферный контейнер заполнен и что контейнер для отходов пуст. Удалите пузырьки воздуха в буферном фильтре и буферной линии с помощью системы очистки. Прайм жидкости системы, нажав кнопку Prime на консоли цитометра. Подождите, пока индикатор ный свет не изменится с красного на зеленый.
- Для очистки жидкости установите трубку, содержащую 3 мл чистящего раствора, на порт для впрыска образца и дайте очистке раствора работать в течение 5 минут с высокой частотой потока образцов. Повторите это с раствором промыть дистиллированной водой. Оставьте трубку, содержащую воду, в порте для впрыска образца.
- Для подготовки калибровочных бусин, пипетка 400 л PBS в нижней части круглой нижней трубки. Смешайте запасы биса сильно вихрем для 30 s. Добавить падение в круглую нижнюю трубку, содержащую PBS. Тщательно перемешайте, загоняя 30 с.
- Выполнить проверку производительности. Откройте модуль настройки и слежения цитометра в программном обеспечении(рисунок 1A). Убедитесь, что конфигурация цитометра является правильной для эксперимента с использованием PE иммуностоинга. Убедитесь, что калибровка партии биса является правильной с конфигурацией.
- Установите трубку из биса на порт впрыска образца и дайте ей работать с низкой частотой потока образца. Выполнить проверку производительности, которая занимает около 5 минут для завершения). Как только проверка производительности завершена, убедитесь, что производительность цитометра является удовлетворительной(рисунок 1B). Закройте модуль настройки и слежения за цитометром в программном обеспечении.
- Чтобы настроить эксперимент и создать настройки приложения, нажмите кнопку New Experiment на панели инструментов браузера и откройте новый эксперимент. Укажите параметры, выбрав соответствующие настройки цитометра: Forward Scatter (FSC), Side Scatter (SSC) и PE из выпадающего меню эксперимента(рисунок 1C). Выберите линейный режим для параметра FSC и режим Logarithm для параметров SSC и PE.
- В открытом эксперименте выберите настройки цитометра (рисунок 1D),затем выберите настройки приложенияи создайте глобальную таблицу(рисунок 1E). Используйте серые коробки и перекрестия для руководства оптимизации.
- Загрузите неокрашенную трубку управления на цитометр и запустите Приобретение. Убедитесь, что население, представляющие интерес (т.е. РБК) находится в масштабе за счет оптимизации напряжения FSC и SSC. Оптимизация порогового значения FSC для ликвидации мусора, не мешая населению, интересуемому.
- Нарисуйте ворота вокруг РБК на участке FSC против SSC. Отображение популяции РБК в точечном участке фторесценции PE. При необходимости увеличьте флуоресценцию напряжения фотомультипликаторной трубки (PMT), чтобы поместить отрицательную популяцию в серые ящики. Выгрузите неокрашенную контрольную трубку от цитометра.
- Убедитесь, что положительные популяции находятся в масштабе. Загрузите окрашенные трубки управления на цитометр и запустить Приобретение. Снижение напряжения PMT для положительной популяции, если оно зашкаливало до тех пор, пока положительное население не будет видно полностью в масштабе. Затем выгрузите окрашенный образец.
- Для записи и анализа образцов на новом глобальном листе создайте следующие участки для просмотра данных: 1) FSC против SSC и 2) гистограмма ФЛуоресценции PE. Загрузите первый образец на цитометр и запустите Приобретение.
- Нарисуйте ворота РБК вокруг эритроцитов на участке FSC против SSC. Отображение популяции РБК в гистограмме флуоресценции PE. В представлении Статистика выберите среднее для параметров ФЛуоресценции PE на популяциях GR(рисунок 1F).
- В панели мониторинга приобретения выберите все события в остановке ворот и 10 000 событий для записи(рисунок 1G). Нажмите данные записи. Когда запись события будет завершена, удалите первую трубку из цитометра. Глобальные участки листа должны выглядеть как на рисунке 2.
- Загрузите следующие образцы и запишите их.
6. Определение плотности эритроцита CR1
- Возьмем значения средней интенсивности флуоресценции образцов, соответствующих "низкой" теме(рисунок 3, таблица I,МФО РБК), "средний" предмет(рисунок 4, таблица D,МФО РБК), "высокий" предмет(рисунок 4, таблица I,МФО РБК) и отрицательный контрольный образец(рисунок 3, таблица I,МФО РБК).
- На графике, представляющем среднюю интенсивность флуоресценции как функции плотности CR1, поместите четыре точки, соответствующие отрицательному контролю, "низкий" предмет, "средний" предмет и "высокий" предмет (синие точки, рисунок 6).
- Нарисуйте линию регрессии, чтобы получить линию калибровки и ее уравнение.
- Возьмем значения средней интенсивности флуоресценции образцов, соответствующих предметам, плотность которых должна быть определена. (Рисунок 5, Таблицы D и i,МФО РБК).
- Получить уравнение, заменив "Y" с использованием значений средней интенсивности флуоресценции, и вычислить плотность CR1/E (Рисунок 6).
- Проверьте на графике, что средние значения интенсивности флуоресценции и определяется CR1 /E плотность соответствуют точке на линии калибровки (Рисунок 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эритроциты трех субъектов, плотность которых CR1 известна ("низкий" предмет (180 CR1/E), "средний" предмет No646 CR1/E и "высокий" предмет No 966 CR1/E), а также двух субъектов, плотность CR1 которых должна была быть определена иммунопрепаратами, примыкающих к флюторной системе. В начале плотность CR1 испытуемых из низкого высокого диапазона была определена методом Scatchard29 с использованием радиомаркированных антител. Определенные стандарты (низкие, средние и высокие) использовались для кривой калибровки и позволили количественно осудить новые стандарты или некачественные стандарты нашим методом цитометрии30. После прохождения иммуноокрашенных эритроцитов в цитометре потока наблюдалась и измерялась интенсивность маркировки как средняя интенсивность флуоресценции по каждому предмету (РБК МФО)(рисунок 3F,I; Рисунок 4B,D,F,Я; Рисунок 5B,D,F,I). Кривая была построена с использованием значений субъектов с известной плотностью эритроцита CR1 ("низкий" до "высокого"), сообщая о них в качестве функции средней интенсивности флуоресценции. Сравнение регрессионной линии, полученной в результате этой кривой, с значениями средней интенсивности флуоресценции других субъектов, определив их плотность CR1/E(рисунок 6). На рисунке 7 показан общий рабочий процесс.
Рисунок 1: Консоль цитометра и окна, появляющиеся во время протокола цитометрии потока. (A)Окно появляется после применения шага 5.5 протокола. (B) Окно появляется после применения шага 5.6 протокола. (C)Окно появляется после применения шага 5.7 протокола. (D) Окно появляется после применения шага 5.8 протокола. (E) Окно появляется после применения шага 5.8 протокола. (F)Окно появляется после применения шага 5.13 протокола. (G)Окно появляется после применения шага 5.14 протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Появление глобальных объектов анализа листа. Появление объектов глобального анализа листа после применения шага 5.14 протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Результаты анализа цитометрии потока иммуностоинга эритроцитов, соответствующих отрицательному контролю, и субъекту из диапазона ("низкий" субъект), который выразил LOW CR1 плотность (180 CR1/E). Для каждого предмета: (A,E) точка пятно, показывающее внешний вид событий, приобретенных в соответствии с размером и параметрым гранулеметрии, (G) ворота выбора эритроцитов населения среди событий, (B,F) гистограмма, представляющая интенсивность маркировки, (C,H) связанные статистической таблицы, представляющие количество событий, соответствующих эритроцитов и их процент, (D,I) ассоциированная таблица дает средняя интенсивность флуоресценции (РБК МФИ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Результаты анализа цитометрии потока анти-CR1 иммуностоинга эритроцитов, соответствующих предметам из диапазона: "средний" субъект, который выразил плотность MEDIUM CR1 (646 CR1/E) и "высокий" субъект, который выразил HIGH CR1 плотность (966 CR1/E). Для каждого предмета: (A, E) точка пятно, показывающее внешний вид событий, приобретенных в соответствии с размером и параметрым гранулеметрии, (G) ворота выбора эритроцитов населения среди событий, (B, F) гистограмма, представляющая интенсивность маркировки, (C, H) связанные статистической таблицы, представляющие количество событий, соответствующих эритроцитов и их процент, (D, I) ассоциированная таблица дает средняя интенсивность флуоресценции (РБК МФИ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Результаты анализа цитометрии потока иммуностоинга эритроцитов, соответствующих субъектам, плотность CR1 которых должна была быть определена. Для каждого предмета: (A, E) точка пятно, показывающее внешний вид событий, приобретенных в соответствии с размером и параметрым гранулеметрии, (G) ворота выбора эритроцитов населения среди событий, (B, F) гистограмма, представляющая интенсивность маркировки, (C, H) связанные статистической таблицы, представляющие количество событий, соответствующих эритроцитов и их процент, (D, I) ассоциированная таблица дает средняя интенсивность флуоресценции (РБК МФИ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: кривая калибровки и линия регрессии, позволяющая определить плотность CR1. (A), (B) Кривая калибровки и регрессионная линия, нарисованная в соответствии с известной плотностью CR1 объектов диапазона (отрицательный контроль: 0 CR1, "низкий" предмет No 180 CR1/E, "средний" предмет No646 CR1/E, и "высокий" предмет No966 CR1/E) и их соответствующие значения средней флуоресцентной интенсивности, полученные цифотр. (C), (D) Из уравнения этой регрессионной линии, мы вычислили плотность эритроцита CR1 для субъектов, средняя интенсивность флуоресценции была количественно циклометрии потока: оранжевые стрелки, Тема 1 (средняя интенсивность флуоресценции - 1,334; Плотность CR1/E No 459) и Субъект 2 (средняя интенсивность флуоресценции No 2820; Плотность CR1/E - 1000). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Flowchart протокола для определения плотности эритроцита CR1 из образцов крови человека. Соберите образец крови человека. Вымойте образец крови человека центрифугией для получения эритроцитов. Пятно эритроцитов с помощью анти-CR1 антитела. Используйте цитометрию потока, чтобы определить плотность эритроцита CR1 в соответствии с кривой калибровки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несколько методов доступны для определения плотности эритроцита CR1 (CR1/E). Первыми методами были агглютинация красных кровяных телец анти-CR1 антител31 и образование розетов в присутствии эритроцитов, покрытых C3b32. Эти рудиментарные методы были быстро заменены иммуностоинга методы с использованием радиомаркировки анти-CR1 антител1,33. Также можно измерить концентрацию CR1 в мембранных экстрактах с помощью ферментно-связанного иммуносорбента (ELISA)34. Хотя эти методы являются точными, они обеспечивают только среднее значение плотности CR1/E. Распределение плотности CR1/E по всей популяции эритроцитов доступно только при цитометрическом анализе потока после иммуностоинга. Этот метод является сложным из-за низкой плотности CR1/E. Тем не менее, метод усиления теперь позволяет легко измерить плотность CR1/E30.
Здесь мы представляем метод количественной оценки CR1/E по цитометрии потока на основе усиления флуоресценционного сигнала иммуноокрашенных клеток. Система усиления включает в себя четыре последовательных слоя окрашивания с использованием биотинилапопроментированного моноклонального антиклонального антитела J3D3; phycoerythrin-streptavidin; биоинтинилатированный коза антистрептавидин антитела; и снова фикоэррин-стрептавидин. J3D3 распознает три антигенных участка на CR135,хотя и не более одного одновременно. Биотинилаповые козы антистрептавидиновые антитела является поликлональным антителом, которое распознает несколько эпитопов на стрептавидине и обеспечивает лучший мост между двумя стрептавидинами, чем только биотин-стрептавидин. Этот процесс также выигрывает от высокой урожайности флуоресценции фикерин36 и низкого уровня неспецифического связывания стрептавидина37. При таком сильном усиленном сигнале низкие настройки цитометра фотомультипликаторных труб обеспечивают идеальную линейность. Этот метод, который характеризуется отличной чувствительностью и воспроизводимостью, позволяет обнаружить менее 100 CR1/cell.
Тем не менее, этот метод требует образцов из трех субъектов, плотность эритроцита CR1 известно: один предмет, выражающий низкий уровень эритроцита CR1 (180 CR1/E), один предмет, выражающий средний уровень эритроцита CR1 (646 CR1/E) и один предмет, выражающий высокий уровень эритроцита CR1 (9661/E). Можно провести первые измерения плотности эритроцита CR1 нескольких особей, первоначально используя эритроциты из трех испытуемых, используемых в нашем исследовании, которые мы можем предоставить. Образцы крови из субъектов диапазона и субъектов, которые будут количественно для CR1 должны быть взяты в то же время, хранится в холодильнике при 4 c, и обрабатываются при 4 C38. Кровь, нарисованная в трубках ЭДТА, легко проникает в промысел и может храниться в течение 5 дней при 4 градусах Цельсия, что позволяет провести количественную оценку эритроцита CR1. После этого плотность эритроцита CR1 начинает уменьшаться, и происходит обвал стандартной кривой CR1, особенно в точке, соответствующей предмету, выражающей высокий уровень эритроцита CR1. Поскольку полученная линия регрессии искажена, измерение плотности CR1 больше не является точным. Следует отметить, что хранение в пробирке, условия обработки и многослойное окрашивание приводят к кластеризации CR1 и небольшому завышению количества молекул CR1. Тем не менее, использование анти-CR1 антитела ориентации трех эпитопов, таких как J3D3 с системой усиления позволяет кластеризации, чтобы быть полностью выполнены, что позволяет правильное измерение плотности CR139.
В самом деле, плотность CR1/E уменьшается в течение срока службы эритроцита40. Это объясняет неоднородность плотности CR1/E в одном и том же человеке. По мнению некоторых авторов, интенсивность катаболизма CR1 не коррелирует с начальной плотностью CR1/E41, в то время как для других авторов, чем выше начальная плотность, тем больше интенсивность катаболизма42. Период полураспада CR1 на поверхности эритроцитов составляет 11-32 дней42.
Представленный здесь метод имеет ряд преимуществ. Во-первых, чтобы иметь возможность выбрать, благодаря цитометрии потока, клеточные субпопуляции, которые будут изучены в рамках одного образца крови. Выбирая популяцию эритроцитов с помощью функции ворот, измерение плотности эритроцитов гарантируется исключительно. Уклон в измерении эритроцита CR1, вызванный наличием других клеточных субпопуляций, таких как белые кровяные тельца, избегается. Вторым преимуществом этого метода является то, что он адаптируется к количественной оценке других клеточных рецепторов, плотность которых низкая, просто заменив первичное анти-CR1 антитело антителом, специально направленным против эпитопа рецептора, который необходимо изучить. Он также адаптируется к использованию 96 хорошо пластин вместо трубчатых стеллажей, что требует более низкой крови и реагентов объемы25,38. Третьим преимуществом этого метода является то, что он является гибким. В исследованиях, касающихся клеток с очень высокой плотностью CR1, например, лимфоцитов человека (10 000 CR1/cell), или нечеловеческих эритроцитов приматов, плотность CR1 которых в 10-100 раз больше, чем у человека (10 000-100 000 CR1/cell)43,44, можно уменьшить количество усилителей системы, можно уменьшить количество усиливающихся системы, можно уменьшить количество усиливающихся систем, усиливающихся системы, используя только биоинтинилабельные анти-CR1 моноклональные антитела, phycoerythrin-streptavidin или биотинилапоированные анти-CR1 моноклональные антитела, биотинилаповые анти-мыши антитела, и phycoerythrin-streptavidin, таким образом адаптируя уровень флуоресценции к более высокой плотности CR1. Четвертое преимущество этого метода заключается в том, что он может быть использован для фиксированных или замороженных эритроцитов, что позволяет образцы крови, которые будут собраны в районах, не хватает средств для цитометрии потока и храниться для последующей точной количественной оценки CR138.
В более общем плане, с новыми более яркими флюорохромами, это уже не кажется обязательным использовать систему косвенного усиления. Кроме того, существуют и другие методы использования цитометрии потока, которые позволяют оценить плотность клеточных рецепторов и количественно оценить их в единицах измерения (т.е. ABC, или способность связывания антител). ABC на клетку также может быть определена с помощью насыщающих концентраций антител и откалиброванных бусин. Доступно несколько коммерческих систем. Некоторые комплекты являются предварительно калиброванные стандартные бусы, содержащие известные уровни молекул фторхрома, таких как PE связаны на шарик. Бусы, приобретенные на китометре потока в тот же день в тех же настройках прибора, что и отдельные образцы пациента, позволяют нарисовать стандартную кривую, сравнивая геометрическое среднее флуоресценции с известным содержанием PE бисера. Определяется регрессионный анализ, наклон, перехват и коэффициент корреляции, а значения ABC рассчитываются по измеренной геометрической средней флуоресценции клеток с использованием стандартной кривой45,46.
Дальнейший тип теста шарика основан на связывании антитела, спряженный к бисеру с конкретными уровнями связывания антител через кристаллизованную часть фрагмента (Fc). Бисер помечены теми же антителами, используемыми для обозначения клеток, плотность антигена которых должна быть измерена. Таким образом, в одном эксперименте, любое спряжение антитела могут быть использованы, до тех пор, как та же партия с тем же соотношением фторофора / белка (F / P соотношение) используется для пятнища как бисер и клетки47. Некоторые комплекты лучше для количественного определения поверхностных антигенов клеток по цитометрии потока с использованием косвенных иммунофлуоресцентных анализов48,49.
В заключение, наш метод имеет то преимущество, что обеспечивает очень чувствительное обнаружение и легко реализовать на обычном потоке цитометрии материала.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Благодарим всех членов URCACyt, тет-цитометрии технической платформы, сотрудников кафедры иммунологии, а также сотрудников кафедры внутренней медицины и гериатрии, которые внесли свой вклад в оптимизацию и проверку протокола. Эта работа финансировалась больницами Университета Реймса (грант AOL11UF9156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| 1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
| Blouse | protection | ||
| Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
| Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
| Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
| 10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
| Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
| Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman - type M25 - | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
| Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
| powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
| Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
| Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
References
- Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
- Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
- Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
- Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
- Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
- Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
- Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
- Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
- Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
- Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
- Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
- Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
- Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
- Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
- Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
- Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
- Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
- Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
- Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
- Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
- Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
- Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
- Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
- Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
- Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
- Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
- Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
- Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
- Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
- Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
- Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
- Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
- Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
- Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
- Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
- Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
- Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
- Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
- Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
- Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
- Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
- Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
- Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
- Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
- Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).
